CN104016745B - 微生物有机肥及其制备方法 - Google Patents
微生物有机肥及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104016745B CN104016745B CN201410262147.8A CN201410262147A CN104016745B CN 104016745 B CN104016745 B CN 104016745B CN 201410262147 A CN201410262147 A CN 201410262147A CN 104016745 B CN104016745 B CN 104016745B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- organic fertilizer
- microbial organic
- subtilis
- wormwood artemisia
- reed wormwood
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 239000003895 organic fertilizer Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 28
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 10
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 14
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 claims description 8
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 7
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 7
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000008399 tap water Substances 0.000 claims description 7
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 claims description 7
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002361 compost Substances 0.000 claims description 6
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 241000726221 Gemma Species 0.000 claims description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 claims description 3
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims description 3
- 239000010903 husk Substances 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000010815 organic waste Substances 0.000 claims description 2
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 abstract description 61
- 238000009335 monocropping Methods 0.000 abstract description 27
- 239000002689 soil Substances 0.000 abstract description 27
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 abstract description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 240000001851 Artemisia dracunculus Species 0.000 abstract 6
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 abstract 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 abstract 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 abstract 1
- 240000006891 Artemisia vulgaris Species 0.000 description 61
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 241000221775 Hypocreales Species 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 244000030166 artemisia Species 0.000 description 3
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 235000010894 Artemisia argyi Nutrition 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IICCLYANAQEHCI-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrachloro-3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodospiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound O1C(=O)C(C(=C(Cl)C(Cl)=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 IICCLYANAQEHCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 235000003826 Artemisia Nutrition 0.000 description 1
- 235000003261 Artemisia vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 240000006122 Chenopodium album Species 0.000 description 1
- 235000009344 Chenopodium album Nutrition 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- -1 D-wood sugar Chemical compound 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L Malonate Chemical compound [O-]C(=O)CC([O-])=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000813090 Rhizoctonia solani Species 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000009052 artemisia Nutrition 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000003967 crop rotation Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 229930187593 rose bengal Natural products 0.000 description 1
- 229940081623 rose bengal Drugs 0.000 description 1
- STRXNPAVPKGJQR-UHFFFAOYSA-N rose bengal A Natural products O1C(=O)C(C(=CC=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 STRXNPAVPKGJQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
- Y02W30/00—Technologies for solid waste management
- Y02W30/40—Bio-organic fraction processing; Production of fertilisers from the organic fraction of waste or refuse
Landscapes
- Fertilizers (AREA)
Abstract
本发明公开了一种微生物有机肥及其制备方法，利用枯草芽孢杆菌固体发酵农业有机固体废弃物，生产防除芦蒿连作障碍的微生物有机肥。该微生物有机肥中功能微生物数量≥2×108？cfu?g-1，含水量小于30%，有机质含量大于30%。该微生物有机肥能够加速芦蒿残茬的分解、抑制土壤病原菌的增生、加速作物生长，降低芦蒿连作障碍的危害。试验表明，连作障碍土壤施用该生物有机肥后，芦蒿发病率降低了91%，芦蒿产量增加3.3倍；该微生物有机肥能够很好的防除芦蒿的连作障碍。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物有机肥及其制备方法，属于微生物技术领域。
背景技术
连作是指在同一块地里连续两茬以上种植同种或同科作物。随着集约化农业的加强，种植业呈现单一作物大面积、高强度连续种植，这就导致了即使在正常的栽培管理措施下，连作的植物也会出现植株长势变弱，发病率增加，产品产量和质量均下降，这种现象被称为连作障碍。
芦蒿（Artemisia selengensTurcz.）又名萎蒿、藜蒿、水蒿、柳蒿、香艾、狭叶艾，为菊科蒿属多年生草本植物。芦蒿茎杆供食用，清香、鲜美，脆嫩爽口，营养丰富，是冬春中国江南一些市场供应的主要野菜品种之一。
近十年间，芦蒿田头批发价格在1-10元/斤，高的时候甚至可以达到每斤20元左右，亩产值一般在8000元左右，是农业创收的重要经济作物之一。部分乡镇为了增加农民收入，蔬菜进行片区化生产，芦蒿种植面积高达占当地耕地面积的60%左右。芦蒿长期连作，造成芦蒿土传病害严重，如果芦蒿生长季节赶上环境温度、湿度非常适合特定种类病原微生物生长，极易造成芦蒿大面积的发病死亡，给种植户造成很大的损失。
植物的连作障碍主要因为：①土壤病原微生物累积量增加导致植物病害容易爆发，②土壤盐渍化、土壤养分不均衡、植物自毒作用等导致作物抗逆性变差，容易受到病原微生物的侵害。因此，连作的作物容易大面积的爆发传染性的土传病害。
随着社会发展，对食品安全的要求越来越高，土壤病原微生物的控制最环保的方法是采用生物防除的办法，采用生物防除微生物菌株抑制病害微生物感染，诱导植物产生抗病性，高效无公害，具有十分广阔的应用前景。
迄今为止，没有发现涉及本发明主题的文献报道。
发明内容
目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种微生物有机肥，能够防除芦蒿连作障碍的微生物有机肥，该微生物有机肥中的功能微生物菌株以芦蒿连作土壤中镰刀菌、立枯丝核菌等为目标病原菌分离得到，能够高效的抑制土壤中的芦蒿病原微生物，同时诱导植物产生抗病性，有效防除芦蒿连作障碍对芦蒿产业的危害。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种微生物有机肥，其特征在于：所述微生物有机肥通过枯草芽孢杆菌农业固体有机废弃物生产，产品有效菌落形成单位（cfu）≥2×108 cfu•g-1，含水量<30%。
所述枯草芽孢杆菌D9（Bacillus subtilis D9）2014年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏号为CGMCC NO.9170，简称为枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170。
所述的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170的主要生物学特性为：菌落为白色、边缘不整齐、表面干燥不透明，革兰氏染色阳性，具运动性，通过电镜观察，杆状，芽孢中生，两端钝圆。
所述的微生物有机肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基，制得枯草芽孢杆菌发酵液；其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5-7.2，培养温度35-37℃，溶氧通气量范围为30～100％，120-180rpm，发酵18h，发酵液中芽孢数量≥2×108cfu•ml-1；
2）将枯草芽孢杆菌发酵液按照10%比例接种到固体发酵培养基，发酵温度为37℃，发酵培养时间为5天，发酵过程中每10-20h翻动一次；发酵结束后固型物通过粉碎机粉碎过10目筛子，获得枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170的固体发酵菌种；
3）枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170固体发酵菌种按照5-8%质量比彻底和猪粪或者牛粪腐熟的堆肥的混合，后熟温度20-35℃，每7天翻堆一次，堆置12-25天；后熟结束，微生物有机肥含水量低于30%，有机质＞30%，包装即得微生物有机肥。
所述的微生物有机肥的制备方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌D9的液体发酵培养基配制方法为：葡萄糖3.5g、玉米淀粉8.5g、黄豆粕25g、碳酸钙3g、硫酸铵1g、硫酸锰0.2g、磷酸二氢钾0.35g、硫酸镁0.2g，自来水1000ml，115℃灭菌0.5h。
所述的微生物有机肥的制备方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌D9的固体发酵培养基的配置方法为：将麸皮80g、稻壳10g、玉米粉5g、豆饼粉5g、硫酸铵0.8g、硫酸镁0.3g、硫酸锰0.1g彻底混合，按照1：1.2的比例添加自来水，121℃灭菌30min。
步骤3）中猪粪或者牛粪腐熟的堆肥的绿豆发芽率＞98%，蛔虫卵死亡率>95%，粪大肠杆菌数量<100个/g。
有益效果：本发明提供的微生物有机肥，通过具有抑制生物防除芦蒿连作土壤中病原微生物功能和诱导植物抗性的功能的枯草芽孢杆菌菌株，采用一定的生产工艺，生产的微生物有机肥，本发明的微生物有机肥与目前市场上的产品相比具有如下优点：1）该微生物有机肥中的功能微生物菌株能够抑制土壤病原微生物，同时也能够诱导植物长生抗性。2）芦蒿连作土壤施用本品100-300kg/亩，连作土壤种植的芦蒿发病率降低5-80%，产量增加10-85%。3）由于微生物有机肥是生物菌株通过一定的工艺生产，完全没有化学杀菌剂使用所带来的一系列问题，有利于芦蒿安全生产。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌D9对镰刀菌的拮抗作用；
图2为枯草芽孢杆菌D9对立枯丝核菌的拮抗作用；
图3为本发明微生物有机肥的产量对比实验；
图4为不同处理对芦蒿连作地秸秆分解效果；
图5为不同处理对芦蒿发病率的影响；
图6为不同处理对芦蒿产量的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
（一）功能微生物菌株的获取
在芦蒿连作田块，选择发病率较重田块中生长最好的植株，采集该植物根际土壤，低温保存，采用马丁氏培养基分离真菌，牛肉膏蛋白胨培养基分离细菌，高氏一号培养基分离放线菌。
上述马丁氏培养基配制方法为（以配制1L培养基为例）：蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH2PO4
1g，MgSO4 0.5g，琼脂20g，水1000ml，pH自然，1%孟加拉红水溶液3.3ml，115℃灭菌30分钟，临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml。上述牛肉膏蛋白胨培养基配制方法为（以配制1L培养基为例）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH=7.2，自来水1000ml，121℃灭菌20分钟。上述高氏一号培养基的配制方法为（以配制1L培养基为例）：可溶性淀粉20g、KNO31g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、NaCl0.5g、FeSO40.01g、pH值自然，配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少量水中加热，使淀粉溶解，然后加入其它成分，补足水分至1000ml，121℃灭菌20min。
分离出来的菌株用PDA培养基进一步扩大培养。真菌培养条件为：25℃，培养4天。放线菌用高氏一号的培养条件为：33℃，培养48h。细菌的培养条件为：35℃，培养18h。上述PDA培养基的配置方法为（以配制1L培养基为例）：取200g洗净去皮的马铃薯切成小块，沸水煮20分钟，用2层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，水分补充至1000ml，20g琼脂，115℃灭菌30min。
以芦蒿连作土壤中立枯丝核菌和镰刀菌作为生物防除的目标菌株，采用平皿对峙培养，能够显著抑制立枯丝核菌和镰刀菌微生物菌株选择备用。
采用滤纸培养基进一步测定分离出来的菌株，纤维素酶活性最高的菌株选择留用。上述滤纸培养基配方为：(NH4)2SO4
1g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.7g，NaCl 0.5g，琼脂20g，纯净水 1000ml ，滤纸条1片。
从健康芦蒿根际分离出来的、能够抑制立枯丝核菌和镰刀菌菌株（抑制效果如图1和图2所示），并且能够高效分解纤维素和芦蒿秸秆残茬的菌株D9，经鉴定属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），主要生物学特征为：菌落为白色、边缘不整齐、表面干燥不透明，革兰氏染色阳性，具运动性，通过电镜观察，菌体杆状，芽孢中生，两端钝圆。生理生化测试显示，接触酶阳性，氧化酶阴性，V-P反应阳性，能利用甘露醇、麦芽糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、柠檬酸盐，能还原硝酸盐成亚硝酸盐，不能利用丙二酸盐。能水解淀粉、明胶和酪素。16SrRNA序列进化分析显示该菌株和枯草芽孢杆菌相似度为99%。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏号为CGMCC NO.9170，简称为枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170。
（二）微生物有机肥的生产
1）将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170接种到液体发酵培养基，其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5-7.2，培养温度35-37℃，溶氧通气量范围为30～100％，120-180rpm，发酵18h，发酵液中芽孢数量≥2×108cfu•ml-1；枯草芽孢杆菌液体发酵液配方为：葡萄糖3.5g、玉米淀粉8.5g、黄豆粕25g、碳酸钙3g、硫酸铵1g、硫酸锰0.2g、磷酸二氢钾0.35g、硫酸镁0.2g，自来水1000ml，115℃灭菌0.5h。
2）将麸皮80g、稻壳10g、玉米粉5g、豆饼粉5g、硫酸铵0.8g、硫酸镁0.3g、硫酸锰0.1g彻底混合，按照1：1.2的比例添加自来水，121℃灭菌30分钟，制成枯草芽孢杆菌的固体发酵培养基。将步骤1）枯草芽孢杆菌发酵液按照10%比例接种到固体发酵培养基，发酵温度为37℃，发酵培养时间为5天，发酵过程中每10-20h翻动一次。发酵结束后固型物通过粉碎机粉碎过10目筛子，获得枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170的固体菌剂。
3）将步骤2）枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170固体发酵菌种按照5-8%质量比彻底和猪粪或者牛粪腐熟的堆肥的混合，后熟温度20-35℃，每7天翻堆一次，堆置12-25天。后熟结束，微生物有机肥含水量低于30%，有机质＞30%，包装出厂即为具有防除芦蒿连作障碍的微生物有机肥。
4）步骤3）中的猪粪或者牛粪堆肥的绿豆发芽率＞98%，蛔虫卵死亡率>95%，粪大肠杆菌数量<100个/g。
（三）生物防除芦蒿连作病害的试验
试验1.
土壤来源轮作大棚，土壤连续种植芦蒿6年，然后改种1季胡萝卜、1季大豆和1季玉米，连作障碍最严重时候，芦蒿发病率为77%。
试验设置2个处理，分别为：
对照处理，土壤不使用微生物有机肥；
微生物有机肥处理，土壤施用微生物有机肥3g/kg土壤；
种植品种为碎叶蒿，盆钵直径28cm，高23cm，装土壤10kg，土壤施用100g猪粪堆肥，1.5g尿素，温室温度23-35℃，湿度60-100%。
芦蒿移栽60天后收割，翻动土壤，芦蒿残茬（土壤中的根、落叶和秸秆等）翻入土壤，作为种植芦蒿一茬。
在相同的处理盆钵中再一次移栽芦蒿，作为连作芦蒿。每茬芦蒿的管理措施相同。
芦蒿的产量如图3所示，对照处理第2茬芦蒿产量和第1茬芦蒿的产量之间没有显著的差异（p>0.05），但是第3茬芦蒿的产量明显的低于第1茬芦蒿的产量（p>0.05），芦蒿表现出严重的连作障碍。施用微生物有机肥处理，3茬芦蒿产量之间没有显著差异（p>0.05）。说明微生物有机肥能够有效缓解芦蒿连作障碍的危害。
芦蒿种植3茬后，测定不同处理的第3茬芦蒿的发病率显示如图4，对照处理芦蒿发病率达15%，而微生物有机肥处理的芦蒿只有零星的发病，发病率低于1%。微生物有机肥能够有效的降低芦蒿连作过程中的病害的发生。
试验2.
土壤为种植芦蒿5年大棚土壤，上一季冬春芦蒿发病率低于3%，伏秋芦蒿发病率60%，减产80%。
处理1，对照处理，土壤不使用微生物有机肥；
处理2，微生物有机肥处理，土壤施用微生物有机肥200kg/亩；
处理3，多菌灵处理，50%可湿性粉剂1000倍液，每隔30天喷施一次。
种植品种为碎叶蒿，小区面积100平方米。5月初，在留种田块挖取植株移栽到试验大棚，行距30厘米，株距30厘米，每穴栽种2株，栽后踏紧，浇透水。施用有机肥1000kg/亩作为基肥，追施25kg尿素。
芦蒿累积的发病率如图5所示，对照处理发病率71%，施用微生物有机肥处理和施用多菌灵处理分别为6%和13%，均显著低于对照处理（p>0.05），多菌灵处理和微生物有机肥处理之间没有显著差异（p>0.05）。微生物有机肥能够显著抑制连作芦蒿的病害的发生。芦蒿产量分如图6所示，对照处理的芦蒿产量最低，微生物有机肥处理产量最高，相对于对照处理，微生物有机肥能够显著地增加芦蒿的产量，增产3.3倍。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种微生物有机肥，其特征在于：所述微生物有机肥通过保藏号为CGMCC
NO.9170的枯草芽孢杆菌D9对农业固体有机废弃物生产，产品有效菌落形成单位（cfu）≥2×108 cfu•g-1，含水量<30%；所述枯草芽孢杆菌D9（Bacillus subtilis D9）2014年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏号为CGMCC NO.9170，简称为枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170；
所述的微生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
1）将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基，制得枯草芽孢杆菌发酵液；其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5-7.2，培养温度35-37℃，溶氧通气量范围为30～100％，120-180rpm，发酵18h，发酵液中芽孢数量≥2×108cfu•ml-1；
2）将枯草芽孢杆菌发酵液按照10%比例接种到固体发酵培养基，发酵温度为37℃，发酵培养时间为5天，发酵过程中每10-20h翻动一次；发酵结束后固型物通过粉碎机粉碎过10目筛子，获得枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170的固体发酵菌种；
3）枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170固体发酵菌种按照5-8%质量比彻底和猪粪或者牛粪腐熟的堆肥的混合，后熟温度20-35℃，每7天翻堆一次，堆置12-25天；后熟结束，微生物有机肥含水量低于30%，有机质＞30%，包装即得微生物有机肥。
2.根据权利要求1所述的微生物有机肥，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170的主要生物学特性为：菌落为白色、边缘不整齐、表面干燥不透明，革兰氏染色阳性，具运动性，通过电镜观察，杆状，芽孢中生，两端钝圆。
3.根据权利要求1所述的微生物有机肥，其特征在于：枯草芽孢杆菌D9的液体发酵培养基配制方法为：葡萄糖3.5g、玉米淀粉8.5g、黄豆粕25g、碳酸钙3g、硫酸铵1g、硫酸锰0.2g、磷酸二氢钾0.35g、硫酸镁0.2g，自来水1000ml，115℃灭菌0.5h。
4.根据权利要求1所述的微生物有机肥，其特征在于：枯草芽孢杆菌D9的固体发酵培养基的配置方法为：将麸皮80g、稻壳10g、玉米粉5g、豆饼粉5g、硫酸铵0.8g、硫酸镁0.3g、硫酸锰0.1g彻底混合，按照1：1.2的比例添加自来水，121℃灭菌30min。
5.根据权利要求1所述的微生物有机肥，其特征在于：步骤3）中猪粪或者牛粪腐熟的堆肥的绿豆发芽率＞98%，蛔虫卵死亡率>95%，粪大肠杆菌数量<100个/g。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410262147.8A CN104016745B (zh) | 2014-06-12 | 2014-06-12 | 微生物有机肥及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410262147.8A CN104016745B (zh) | 2014-06-12 | 2014-06-12 | 微生物有机肥及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104016745A CN104016745A (zh) | 2014-09-03 |
| CN104016745B true CN104016745B (zh) | 2016-03-23 |
Family
ID=51433803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410262147.8A Expired - Fee Related CN104016745B (zh) | 2014-06-12 | 2014-06-12 | 微生物有机肥及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104016745B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104630107B (zh) * | 2015-02-04 | 2017-12-22 | 浙江大学 | 一种生物防治抗白刺茎腐病及促生的方法 |
| CN104877927B (zh) * | 2015-03-18 | 2017-11-03 | 河海大学 | 一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂及其在防除连作障碍中的应用 |
| CN104961597A (zh) * | 2015-08-04 | 2015-10-07 | 镇江贝思特有机活性肥料有限公司 | 一种芦蒿专用有机无机复混肥料 |
| CN108728103A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-11-02 | 仁维国际股份有限公司 | 土壤生物素的提取方法 |
| CN109135754A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-01-04 | 孙爱友 | 一种针对农用土壤的微生物原位培养方法 |
| CN111406546B (zh) * | 2020-03-13 | 2021-03-19 | 河海大学 | 一种生态护坡预制块及其制备方法和应用 |
| KR20230039664A (ko) * | 2020-07-15 | 2023-03-21 | 로커스 솔루션즈 아이피씨오, 엘엘씨 | 개선된 분뇨 처리 방법 및 조성물 |
| CN113519353B (zh) * | 2020-12-16 | 2023-03-31 | 湖北理工学院 | 一种阳新湖蒿-绿肥轮作方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101671633A (zh) * | 2009-09-28 | 2010-03-17 | 南京农业大学 | 防除连作棉花黄萎病的拮抗菌及用其微生物有机肥料 |
| CN101691549A (zh) * | 2009-09-28 | 2010-04-07 | 南京农业大学 | 能防治连作甜瓜枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料 |
| CN103113167A (zh) * | 2013-03-18 | 2013-05-22 | 济南巨微生物技术有限公司 | 一种复合型微生物有机肥及其制备方法 |
| CN103725635A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-16 | 陕西万源生物农业科技有限公司 | 一种用于草莓种植的复合益生菌 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6365384B1 (en) * | 1999-05-05 | 2002-04-02 | Ryusuke Iijima | Method for disposing waste |
-
2014
- 2014-06-12 CN CN201410262147.8A patent/CN104016745B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101671633A (zh) * | 2009-09-28 | 2010-03-17 | 南京农业大学 | 防除连作棉花黄萎病的拮抗菌及用其微生物有机肥料 |
| CN101691549A (zh) * | 2009-09-28 | 2010-04-07 | 南京农业大学 | 能防治连作甜瓜枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料 |
| CN103113167A (zh) * | 2013-03-18 | 2013-05-22 | 济南巨微生物技术有限公司 | 一种复合型微生物有机肥及其制备方法 |
| CN103725635A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-16 | 陕西万源生物农业科技有限公司 | 一种用于草莓种植的复合益生菌 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 土壤微生物制剂防治草莓连作病害的研究;张丽萍，等;《土壤》;20070815;第39卷(第04期);第604-607页 * |
| 张慧，等.土传棉花黄萎病拮抗菌的筛选及其生物效应.《土壤学报》.2008,第45卷(第06期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104016745A (zh) | 2014-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104016745B (zh) | 微生物有机肥及其制备方法 | |
| CN101696390B (zh) | 连作黄瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株及其微生物有机肥料 | |
| US8518428B2 (en) | Antagonistic bacteria for controlling the Fusarium wilt of continuous cropping banana and their microbial organic fertilizer | |
| CN102718577B (zh) | 一种防治病害的辣椒专用有机栽培基质及其制备方法 | |
| CN101696395B (zh) | 防除连作烟草黑胫病的拮抗菌及其微生物有机肥料 | |
| CN107266184A (zh) | 龙牙百合栽培基质及其制备方法 | |
| CN101948780B (zh) | 防治连作辣椒疫病的拮抗菌及其微生物有机肥料 | |
| CN112481159B (zh) | 一种微生物菌剂及其应用 | |
| CN104774045B (zh) | 一种利用甜高粱酒醪加工微生物有机菌肥的方法 | |
| CN107646616A (zh) | 一种花卉栽培基质的制备方法 | |
| CN107580818A (zh) | 一种土壤调理与修复的综合方法 | |
| CN105439725A (zh) | 一种用于农场现场发酵的多粘类芽孢杆菌药肥及其应用 | |
| CN109020727A (zh) | 一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法 | |
| CN1962815A (zh) | 魔芋土壤改良剂 | |
| CN108863550A (zh) | 一种茶树专用防病促生复合微生物菌肥及其制备方法 | |
| CN105248233A (zh) | 油茶苗接种am菌的方法及油茶的高产种植方法 | |
| CN1552674A (zh) | 人参活性复合肥 | |
| CN101928161B (zh) | 一种直播压缩营养钵原料的制备方法 | |
| CN106396862A (zh) | 一种防治病害的薯类专用微生物菌肥及其制备方法 | |
| CN106938942A (zh) | 具有防控小白菜炭疽病功能的生物有机肥及其制备方法 | |
| CN110122485A (zh) | 一种木霉菌剂、木霉菌及其制备方法 | |
| CN104844285A (zh) | 一种提高樱桃番茄免疫力的生物有机肥的制备方法 | |
| CN104817367A (zh) | 一种富硒花椰菜专用生物有机肥的制备方法 | |
| CN113207625B (zh) | 一种黄瓜育苗基质 | |
| JPH11255572A (ja) | 微生物応用資材 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Chen Lihua Inventor after: Xu Xianghong Inventor after: Chang Yijun Inventor after: Wang Changchun Inventor after: Chu Chenglan Inventor after: Zhang Jinsong Inventor before: Chen Lihua Inventor before: Chang Yijun Inventor before: Wang Changchun Inventor before: Zhang Jie Inventor before: Fan Shuaishuai Inventor before: Wang Shasha |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160926 Address after: 211100 Nanjing City, Jiangning Province, West Road, Buddha District, No. 8 Patentee after: HOHAI University Patentee after: Jiangsu Coastal Development Group Co.,Ltd. Address before: 211100 Nanjing City, Jiangning Province, West Road, Buddha District, No. 8 Patentee before: Hohai University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200717 Address after: Huanglong village river town 211700 Huaian city Jiangsu County of Xuyi Province Patentee after: JIANGSU NONGFENGBAO BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 211100 Nanjing City, Jiangning Province, West Road, Buddha District, No. 8 Co-patentee before: Jiangsu Coastal Development Group Co.,Ltd. Patentee before: HOHAI University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Microbial organic fertilizer and preparation method thereof Effective date of registration: 20220802 Granted publication date: 20160323 Pledgee: Jiangsu Xuyi Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: JIANGSU NONGFENGBAO BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2022980011754 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160323 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |