CN113699068B - 吡咯伯克霍尔德氏菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吡咯伯克霍尔德氏菌株及其应用，所述吡咯伯克霍尔德菌株的分类命名为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)ZJ9，保藏号为CCTCC M 2021968。所述吡咯伯克霍尔德氏菌株具有高效溶磷、固氮、产铁载体和3‑吲哚乙酸的能力，利用该菌株制备的微生物菌剂可用于新垦造耕地土壤中，能够改善土壤的微生物种群结构，促进土壤熟化，从而有利于植物的生长。
Description
技术领域
本发明涉及微生物制剂领域，特别是涉及一种吡咯伯克霍尔德氏菌株及其在新垦造耕地中的应用。
背景技术
为缓解耕地资源不断减少问题，我国多地利用新垦造耕地填补占用耕地面积以确保当地农耕面积总量的相对稳定性。然而新垦造耕地不同于可耕地，通过是未成熟的土壤，其砾石含量高、酸性强、营养匮乏，不适合植物生长。
目前，在土壤中施入植物促生根围细菌(PGPR)的微生物肥料被认为是替代化学肥料的生态友好方式，这也是可持续农业生产中降低生产成本的有效方法。目前，PGPR对植物生长影响机制的研究主要包括一些重要的细菌特性，如生物固氮、溶磷、铁载体和植物激素的产生等，已报道的植物促生真菌(PGPF)主要有曲霉菌、青霉菌以及木霉菌等，但多数菌株的功能单一或较少，只能改善土壤的少数问题，而对于未成熟土壤条件，需多方面改善土壤营养组分，才能更好地促进植物的生长。
发明内容
本发明旨在解决现有技术问题，提供了一种具有溶磷、固氮、产铁载体和3-吲哚乙酸(IAA)的吡咯伯克霍尔德菌株，应用于新垦造的土壤中，能够有效促进植物的生长。
本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌株，分类命名为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)ZJ9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2021968，保藏日期为2021年8月6日，保藏地址为中国武汉。
所述吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9为促生土壤细菌的一种，能够使土壤中难溶解的磷酸盐降解为植物了吸收的有效磷，可通过固氮功能为植物生长提供氮素，可利用细胞膜上的各种铁载体蛋白提高植物对铁素营养的吸收运输，从而缓解植物由于磷、氮、铁缺乏导致的生长受抑制状况；此外，该菌株还可以产生植物生长素IAA，促进植物抽枝或芽、苗顶部芽端的形成等。
本发明还提供了包含所述吡咯伯克霍尔德氏菌株的微生物菌剂。
可选的，所述微生物菌剂为吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9的菌悬液。
本发明还提供了所述吡咯伯克霍尔德氏菌株在促进植物生长中的应用。
可选的，在植物生长期间，对所述植物灌根吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9的菌悬液。
植物生长主要涉及根、茎、叶等，可用根长、根数、株高、地下干重或鲜重、地上干重或鲜重等指标来衡量。
可选的，所述植物种植于新垦造耕地土壤中。
可选的，所述植物为茄子。
可选的，所述菌悬液的浓度为108～109cfu/mL。
可选的，灌根时间为植物生长到3～4片叶阶段。
可选的，每株植物灌根10～12mL的菌悬液。
本发明筛选获得一株兼具高效溶磷、固氮、产铁载体和3-吲哚乙酸的吡咯伯克霍尔德氏菌株，此菌株制备的微生物菌剂能够有效改善新垦造耕地土壤中微生物种群结构以及营养成分，促进植物的生长。
附图说明
图1为菌株ZJ9在NA培养基上的菌落形态；
图2为基于atpD、gltB、gyrB、recA、lepA、phaC和trpB基因构建的包含45个伯克霍尔德氏菌属种分类单元的最大似然(ML)树；以Burkholderia kururiensis LMG 19447T为树外群.本研究分离菌株的分类单元用粗体显示；
图3为5个细菌菌株在pH 5.0或7.0的NBRIP培养基上培养3天后的溶磷效果，A.pH5.0，B.pH 7.0，1.ZJ3-12，2.ZJ5，3.ZJ9，4.ZJ62，5.ZJ174；
图4为5个细菌菌株在pH 5.0或7.0的NBRIP培养基上培养3天后的溶磷指数(PSI)％柱状图，其中柱形图显示3次重复的平均值，不同小写字母表示在P＜0.05水平差异显著；
图5为5个细菌菌株在CAS培养基上的产铁载体能力测定，A.pH 5.0；B.pH 7.0；1.ZJ3-12，2.ZJ5，3.ZJ9，4.ZJ62，5.ZJ174；
图6为5个细菌菌株在Nfb培养基上的固氮能力测定，A.pH 5.0，B.pH 7.0，1.ZJ3-12，2.ZJ5，3.ZJ9，4.ZJ62，5.ZJ174；其中左侧为对照，右侧为处理组；
图7为不同PH培养基对5个菌株产IAA能力的影响图，A.pH 5.0，B.pH 7.0，1.对照，2.含0.1％色氨酸；
图8为5个菌株在pH 5.0或7.0培养基中产IAA的浓度柱状图；
图9为5个细菌菌株灌根30天对新垦造耕地上茄子生长的影响图.A.用吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)ZJ174灌根，B.用分散泛菌(Pantoea dispersa)ZJ62灌根，C.用吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)ZJ9灌根；D.用菠萝泛菌(Pantoea ananatis)ZJ3-12灌根，E.用阿伯氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia arboris)ZJ5灌根，F.对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但本发明不仅限于此。
实施例1菌株的分离、纯化、筛选和鉴定
1.菌株的分离和纯化
以5点采样法采集浙江省杭州市临安於潜新垦造耕地土壤，封装于干净封口袋中带回实验室。以土壤稀释法分离土壤微生物菌株，即称取2g土样于18mL双蒸水(ddH2O)中，在180rpm摇床上震荡30min，制成10-1土壤稀释液；取1mL该稀释液至含有9mL ddH2O的离心管中，制成10-2土壤稀释液；以此类推，获得10-3、10-4土壤稀释液。分别取100μL 10-3和10-4土壤稀释液，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基(NA：1％胰蛋白胨、0.1％酵母抽提物、1％蔗糖、0.3％蛋白胨、1.5％琼脂)平板上，并置于30℃培养箱中培养2～3天，挑选生长速度快(菌落大)、菌落形态各异(比如，颜色、透明度、质地等形态)的细菌于新的NA平板上纯化，纯化2～3次，得到988个分离系。
2.筛选
溶磷：分别用无菌枪头将988个分离菌株转接于含有5mL NB(不加琼脂的NA)培养基的试管中，于30℃180rpm摇床上培养18h(调整OD600至0.8)，后用无菌滤纸片(直径5mm)蘸取上述菌液后转接于NBRIP培养基(葡萄糖10g、氯化镁5g、氯化钾0.2g、七水硫酸镁0.25g、硫酸铵0.1g、磷酸钙5g、琼脂15g、双蒸水1000mL,pH 5.0或7.0)平板上，在30℃培养3d，观察溶磷情况。
产铁载体：分别用无菌滤纸片(直径5mm)蘸取上述已调整OD600至0.8的菌悬液转接于CAS培养基平板上于30℃培养3天，观察培养基颜色变化，若由紫色转变为黄色，则表明该培养基上的分离系具有产铁载体能力。
其中，CAS培养基的组分及其制备方法如下：
溶液A：CAS 0.0605g、双蒸水50mL、1mM六水氯化铁(含10mM HCl)10mL；溶液B:HDTMA 0.0729g、双蒸水40mL；
溶液B:HDTMA 0.0729g、双蒸水40mL；
溶液C:双蒸水750mL、10x MM9(磷酸二氢钾0.3g、氯化钠05g、氯化铵1.0g、氢氧化钠6.0g、30.24PIPES、双蒸水1000mL，菌后再加入10％酪蛋白氨基酸30mL、葡萄糖2g、1M氯化镁1mL、100mM氯化钙1mL)100mL、琼脂15g、PIPES 30.24g，pH 5.0或7.0。
溶液A和B混匀灭菌，溶液C灭菌后冷却到50℃左右时加入上述已灭菌的A+B溶液、10％酪蛋白氨基酸30mL、葡萄糖2g、1M氯化镁1mL、100mM氯化钙1mL。
固氮：分别将上述已调整OD600至0.8的菌悬液3000g离心5min，弃上清，再用等量ddH2O重悬。分别取10μL重悬菌液至装有5mL Nfb(磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾0.1g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠0.1g、氯化钙0.02g、氯化铁0.01g,二水锰酸钠0.002g、苹果酸钠5.0g、含0.5％无水乙醇的溴百里酚蓝5mL，双蒸水1000mL，pH 5.0或7.0，在30℃180rpm摇床上培养2天。培养基颜色变化则代表菌株有固氮能力。
产IAA：分别取10μL上述重悬菌液至装有10mL NB培养基的试管中，于30℃180rpm摇床上培养2天，利用分光光度计检测是否产生IAA。
通过上述四个实验得到5株兼具溶磷、固氮、产铁载体和IAA的分离菌株，并进行编号，分别为ZJ3-12、ZJ5、ZJ9、ZJ62、ZJ174。
3.菌株ZJ9的鉴定
3.1形态特征
将分离得到的菌株ZJ9接种于NA培养基上，30℃培养2天，可获得表面光泽、边缘整齐的淡黄色圆形菌落，参见图1。
3.2系统发育分析
提取吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9的基因组DNA，分别以引物对atpD-F(5′-GAT CGTACA GTG CAT CGG-3′)(SEQ ID NO：1)和atpD-R(5′-ATC GTG CCG ACC ATG TAG-3′)(SEQID NO：2)、gltB-F(5′-CGC TCG AAG ATC AAG CAG-3′)(SEQ ID NO：3)和gltB-R(5′-GGGAAC ACC TTC ACG AAC-3′)(SEQ ID NO：4)、gyrB-F(5′-CGA CAA CTC GAT CGA CGA-3′)(SEQ ID NO：5)和gyrB-R(5′-GAC AGC AGC TTG TCG TAG-3′)(SEQ ID NO：6)、recA-F(5′-GAT AGC AAG AAG GGC TCC-3′)(SEQ ID NO：7)和recA-R(5′-CTC TTC TTC GTC CAT CGCCTC-3′)(SEQ ID NO：8)、lepA-F(5′-CGA CGG CAA GGT CTA CAA-3′)(SEQ ID NO：9)和lepA-R(5′-AGC ATG TCG ACC TTC ACG-3′)(SEQ ID NO：10)、phaC-F(5′-CTC AGC GAA TTGCGT ACG-3′)(SEQ ID NO：11)和phaC-R(5′-CCG TTC AGC GAG AAG TCG-3′)(SEQ ID NO：12)、trpB-F(5′-GAT CTA CCT GAA GCG CGA-3′)(SEQ ID NO：13)和trpB-R(5′-GTG TGCATG TCC TTG TCG-3′)(SEQ ID NO：14)扩增atpD、gltB、gyrB、recA、lepA、phaC、trpB基因。其中，PCR扩增体系(50μL)为：32.5μL ddH2O、5μL 10x PCR buffer、4μL 2.5mM dNTP、2μL10μM各引物、4μL DNA、0.5μL 5U/μL Taq DNA聚合酶(TaKaRa Bio Inc.,Japan)。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min。PCR扩增所得片段，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。所得片段序列如下：
atpD区序列：
TGATCGCGCGAAGCATGCCGAAGATCTACGACGCGCTCATTCTCGATGGCTCGGAACTGACGCTCGAAGTCCAGCAGCAGCTGGGCGACGGCGTGGTCCGTACCATTTGTCTGGGTGCATCCGACGGCCTGCGCCGCGGCCTGACCGTGAAGAACACGAGCAAGCCGATTTCGGTTCCGGTCGGCAAGCCGACCCTCGGTCGTATCATGGACGTGCTCGGCCGTCCGATCGACGAAGCCGGCCCGATCGAAAGCGAAACGACGCGTTCGATCCACCAGAAGGCTCCGGCGTTCGACGAACTGTCGCCGTCGACCGAACTGCTCGAAACGGGTATCAAGGTCATCGACCTGATCTGCCCGTTCGCGAAGGGCGGCAAGGTTGGCCTGTTCGGCGGTGCCGGCGTGGGCAAGACCGTCAACATGATGGAGCTCATCAACAACATCGCGAAGGAACACGGCGGTTACTCCGTGTTCGCGGGCGTGGGCGAGCGTACCCGTGAAGGGAACGACTTCTACCACGAAATGAAGGACTCGAACGTTCTCGACAAGGTCGCGCTGGTGTACGGCCAGATGAACGAGCCGCCGGGCAACCGTCTGCGCGTCGCGCTGACCGGCCTGACGATGGCCGAGCACTTCCGTGACGAAGGCCTCGACGTGCTGTTCTTCGTCGACAACATCTACCGTTTCACGCTGGCCGGTACCGAAGTATCGGCACTGCTCGGCCGTATGCCGTCGGCAGTGGGCTATCAGCCGACGCTGGCTGAAGAAATGGGCAAGCTGCAAGAGCGCATCACGTCGACCAAGAAGGGCTCGATTACGTCGGTCCAGGCCGTGTACGTCCCTGCGGACGACTTGACCGACCCGTCGCCGGCTACGACCTTCGGCCACCTGGACGCAACCGTCGTTCTGTCGCGTGACATCGCTTCGCTGGGTATCTACCCGGCGGTCGACCCGCTCGACTCGACGTCGCGCCAGATCGACCCRAACGTGATCGGTGAAGAGCACTACTCGATCACCCGTCGCGTTCAGCAGACGCTGCAGCGCTACAAGGAACTGCGAGACATCATCGCGATTCTGGGCATGGACGAACTGTCGCCGGAAGACAAGCTGTCGGTCGCACGTGCACGTAAGATCCAGCGTTTCCTGTCGCAGCCGTTCCACGTTGCTGAAGTGTTCACGGGCTCGCCGGGCAAGTACGTGCCGCTGAAGGAAACGATCCGCGGCTTCAAGATGATCGTCGACGGCGAGTCGACA(SEQ ID NO：15)
gltB区序列：
CTCGGCGTCCCGCCGAGTACCTGGCGTCGGCCGACCAGATCCAGATCAAGATGGCGCAGGGCGCGAAGCCGGGCGAAGGCGGCCAACTGCCGGGCCACAAGGTGTCCGAATACATCGGCAAGCTGCGTTACTCGGTGCCGGGCGTCGGCCTGATTTCGCCGCCGCCGCACCACGACATCTACTCGATCGAGGATCTGGCGCAGCTGATCCACGACCTGAAGAACGTGAACCCGAGCGCGAGCATCTCGGTGAAGCTGGTGTCGGAAGTGGGTGTCGGCACGGTCGCGGCCGGTGTCGCGAAGGCGAAGGCCGATCACGTGGTGATCGCCGGCCATGACGGCGGCACGGGCGCGTCGCCGCTGTCGTCGGTCAAGCATGCCGGCACGCCGTGGGAACTGGGTCTCGCCGAAACGCAGCAGACGCTGGTGCTGAACCGCCTGCGCGGCCGGATCCGCGTGCAGGCCGACGGCCAGATGAAGACGGGCCGCGACGTCGTGATCGGCGCGCTGCTCGGCGCGGACGAATTCGGCTTCGCGACGGCGCCGCTCGTCGTCGAGGGCTGCATCATGATGCGCAAGTGCCACCTGAACACGTGCCCGGTCGGCGTCGCGACGCAGGATCCGGTGCTGCGGGcGAAGTTCAAGGGGCAGCCCGAGCACGTCGTCAACTACTTCTTCTTCGTCGCCGAGGAAGTGCGCGAGATCATGGCGCAGCTCGGCATCGCGAAGTTCGACGACCTGATCGGCCGCGCCGACCTGCTCGATACGCGCAAGGGCATCGAGCACTGGAAGGCGAAGGGCCTCGACTTCTCGCGCGTGTTCTACCAGCCGGAAGAATGCGAAGACGTCGCACCGCGCCACGTCGACGTGCAGGATCACGGCCTCGAGCGCGCGCTCGACCACGTGCTGATCGAGAAGGCGAAGGCCGCGATCGAGAACGGCGAGCATGTGTCGTTCATCCAGCCGGTGCGCAACGTGAACCGTACGGTCGGCGCGATGCTGTCGGGCGTGATCGCGAAGAAGCACGGCCATGACGGCCTCGCCGACGACGCGGTGCACATCCAGCTGAAGGGCACGGCGGGCCAGAGCTTCGGCGCGTTCCTCGCGAAGGGCGTGACGCTCGACCTCGTCGGCGACGGCAACGACTACGTCGGCAAGGGCCTGTCGGGCGGCCGGATCATCATCCGCCCGACCAACGACTTCCGCGGCAAGTCCGAGGAAAACATCATCTGCGGCAACACGGTGATGTACGGCGCGATCGAAGGCGAAGCGTTCTTCCGCGGCGTGGCGGGCGAGCGCTTCTGCGTGCGCAACTCGGGCGCGACGGCGGTCGTCGAGGGCACGGGTGACCACGGTTGCGAATACATGACGGGCGGTACGGTCGTCGTGCTCGGCGAGACGGGGCGCAACTTCGCGGCCGGCATGTCGGGCGGCCTCGCGTACATCTACGATCCGGAAGGCACGTTCGCGGCGAAGTGCAACAAGTCGATGGTCGCGCTCGAGCCGGTGCTGCAGCAGGCCGAGCAGGAGCGCACGGTCGACCGCGCGCTCTGGCATGCGGGCACGACGGACGAAGCGCTGCTCAAGGGGCTCGTCGAGCGTCATTTCCAGTTCACGGGTtCGCCGCGCGCGAAGTCGCTGCT(SEQ ID NO：16)
gyrB区序列：
CATACGACTCACGTGACGATTCACGCCGACAACTCGATTTCCGTGACCGACAACGGCCGCGGGATCCCGACCGACGTGAAGATGAACGACAAGCACGAGCCGAAGCGCAGCGCGGCGGAAATCGTGATGACCGAGCTGCACGCCGGCGGCAAGTTCGACCAGAACAGCTACAAGGTGTCCGGTGGCCTGCACGGCGTGGGCGTGTCGTGCGTGAACGCGCTGTCGAGCTGGCTGCGCCTCACCGTGCGCCGCGACGGCAAGAAGCGGTTCATGGAGTTCCACCGCGGCGTCGCGCAGGATCGCGTGCTCGAGGTGGTGGACGGCGTGGAAGTGTCGCCGATGCTCGTGACCGGCGACACCGAGAACCGCGGCACCGAAGTGCACTTCATGGCCGATCCGACGATTTTCGGCACGGTCGAGTATCACTACGACATCCTCGCGAAGCGGATGCGTGAACTCTCGTTCCTGAACAACGGCGTGCGGATTCGTCTCACGGACCTGCGCTCGGGCAAGGAAGACGATTTCGCGTTCGCCGGCGGTGTGAAGGGCTTCGTCGAGTACATCAACAAGACGAAGACCAACCTGCACCCGACGGTGTTCTTCGCCAACGGCGAGAAGGACGGCGTGGGCGTCGAAGTCGCGATGCAGTGGAACGACAGCTACAACGAAAACGTGCTGTGCTTCACGAACAACATTCCGCAGCGCGACGGCGGCACGCACCTGACCGGCCTGCGGGCCGCGATGACGCGCGTCATCAACAAGTACATCACCGACAACGAAATCGCGAAGAAGGCGAAGGTCGAGACGACCGGCGACGACATGCGCGAAGGGCTGTCGTGCGTGCTGTCCGTGAAGGTGCCGGAGCCGAAGTTCAGCTCGCAGACGAAGGACAAGCTGGTTTCGTCCGAGGTTCGTGCGCCGGTTGAAGAGGTTGTGGCGAAGGCGCTGGAAGAGTTCCTGCTGGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTCGAGGCCGCGCGTGCTCGCGATGCTGCGCGCAAGGCGCGCGAGATGACGCGCCGCAAGGGCGTGCTCGACGGCGTCGGCCTGCCGGGGAAGCTCGCGGACTGCCAGGAGAAAGACCCGGCGAARTGCGAAATCTACATCGTCGAGGGCGACTCGGCAGGTGGGTCGGCGAAGCAAGGGCGTGATCGCAAGTTCCAGGCAATCCTGCCGCTGCGC(SEQ ID NO：17)
recA区序列：
GACCGCCGAGAAGAGCAAGGCGCTGGCGGCCGCACTCGCGCAGATCGAGAAGCAGTTCGGCAAAGGGTCGATCATGCGGATGGGCGACGGCGAGGCGGCCGAGAATATCCAGGTCGTCTCCACGGGCTCGCTGGGTCTTGATATCGCACTGGGCGTCGGCGGCTTGCCGCGCGGCCGGGTGGTCGAGATCTACGGTCCGGAATCGTCGGGTAAAACCACGCTCACGCTGCAGGTCATCGCCGAACTGCAGAAGCTGGGCGGCACCGCAGCGTTCATCGACGCCGAGCACGCGCTCGACGTTCAATATGCAGCGAAGCTCGGCGTGAACGTGCCGGAGCTGCTGATCTCGCAGCCGGACACCGGCGAGCAGGCGCTCGAAATCACCGACGCGCTGGTGCGCTCGGGCTCGATCGACATGATCGTCATCGACTCGGTCGCGGCGCTCGTGCCGAAGGCCGAAATCGAAGGCGAGATGGGCGATTCGCTGCCGGGTCTGCAGGCCCGCCTGATGTCGCAGGCGCTGCGCAAGCTGACGGGCACGATCAAGCGCACGAACTGCCTCGTGATCTTCATCAACCAGATCCGGATGAAGATCGGCGTGATGTTCGGCAACCCGGAAACCACGACGGGCGGCAACGCGCTGAAGTTCTATTCGTCGGTGCGTCTCGACATCCGCCGGATCGGCTCGATCAAGAAGAACGACGAGGTGATCGGCAACGAAACTCGCGTGAAGGTCGTCAAGAACAAGGTGTCGCCGCCGTTCCGCGAAGCGATCTTCGACATCCTGTATGGCGAAGGCATTTCGCGCCAGGGCGAGATCATCGATCTCGGCGTGCAGGCGAAGATCGTCGACAAGGCGGGCGCCTGGTACAGCTACAACGGCGAGAAGATCGGCCAGGGCAAGGACAACGCGCGTGAGTTCCTGCGCGAGAATCCGGAAATCGCGCGCGAGATCGAGAACCGCATCCGCGAATCGCTCGGCGTCGTCAGCAtGCCCGATGGCGTGAGCCACGA(SEQ ID NO：18)
lepA区序列：
ACGTCGACTTCTCGTACGAGGTCAGCCGTTCGCTGTCCGCGTGCGAAGGCGCGCTGCTGGTCGTCGATGCCAGCCAGGGCGTCGAGGCGCAGACGGTCGCGAACTGCTACACGGCGATCGAGCTCGGCGTCGAGGTCGTGCCCGTGCTGAACAAGATCGACCTGCCGGCCGCGAACCCCGAGAACGCGATCGAGGAGATCGAGGACGTGATCGGCATCGACGCGACCGACGCGACGCGCTGCAGCGCGAAGACGGGGCTCGGCGTCGAAGACGTGCTCGAGTCGCTGATCGCGAAGGTGCCGCCGCCGAAGGGCGATCCGGCTGCGCCGCTGCAGGCGCTGATCATCGATTCGTGGTTCGACAACTACGTCGGCGTCGTGATGCTCGTGCGTATCGTCAACGGCACGCTGCGTCCGAAGGACAAGATCAAGATGATAGCGACCGGCGCGCAGTATCCGGTCGAGCACGTCGGCGTGTTCACGCCGAAGTCGCGCAATCTCGACTCGCTGTCGGCCGGGCAGGTGGGCTTCATCATCGCCGGCATCAAGGAACTGACGGCCGCGAAGGTCGGCGACACCGTCACGCACGCGACCAAGGCCGCGGCCGAACCGCTGCCGGGCTTCAAGGAAGTGAAGCCGCAGGTGTTCGCGGGCCTGTATCCGGTCGAGGCGAACCAGTACGACGCGCTGCGCGAGTCGCTCGAGAAGCTGAAGCTGAACGACGCGTCGCTGCAGTACGAGCCGGAAGTGTCGCAGGCACTCGGCTTCGGTTTCCGCTGCGGCTTCCTCGGGCTGCTGCACATGGAAATCGTGCAGGAGCGGCTCGAGCGCGAGTTCGACATGGACCTCATCACGACCGCGCCGACGGTCGTCTACGAGGTCGTGCAGAGCGACGGCACGACGATCATGGTCGAGAACCCGGCGAAGATGCCGGAAcCGGGCCGCATCGGCGAGGTCCGCGAGCCGATCGTCACCGTGAACCTGTATATGCCGCAGGACTACGTCGGCTCGGTGATCACGCTGTGCGAGCAGAAGCGCGGCTCGCAGATCAACATGCAGTATCACGGCCGCCAGGTGCAGCTCACGTACGAGATCCCGATGGCCGAGATCGTGCTCGACTTCTTCGATCGCCTGAAGTCGGTGTCGCGCGGCTATGCGTCGATGGACTACGAGTTCAAG(SEQ ID NO：19)
phaC区序列：
AAAGGGAAAAATTCGTACGTAACGGGCGGGATGGGCGGCATCGGCACCAGCATCTGCCAGCGTCTGTCGAAAGACGGCTTCAAGGTCGTCGCGGGTTGCGGCCCGAACTCGCCGCGCCGCGTGAAATGGCTCGAGGACCAGAAGGCGCTCGGGTACGATTTCATCGCGTCGGAAGGCAACGTCGGCGACTGGGACTCGACCAAGGAAGCATTCGACAAGGTCAAGGCCGAAGTCGGCGAGATCGACGTGCTGGTCAACAACGCGGGCATCACGCGCGACGTCGTGTTCCGCAAGATGACGCATGAAGACTGGACGGCCGTGATCGACACCAACCTGACGAGCCTGTTCAACGTGACGAAGCAGGTGATCGACGGAATGGTCGAGCGCGGCTGGGGCCGCATCATCAACATTTCGTCGGTGAACGGCCAGAAAGGGCAATTCGGCCAGACCAACTACTCGACCGCGAAGGCCGGCATCCACGGCTTCACGATGTCGCTCGCACAGGAGGTCGCGACGAAGGGCGTGACGGTCAACACCGTGTCGCCGGGCTACATCGGCACCGACATGGTGAAGGCGATCCGCCCCGACGTGCTCGAGAAGATCGTCGCGACGATCCCGGTGCGGCGTCTAGGCGGGCCTGAGGAAATCGGTTCGATCGTCGCGTGGCTCGCGTCGAACGATTCCGGCTTCGCGACGGGCGCCGACTTCCCtGCTGAACGGATTTTTTTTCTCTCCT(SEQ ID NO：20)
trpB区序列：
GCGAAGACCTGAACCACACCGGTGCGCACAAGATCAACAACGTGATCGGCCAGGCGCTGCTCGCGAAGCGCATGGGCAAGAAGCGCGTGATCGCCGAAACCGGCGCCGGCCAGCACGGCGTTGCGACCGCGACGATCTGCGCGCGCTTCGGCATGGAGTGCATCGTCTACATGGGCGCCGAGGACGTGCGCCGGCAGGCCGCGAACGTCTACCGGATGAAGCTGCTTGGCGCGACGGTCGTGCCGGTCGAATCGGGTTCGCGCACGCTGAAGGACGCGCTGAACGAAGCGATGCGCGACTGGGTCACGAACATCGAGAGCACGTTCTACATCATCGGCACGGTCGCGGGCCCGCACCCGTACCCGATGATGGTGCGCGACTTCCAGCGCGTGATCGGCGACGAGTGCAAGGTGCAGATGCCCGAACTCGCGGGCCGGCAGCCCGACGCGGTGATCGCCTGCGTCGGCGGCGGCTCGAACGCGATGGGCATCTTCTATCCGTACATCGACGATCGATCGGTACAGCTGATCGGCGTCGAAGCGGCCGGCGACGGCCTCGACACGGGCCATCATGCGGCCTCGCTGATCGCCGGCAGCCCGGGCGTGCTGCACGGCAACCGCACGTACCTGCTGCAGGACGACAACGGCCAGATCATCGAGACGCATTCGGTGTCGGCGGGCCTCGACTATCCGGGCGTCGGCCCCGAACACGCGTGGCTGAAGGACAGCGGCCGCGCGCAGTACGTGCCGATCACCGACGACGAGGCACTGAAGGCATTCCACGACTGCTGCCGGATCGAGGGGATCATTCCCGCGCTCGAGTCGAGCCACGCGATCGCGTATGGCGTGAAGCTCGCGCCGACGTTGCCGAAGGACAAGATCCTGCTCGTCAACCTGTCGGGCCGCG(SEQ ID NO：21)
上述序列经MAFFT 7.273比对排列、Gblocks 0.91b剪切、SequenceMatrixversion 1.7.9连接后，经jModel Test 2.1.7进行演化模型分析，以RaxmlGUI v.1.5最大似然法(ML)构建系统发育树。系统发育树由45个分类单元构成，其中Burkholderiakururiensis LMG 19447T作为外群。述7个位点序列串联后，构建的系统发育树结果表明(图2)，菌株ZJ9与吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174、AU24190、R-13543和ATCC 39277作为一个分支聚在一起，具有ML-BS支持率为100％。系统发育分析结果显示，菌株ZJ9是吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)，将其命名为吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9，并保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉)，保藏号为CCTCC M 2021968。
实施例2溶磷能力测定
将-70℃下保存的吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9、吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174、阿伯氏伯克霍尔德氏菌ZJ5、分散泛菌ZJ62分别接种于NA平板(1％胰蛋白胨、0.1％酵母抽提物、1％蔗糖、0.3％蛋白胨、1.5％琼脂)上，在30℃培养活化2天。分别用无菌枪头转接上述的活化菌株于含有5mL NB(即未加琼脂的NA)培养基的试管中，于30℃180rpm摇床上培养18h。
调整OD600至0.8后，用无菌滤纸片(直径5mm)蘸取上述菌液后转接于NBRIP培养基(葡萄糖10g、氯化镁2 5g、氯化钾0.2g、七水硫酸镁0.25g、硫酸铵0.1g、磷酸钙5g、琼脂15g、双蒸水1000mL、pH 5.0或7.0)平板上，在30℃培养3天，测量溶磷圈直径，并按照式1计算溶磷指数，式1如下：
溶磷指数％＝(处理菌落直径-无菌滤纸片直径)/无菌滤纸片直径X100。
如图3所示，不论在pH 5.0还是pH 7.0条件下，5个细菌菌株均有明显的溶磷效果。各菌株的溶磷指数结果如4所示，在pH 5.0时，吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9溶磷指数为118.8±3.9％，显著高于吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174的110±6.3％、阿伯氏伯克霍尔德氏菌ZJ5的100±4.6％及菠萝泛菌ZJ3-12的93.1±2.9％。而在pH 7.0时，吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9溶磷指数为95.8±4.6％，显著高于菠萝泛菌ZJ3-12的87.5±4.6％，与阿伯氏伯克霍尔德氏菌ZJ5的95.8±3.9％相当，显著低于吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174的108.3±4.6％。
实施例3产铁载体能力测定
用无菌滤纸片(直径5mm)蘸取实施例2中5mL NB培养基中30℃180rpm摇床上培养18h后菌液(调整OD600至0.8)，转接于CAS培养基平板上于30℃培养3d，测量橙黄色晕圈直径。
其中，CAS培养基的组分及其制备方法如下：
溶液A：CAS 0.0605g、双蒸水50mL、1mM六水氯化铁(含10mM HCl)10mL；溶液B:HDTMA 0.0729g、双蒸水40mL；
溶液B:HDTMA 0.0729g、双蒸水40mL；
溶液C:双蒸水750mL、10x MM9(磷酸二氢钾0.3g、氯化钠05g、氯化铵1.0g、氢氧化钠6.0g、30.24PIPES、双蒸水1000mL，菌后再加入10％酪蛋白氨基酸30mL、葡萄糖2g、1M氯化镁1mL、100mM氯化钙1mL)100mL、琼脂15g、PIPES 30.24g，pH 5.0或7.0。
溶液A和B混匀灭菌，溶液C灭菌后冷却到50℃左右时加入上述已灭菌的A+B溶液、10％酪蛋白氨基酸30mL、葡萄糖2g、1M氯化镁1mL、100mM氯化钙1mL。
结果如图5所示，在pH 5.0时，吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9橙黄色晕圈直径为1.06±0.11cm，略小于菠萝泛菌(ZJ3-12(1.11±0.21cm)，但显著小于吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174(2.12±0.12cm)、阿伯氏伯克霍尔德氏菌ZJ5(1.24±0.19cm)和分散泛菌ZJ62(1.21±0.15cm)。而在pH 7.0时，吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9橙黄色晕圈直径为0.85±0.03cm，显著小于分散泛菌ZJ62(1.20±0.09cm)、吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174(1.10±0.08cm)、阿伯氏伯克霍尔德氏菌ZJ5(0.99±0.05cm)和菠萝泛菌J3-12(0.94±0.06cm)。
实施例4固氮能力测定
将实施例2活化的菌株，在5mL NB培养基中于30℃180rpm摇床上培养20h，3000g离心5min，弃上清，再用双蒸水重悬菌获得OD600为0.8的菌悬液。取10μL菌液至装有5mL Nfb培养基的试管中于30℃180rpm摇床上培养2d。培养基颜色变化则代表菌株有固氮能力。
其中，Nfb培养基的组分如下：
磷酸二氢钾0.4g、K2HPO4磷酸氢二钾0.1g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠0.1g、氯化钙0.02g、氯化铁0.01g、二水钼酸钠0.002g、苹果酸钠5.0g、含0.5％无水乙醇的溴百里酚蓝溶液5mL溶于1000mL双蒸水，pH 7.0。
结果如图6所示，5个细菌菌株在pH 5.0时培养基由黄变蓝，在pH 7.0时培养基由绿变蓝，表明5个细菌菌株在pH 5.0和pH 7.0时均有固氮能力。
实施例5产IAA能力测定
取10μL实施例2中5mL NB培养基中30℃180rpm摇床上培养18h后菌液(调整OD600至0.8)至含有10mL NB培养基的试管中，于30℃180rmp摇床上培养2d，利用分光光度计测定OD530值。
以不同NB培养基pH(pH 5.0,7.0)和NB中色氨酸含量0.1％为不同处理。即，pH 5.0或7.0的100mL NB培养基中加入0.1g色氨酸。
如图7所示，不论在pH 5.0或pH 7.0时，0.1％色氨酸均能诱导5个细菌菌株产生IAA，且在pH 7.0时各菌株产IAA量大于pH 5.0。其中，pH 5.0时，吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9和菠萝泛菌ZJ3-12产IAA量高于吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174、阿伯氏伯克霍尔德氏菌ZJ5和分散泛菌ZJ62；pH 7.0时，阿伯氏伯克霍尔德氏菌ZJ5产IAA量最多，吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9和菠萝泛菌ZH3-12次之，吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174和分散泛菌ZJ62产IAA量最少。
根据OD530值计算培养基中的IAA浓度，结果如图8所示，吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9在NB培养基pH 7.0时产IAA量为70.17±0.52μg/mL，略高于菠萝泛菌ZJ3-12(67.33±2.60μg/mL)，显著高于分散泛菌ZJ62(23.25±1.09μg/mL)和吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174(18.58±0.38μg/mL，但显著低于阿伯氏伯克霍尔德氏菌ZJ5(123.92±1.70μg/mL)。在NB培养基pH5.0时，吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9 IAA产量为20.75±1.09μg/mL，显著低于菠萝泛菌ZJ3-12(29.58±1.38μg/mL)，但显著高于吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174(17.67±0.63μg/mL)、阿伯氏伯克霍尔德氏菌ZJ5(11.83±0.63μg/mL)和分散泛菌ZJ62(9.92±0.80μg/mL。吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9在pH 7.0时IAA量显著高于pH 5.0。
实施例6在新垦造耕地土壤中对茄子苗的促生作用
将上述活化菌株，用无菌枪头接种于新的NB培养基中，于30℃180rpm摇床上培养20h，以获得菌落浓度为108CFU/mL的细菌悬液。
‵杭茄2010′种子先用2％次氯酸钠溶液消毒2min，再用无菌水冲洗3次，并在无菌水中浸泡5h，风干。将上述种子置于湿润的无菌滤纸上，于25℃预培养3d。将发芽的种子播种至装满耶糠的32孔穴盘中，置于25℃、相对湿度70～80％的温室中培养。选择长势基本一致的3～4叶期茄子幼苗，定植于装有未灭菌新垦造耕地土壤(采自浙江省杭州市临安於潜新垦造耕地，土壤pH 5.2)的花盆中，每盆1株，每处理30株，三次重复。于定植当天，在茄子植株根部灌上述细菌悬液10mL，以灌无菌水为对照。在30℃、相对湿度70～80％的温室内生长30d后，测定茄子植株株高、根长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重、地下干重。其中，促生作用(GPF％)＝(处理-对照)/对照×100％。
结果如图9、表1和表2所示，与对照相比，5个菌株对植株生长和生物量的积累均有明显的促进作用，尤其对叶片生长的促进作用最为明显。其中，吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9灌根处理中，地上、地下干重(或鲜重)比对照增加最多，分别增加54.80％(或76.37％)、39.51％(或154.89％)，而株高和根长比对照增加也较多，分别增加23.34％、46.16％，其还能明显促进茄子植株的早期开花。分散泛菌ZJ62灌根处理中，根长比对照增加最多，增加49.33％，而株高、地上、地下干重(或鲜重)比对照增加也较多，分别增加23.57％、43.62％(或65.35％)、38.49％(或118.41％)。吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ174灌根处理中，株高比对照增加最多，增加34.50％，而地上、地下干重(或鲜重)比对照增加也较多，分别增加37.39％(或69.06％)、28.95％(或117.01％)，但根长比对照增加最少，增加26.22％。菠萝泛菌ZJ3-12灌根处理中，地下干重比对照增加最多，增加53.42％，株高、地上干重、地下鲜重对对照增加也较多，分别增加25.45％、44.89％、107.38％，但根长、地上鲜重比对照增加较小，分别增加42.20％、50.17％。而阿伯氏伯克霍尔德氏菌ZJ5灌根处理中，株高、地上、地下干重(或鲜重)比对照增加最少，分别增加12.52％、13.48(或16.05％)、8.32％(或33.77％)，而根长比对照的增加较少，增加30.40％。
表1 5个菌株灌根30d对茄子植株生长的影响
注：同列数据后的不同小写字母表示在P＜0.05水平差异显著
表2 5个菌株灌根30d对茄子植株的促生作用
注：同列数据后的不同小写字母表示在P＜0.05水平差异显著
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州市农业科学研究院
<120> 吡咯伯克霍尔德氏菌株及其应用
<130>
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gatcgtacag tgcatcgg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
atcgtgccga ccatgtag 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
cgctcgaaga tcaagcag 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
gggaacacct tcacgaac 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
cgacaactcg atcgacga 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
gacagcagct tgtcgtag 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
gatagcaaga agggctcc 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
ctcttcttcg tccatcgcct c 21
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
cggcaaggtc tacaa 15
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
agcatgtcga ccttcacg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
ctcagcgaat tgcgtacg 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
ccgttcagcg agaagtcg 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
gatctacctg aagcgcga 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
gtgtgcatgt ccttgtcg 18
<210> 15
<211> 1253
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
tgatcgcgcg aagcatgccg aagatctacg acgcgctcat tctcgatggc tcggaactga 60
cgctcgaagt ccagcagcag ctgggcgacg gcgtggtccg taccatttgt ctgggtgcat 120
ccgacggcct gcgccgcggc ctgaccgtga agaacacgag caagccgatt tcggttccgg 180
tcggcaagcc gaccctcggt cgtatcatgg acgtgctcgg ccgtccgatc gacgaagccg 240
gcccgatcga aagcgaaacg acgcgttcga tccaccagaa ggctccggcg ttcgacgaac 300
tgtcgccgtc gaccgaactg ctcgaaacgg gtatcaaggt catcgacctg atctgcccgt 360
tcgcgaaggg cggcaaggtt ggcctgttcg gcggtgccgg cgtgggcaag accgtcaaca 420
tgatggagct catcaacaac atcgcgaagg aacacggcgg ttactccgtg ttcgcgggcg 480
tgggcgagcg tacccgtgaa gggaacgact tctaccacga aatgaaggac tcgaacgttc 540
tcgacaaggt cgcgctggtg tacggccaga tgaacgagcc gccgggcaac cgtctgcgcg 600
tcgcgctgac cggcctgacg atggccgagc acttccgtga cgaaggcctc gacgtgctgt 660
tcttcgtcga caacatctac cgtttcacgc tggccggtac cgaagtatcg gcactgctcg 720
gccgtatgcc gtcggcagtg ggctatcagc cgacgctggc tgaagaaatg ggcaagctgc 780
aagagcgcat cacgtcgacc aagaagggct cgattacgtc ggtccaggcc gtgtacgtcc 840
ctgcggacga cttgaccgac ccgtcgccgg ctacgacctt cggccacctg gacgcaaccg 900
tcgttctgtc gcgtgacatc gcttcgctgg gtatctaccc ggcggtcgac ccgctcgact 960
cgacgtcgcg ccagatcgac ccraacgtga tcggtgaaga gcactactcg atcacccgtc 1020
gcgttcagca gacgctgcag cgctacaagg aactgcgaga catcatcgcg attctgggca 1080
tggacgaact gtcgccggaa gacaagctgt cggtcgcacg tgcacgtaag atccagcgtt 1140
tcctgtcgca gccgttccac gttgctgaag tgttcacggg ctcgccgggc aagtacgtgc 1200
cgctgaagga aacgatccgc ggcttcaaga tgatcgtcga cggcgagtcg aca 1253
<210> 16
<211> 1642
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
ctcggcgtcc cgccgagtac ctggcgtcgg ccgaccagat ccagatcaag atggcgcagg 60
gcgcgaagcc gggcgaaggc ggccaactgc cgggccacaa ggtgtccgaa tacatcggca 120
agctgcgtta ctcggtgccg ggcgtcggcc tgatttcgcc gccgccgcac cacgacatct 180
actcgatcga ggatctggcg cagctgatcc acgacctgaa gaacgtgaac ccgagcgcga 240
gcatctcggt gaagctggtg tcggaagtgg gtgtcggcac ggtcgcggcc ggtgtcgcga 300
aggcgaaggc cgatcacgtg gtgatcgccg gccatgacgg cggcacgggc gcgtcgccgc 360
tgtcgtcggt caagcatgcc ggcacgccgt gggaactggg tctcgccgaa acgcagcaga 420
cgctggtgct gaaccgcctg cgcggccgga tccgcgtgca ggccgacggc cagatgaaga 480
cgggccgcga cgtcgtgatc ggcgcgctgc tcggcgcgga cgaattcggc ttcgcgacgg 540
cgccgctcgt cgtcgagggc tgcatcatga tgcgcaagtg ccacctgaac acgtgcccgg 600
tcggcgtcgc gacgcaggat ccggtgctgc gggcgaagtt caaggggcag cccgagcacg 660
tcgtcaacta cttcttcttc gtcgccgagg aagtgcgcga gatcatggcg cagctcggca 720
tcgcgaagtt cgacgacctg atcggccgcg ccgacctgct cgatacgcgc aagggcatcg 780
agcactggaa ggcgaagggc ctcgacttct cgcgcgtgtt ctaccagccg gaagaatgcg 840
aagacgtcgc accgcgccac gtcgacgtgc aggatcacgg cctcgagcgc gcgctcgacc 900
acgtgctgat cgagaaggcg aaggccgcga tcgagaacgg cgagcatgtg tcgttcatcc 960
agccggtgcg caacgtgaac cgtacggtcg gcgcgatgct gtcgggcgtg atcgcgaaga 1020
agcacggcca tgacggcctc gccgacgacg cggtgcacat ccagctgaag ggcacggcgg 1080
gccagagctt cggcgcgttc ctcgcgaagg gcgtgacgct cgacctcgtc ggcgacggca 1140
acgactacgt cggcaagggc ctgtcgggcg gccggatcat catccgcccg accaacgact 1200
tccgcggcaa gtccgaggaa aacatcatct gcggcaacac ggtgatgtac ggcgcgatcg 1260
aaggcgaagc gttcttccgc ggcgtggcgg gcgagcgctt ctgcgtgcgc aactcgggcg 1320
cgacggcggt cgtcgagggc acgggtgacc acggttgcga atacatgacg ggcggtacgg 1380
tcgtcgtgct cggcgagacg gggcgcaact tcgcggccgg catgtcgggc ggcctcgcgt 1440
acatctacga tccggaaggc acgttcgcgg cgaagtgcaa caagtcgatg gtcgcgctcg 1500
agccggtgct gcagcaggcc gagcaggagc gcacggtcga ccgcgcgctc tggcatgcgg 1560
gcacgacgga cgaagcgctg ctcaaggggc tcgtcgagcg tcatttccag ttcacgggtt 1620
cgccgcgcgc gaagtcgctg ct 1642
<210> 17
<211> 1218
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
catacgactc acgtgacgat tcacgccgac aactcgattt ccgtgaccga caacggccgc 60
gggatcccga ccgacgtgaa gatgaacgac aagcacgagc cgaagcgcag cgcggcggaa 120
atcgtgatga ccgagctgca cgccggcggc aagttcgacc agaacagcta caaggtgtcc 180
ggtggcctgc acggcgtggg cgtgtcgtgc gtgaacgcgc tgtcgagctg gctgcgcctc 240
accgtgcgcc gcgacggcaa gaagcggttc atggagttcc accgcggcgt cgcgcaggat 300
cgcgtgctcg aggtggtgga cggcgtggaa gtgtcgccga tgctcgtgac cggcgacacc 360
gagaaccgcg gcaccgaagt gcacttcatg gccgatccga cgattttcgg cacggtcgag 420
tatcactacg acatcctcgc gaagcggatg cgtgaactct cgttcctgaa caacggcgtg 480
cggattcgtc tcacggacct gcgctcgggc aaggaagacg atttcgcgtt cgccggcggt 540
gtgaagggct tcgtcgagta catcaacaag acgaagacca acctgcaccc gacggtgttc 600
ttcgccaacg gcgagaagga cggcgtgggc gtcgaagtcg cgatgcagtg gaacgacagc 660
tacaacgaaa acgtgctgtg cttcacgaac aacattccgc agcgcgacgg cggcacgcac 720
ctgaccggcc tgcgggccgc gatgacgcgc gtcatcaaca agtacatcac cgacaacgaa 780
atcgcgaaga aggcgaaggt cgagacgacc ggcgacgaca tgcgcgaagg gctgtcgtgc 840
gtgctgtccg tgaaggtgcc ggagccgaag ttcagctcgc agacgaagga caagctggtt 900
tcgtccgagg ttcgtgcgcc ggttgaagag gttgtggcga aggcgctgga agagttcctg 960
ctggaaacgc cgatcgacgc gaagatcatc tgcgggaaga tcgtcgaggc cgcgcgtgct 1020
cgcgatgctg cgcgcaaggc gcgcgagatg acgcgccgca agggcgtgct cgacggcgtc 1080
ggcctgccgg ggaagctcgc ggactgccag gagaaagacc cggcgaartg cgaaatctac 1140
atcgtcgagg gcgactcggc aggtgggtcg gcgaagcaag ggcgtgatcg caagttccag 1200
gcaatcctgc cgctgcgc 1218
<210> 18
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
gaccgccgag aagagcaagg cgctggcggc cgcactcgcg cagatcgaga agcagttcgg 60
caaagggtcg atcatgcgga tgggcgacgg cgaggcggcc gagaatatcc aggtcgtctc 120
cacgggctcg ctgggtcttg atatcgcact gggcgtcggc ggcttgccgc gcggccgggt 180
ggtcgagatc tacggtccgg aatcgtcggg taaaaccacg ctcacgctgc aggtcatcgc 240
cgaactgcag aagctgggcg gcaccgcagc gttcatcgac gccgagcacg cgctcgacgt 300
tcaatatgca gcgaagctcg gcgtgaacgt gccggagctg ctgatctcgc agccggacac 360
cggcgagcag gcgctcgaaa tcaccgacgc gctggtgcgc tcgggctcga tcgacatgat 420
cgtcatcgac tcggtcgcgg cgctcgtgcc gaaggccgaa atcgaaggcg agatgggcga 480
ttcgctgccg ggtctgcagg cccgcctgat gtcgcaggcg ctgcgcaagc tgacgggcac 540
gatcaagcgc acgaactgcc tcgtgatctt catcaaccag atccggatga agatcggcgt 600
gatgttcggc aacccggaaa ccacgacggg cggcaacgcg ctgaagttct attcgtcggt 660
gcgtctcgac atccgccgga tcggctcgat caagaagaac gacgaggtga tcggcaacga 720
aactcgcgtg aaggtcgtca agaacaaggt gtcgccgccg ttccgcgaag cgatcttcga 780
catcctgtat ggcgaaggca tttcgcgcca gggcgagatc atcgatctcg gcgtgcaggc 840
gaagatcgtc gacaaggcgg gcgcctggta cagctacaac ggcgagaaga tcggccaggg 900
caaggacaac gcgcgtgagt tcctgcgcga gaatccggaa atcgcgcgcg agatcgagaa 960
ccgcatccgc gaatcgctcg gcgtcgtcag catgcccgat ggcgtgagcc acga 1014
<210> 19
<211> 1178
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
acgtcgactt ctcgtacgag gtcagccgtt cgctgtccgc gtgcgaaggc gcgctgctgg 60
tcgtcgatgc cagccagggc gtcgaggcgc agacggtcgc gaactgctac acggcgatcg 120
agctcggcgt cgaggtcgtg cccgtgctga acaagatcga cctgccggcc gcgaaccccg 180
agaacgcgat cgaggagatc gaggacgtga tcggcatcga cgcgaccgac gcgacgcgct 240
gcagcgcgaa gacggggctc ggcgtcgaag acgtgctcga gtcgctgatc gcgaaggtgc 300
cgccgccgaa gggcgatccg gctgcgccgc tgcaggcgct gatcatcgat tcgtggttcg 360
acaactacgt cggcgtcgtg atgctcgtgc gtatcgtcaa cggcacgctg cgtccgaagg 420
acaagatcaa gatgatagcg accggcgcgc agtatccggt cgagcacgtc ggcgtgttca 480
cgccgaagtc gcgcaatctc gactcgctgt cggccgggca ggtgggcttc atcatcgccg 540
gcatcaagga actgacggcc gcgaaggtcg gcgacaccgt cacgcacgcg accaaggccg 600
cggccgaacc gctgccgggc ttcaaggaag tgaagccgca ggtgttcgcg ggcctgtatc 660
cggtcgaggc gaaccagtac gacgcgctgc gcgagtcgct cgagaagctg aagctgaacg 720
acgcgtcgct gcagtacgag ccggaagtgt cgcaggcact cggcttcggt ttccgctgcg 780
gcttcctcgg gctgctgcac atggaaatcg tgcaggagcg gctcgagcgc gagttcgaca 840
tggacctcat cacgaccgcg ccgacggtcg tctacgaggt cgtgcagagc gacggcacga 900
cgatcatggt cgagaacccg gcgaagatgc cggaaccggg ccgcatcggc gaggtccgcg 960
agccgatcgt caccgtgaac ctgtatatgc cgcaggacta cgtcggctcg gtgatcacgc 1020
tgtgcgagca gaagcgcggc tcgcagatca acatgcagta tcacggccgc caggtgcagc 1080
tcacgtacga gatcccgatg gccgagatcg tgctcgactt cttcgatcgc ctgaagtcgg 1140
tgtcgcgcgg ctatgcgtcg atggactacg agttcaag 1178
<210> 20
<211> 736
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
aaagggaaaa attcgtacgt aacgggcggg atgggcggca tcggcaccag catctgccag 60
cgtctgtcga aagacggctt caaggtcgtc gcgggttgcg gcccgaactc gccgcgccgc 120
gtgaaatggc tcgaggacca gaaggcgctc gggtacgatt tcatcgcgtc ggaaggcaac 180
gtcggcgact gggactcgac caaggaagca ttcgacaagg tcaaggccga agtcggcgag 240
atcgacgtgc tggtcaacaa cgcgggcatc acgcgcgacg tcgtgttccg caagatgacg 300
catgaagact ggacggccgt gatcgacacc aacctgacga gcctgttcaa cgtgacgaag 360
caggtgatcg acggaatggt cgagcgcggc tggggccgca tcatcaacat ttcgtcggtg 420
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<210> 21
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
gcgaagacct gaaccacacc ggtgcgcaca agatcaacaa cgtgatcggc caggcgctgc 60
tcgcgaagcg catgggcaag aagcgcgtga tcgccgaaac cggcgccggc cagcacggcg 120
ttgcgaccgc gacgatctgc gcgcgcttcg gcatggagtg catcgtctac atgggcgccg 180
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atggcgtgaa gctcgcgccg acgttgccga aggacaagat cctgctcgtc aacctgtcgg 900
gccgcg 906
Claims (8)
1.吡咯伯克霍尔德氏菌株，其特征在于，分类命名为吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）ZJ9，保藏号为CCTCC M 2021968。
2.包含权利要求1所述吡咯伯克霍尔德氏菌株的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9的菌悬液。
4.根据权利要求1所述的吡咯伯克霍尔德氏菌株在新垦造耕地土壤中对茄子促生中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在茄子生长期间，对茄子灌根吡咯伯克霍尔德氏菌ZJ9的菌悬液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌悬液的浓度为108 ~109 cfu/ mL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，灌根时间为植物生长到3~4片叶阶段。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，每株植物灌根10~12 mL的菌悬液。
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