CN108641978B - 一株可防治梨树褐斑病的类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂的应用 - Google Patents

一株可防治梨树褐斑病的类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株可防治梨树褐斑病的类芽孢杆菌Lzh‑N1及其复合菌剂的应用，类芽孢杆菌Lzh‑N1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13455，保藏日期为2016年12月15日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明还包括类芽孢杆菌Lzh‑N1、以及类芽孢杆菌Lzh‑N1和浑圆链霉菌Lzh‑48复配菌剂微生物肥料在防治梨树褐斑病方面的应用。本发明不仅可以有效防治梨树褐斑病的发生，提高梨的品质和产量，而且具有无毒、高效以及无环境污染的效果。

Description

一株可防治梨树褐斑病的类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂的 应用
技术领域
本发明涉及一株可防治梨树褐斑病的类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂的应用，具体涉及类芽孢杆菌Lzh-N1在防治梨树褐斑病方面的应用，还包括类芽孢杆菌Lzh-N1与浑圆链霉菌Lzh-48混复合菌剂在防治梨树褐斑病方面的应用，属于环境微生物领域。
背景技术
我国梨产量约占世界总产量2/3，出口量约占世界出口量的1/6，中国梨在世界梨产业发展中有着举足轻重的地位。然而，由真菌梨褐斑病菌(Mycosphaerella sentina(Fr)Schrorter)引起的梨树褐斑病在我国各大梨产区每年都有大量发生。由褐斑病引起的减产现象也经常出现，这就对我国的梨产业发展构成极大威胁。
目前，梨树褐斑病的防治方法有：做好清园工作、加强梨园管理、加强栽培管理、药剂防治等一系列方法。但是还没有高效、低毒和无环境污染的生物方法用于防治梨树褐斑病。在植物根际存在着许多对植物有益的细菌群落，包括拮抗菌、生防细菌、能生产植物生长激素的细菌和固氮菌等。在农业生态系统中，充分利用这些细菌的生物学潜力将有助于减少化肥和农药投入、促进植物生长、减轻环境污染，实现农业可持续发展。
拮抗作用指一种微生物通过分泌一种或多种抗菌活性物质来抑制甚至直接杀灭其它微生物，这些抗菌物质主要包括低分子量的抗生素(肽类、脂肽类、细菌素)和高分子量的蛋白类抗菌物质。在农业生态系统中，充分利用这些细菌的生物学潜力将有助于减少化肥和农药投入、促进植物生长、减轻环境污染，实现农业可持续发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可防治梨树褐斑病的类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂的应用，具体涉及类芽孢杆菌Lzh-N1在防治梨树褐斑病方面的应用，尤其涉及类芽孢杆菌Lzh-N1与浑圆链霉菌Lzh-48混合发酵后获得的复合菌剂在防治梨树褐斑病方面的应用，本发明可以安全、高效的防治梨树褐斑病。
本发明中，具有拮抗活性的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)Lzh-N1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 13455，保藏日期为2016年12月15日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
通过形态观察、染色、16srRNA基因序列分析等方法对类芽孢杆菌Lzh-N1 进行鉴定，结果为：
菌株为革兰氏阴性，杆状，大小为0.6μm-1.0μm×1.5μm-5.0μm。在营养琼脂固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，不透明，表面光滑扁平，边缘整齐，无色至淡黄色，菌落大小为2mm-5mm；经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某类芽孢杆菌菌株有99％的同源性，故鉴定为类芽孢杆菌属细菌，命名为类芽孢杆菌Paenibacillussp.。
具有拮抗活性的浑圆链霉菌(Streptomyces globosus)Lzh-48保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13456，保藏日期为2016年12月15日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，命名为浑圆链霉菌Streptomycesglobosus。
本发明中，类芽孢杆菌Lzh-N1及其发酵液在防治梨树褐斑病方面的应用，以及在制备微生物肥料方面的应用。
本发明还包括类芽孢杆菌Lzh-N1与浑圆链霉菌Lzh-48复合菌剂在防治梨树褐斑病方面的应用，以及在制备微生物肥料方面的应用。
本发明中，含有类芽孢杆菌Lzh-N1微生物肥料的制备方法，具体步骤如下：
(1)发酵液的制备
将类芽孢杆菌Lzh-N1的种子液接种于pH为7.0的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为6％(v/v)，在28℃、200rpm条件下发酵48h，即得类芽孢杆菌Lzh-N1的发酵液；
(2)微生物肥料的制备
将步骤(1)获得的发酵液与有机肥的体积质量比按1:10-15的比例混合，混匀后，进行固体发酵，发酵温度不超过50℃，发酵过程中每天翻堆2次，发酵7-8天后，当类芽孢杆菌Lzh-N1的含量达到1×108cfu/g以上时，即得含类芽孢杆菌Lzh-N1的微生物肥料。优选的，发酵液与有机肥的体积质量比按 1:12的比例；所述有机肥为猪粪堆肥。
本发明还包括通过上述方法获得的含类芽孢杆菌Lzh-N1的微生物肥料。
进一步的，含有类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48的复合菌剂微生物肥料，其制备方法，具体步骤如下：
(1)发酵液的制备
将类芽孢杆菌Lzh-N1的种子液接种于pH为7.0的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为6％(v/v)，在28℃、200rpm条件下发酵48h，同时将浑圆链霉菌Lzh-48的种子液接种于高氏一号液体培养基中，接种量为4％(v/v)，在28℃、200rpm条件下发酵48h，最后将类芽孢杆菌Lzh-N1发酵液和浑圆链霉菌Lzh-48发酵液按体积比4:1的比例混合即得类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48的发酵液的复合菌剂。
(2)微生物肥料的制备
将步骤(1)获得的复合菌剂与有机肥的体积质量比按1:20-30的比例混合，混匀后，进行固体发酵，发酵温度不超过50℃，发酵过程中每天翻堆2 次，发酵5-6天后，当拮抗菌的含量达到1×108cfu/g以上时，即得含有类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48的微生物肥料。优选的，发酵液与有机肥的体积质量比按1:25的比例；所述有机肥为猪粪堆肥。
本发明还包括通过上述方法获得的含有类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌 Lzh-48的微生物肥料。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明筛选到的类芽孢杆菌Lzh-N1在防治梨树褐斑病方面具有非常好的效果，尤其是类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48的复合菌剂，二者混合发酵具有对防治梨树褐斑病具有增效作用。本发明具有高效、低毒和无环境污染的效果。
附图说明
图1为类芽孢杆菌Lzh-N1对梨树褐斑病菌的拮抗效果，其中，图1A为类芽孢杆菌Lzh-N1与梨树褐斑病菌对峙培养试验，图1B为对照梨树褐斑病菌生长情况。
图2为浑圆链霉菌Lzh-48对梨树褐斑病菌的拮抗效果，其中，图2A为浑圆链霉菌LZH-48与梨树褐斑病菌对峙培养试验，图2B为对照梨树褐斑病菌生长情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1类芽孢杆菌Lzh-N1与浑圆链霉菌Lzh-48的筛选及鉴定
菌株Lzh-N1与菌株Lzh-48均是从山东省泰安市山东省农业科学院果树所梨树果园感染褐斑病梨树根际土中分离到的,具体方法为：
采用平板对峙法从植物根际土壤中筛选拮抗微生物。从染病植物的根部采取根际土，在低温条件下尽快送至实验室处理。将根际土放入无菌水中梯度稀释，然后分别涂布到LB固体培养基和高氏一号固体培养基上，28℃培养 24h后挑取单菌落。将所得单菌落接种到植物病原菌上，看是否产生抑菌带，是否具有拮抗生物活性。发明人通过大量的筛选试验分离到类芽孢杆菌 Lzh-N1与浑圆链霉菌Lzh-48。
通过形态观察、染色、16srRNA基因序列分析等方法对类芽孢杆菌Lzh-N1 进行鉴定，结果为：
菌株为革兰氏阴性，杆状，大小为0.6μm-1.0μm×1.5μm-5.0μm。在营养琼脂固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，不透明，表面光滑扁平，边缘整齐，无色至淡黄色，菌落大小为2mm-5mm；经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某类芽孢杆菌菌株有99％的同源性，故鉴定为类芽孢杆菌属细菌，命名为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) Lzh-N1。
该菌种已经保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13455，保藏日期为2016年12月15日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101，电话： 86-10-64807355。该菌种的16srRNA基因在GenBank中的登录号是 KX865137。
通过形态观察、染色、16srRNA基因序列分析等方法对拮抗菌Lzh-48进行鉴定，结果为：
菌株在固体发酵培养基上生长良好，菌落由最初的白色逐渐变成灰色或灰白色.菌落之间差异不大，表面呈粉绒状凸起，无明显褶皱；孢子丝直而短，孢子球形，表面光滑。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某浑圆链霉菌菌株有99％的同源性，故鉴定为浑圆链霉菌属，命名为浑圆链霉菌(Streptomyces globosus)Lzh-48。
该菌种已经保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13456，保藏日期为2016年12月15日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101，电话： 86-10-64807355。该菌种的16srRNA基因在GenBank中的登录号是 KX865136。
实施例2本发明中类芽孢杆菌Lzh-N1与浑圆链霉菌Lzh-48的拮抗作用
采用平板对峙法检测类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌LZH-48的拮抗作用。将梨树褐斑病病原菌Mycosphaerella sentina(Fr)Schrorter接种到PDA固体培养基上(去皮的马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，自然pH)，30℃培养48hr后备用。将类芽孢杆菌Lzh-N1接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛肉膏(3.0g)，蛋白胨(10.0g)，NaCl(5.0g)，琼脂20g，蒸馏水1000mL)上，将浑圆链霉菌LZH-48接种到高氏固体培养基(可溶性淀粉(20g)，KNO3(1g)，K2HPO4(0.5g)，MgSO4·7H2O(0.5g)，NaCl(0.5g)，FeSO4·7H2O(0.01g)，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH＝7.4-7.6)上30℃培养 48hr后分别接种到梨树褐斑病病原菌两侧，30℃继续培养48-72hr，观察是否产生抑菌带。结果如图1和图2所示，结果表明本发明类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌LZH-48均具有很强的拮抗作用。
实施例3含有类芽孢杆菌Lzh-N1微生物肥料及其制备方法
具体步骤如下：
(1)发酵液的制备
将类芽孢杆菌Lzh-N1的种子液接种于pH为7.0的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为6％(v/v)，在28℃、200rpm条件下发酵48h，即得类芽孢杆菌Lzh-N1的发酵液；
(2)微生物肥料的制备
将步骤(1)获得的发酵液与有机肥的体积质量比按1:12的比例混合，混匀后，进行固体发酵，发酵温度不超过50℃，发酵过程中每天翻堆2次，发酵7-8天后，当类芽孢杆菌Lzh-N1的含量达到1×108cfu/g以上时，即得含类芽孢杆菌Lzh-N1的微生物肥料。
实施例4含有类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48复合菌剂微生物肥料及其制备方法
具体步骤如下：
(1)混合发酵液的制备
将类芽孢杆菌Lzh-N1的种子液接种于pH为7.0的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为6％(v/v)，在28℃、200rpm条件下发酵48h，同时将浑圆链霉菌Lzh-48的种子液接种于高氏一号液体培养基中，接种量为4％(v/v)，在28℃、200rpm条件下发酵48h，最后将类芽孢杆菌Lzh-N1发酵液和浑圆链霉菌Lzh-48发酵液按体积比4:1的比例混合即得类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48复合菌剂。
(2)微生物肥料的制备
将步骤(1)获得的复合菌剂与猪粪堆肥的体积质量比按1:25的比例混合，混匀后，进行固体发酵，发酵温度不超过50℃，发酵过程中每天翻堆2次，发酵5-6天后，当拮抗菌的含量达到1×108cfu/g以上时，即得含有类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48的微生物肥料。
实施例5盆栽试验
试验用菌剂：实施例3和4中制备的微生物肥料。
试验地点：山东省泰安市岱岳区山东省果树研究所天平湖试验基地。
供试品种：鸭梨，砧木为杜梨。
实验处理：
对照：褐斑病发病土壤
处理1：褐斑病发病土壤+不加拮抗菌的猪粪有机肥
处理2：褐斑病发病土壤+实施例3获得的类芽孢杆菌Lzh-N1微生物有机肥
处理3：褐斑病发病土壤+实施例4获得的类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48复合菌剂微生物有机肥
盆栽试验中，有机肥以3％的施用量(W/W)均匀拌入褐斑病发病严重的土壤中。三天后，将长势一致的梨树幼苗移入盆钵中，盆钵规格为30cm× 40cm，每个处理20棵，重复3次。在温室中培养；两个月后，调查并记录植株病情指数、发病率，测定各项指标，统计生物防治效果，盆栽试验结果如表1所示。
如表1所示：对照CK在梨苗定植后褐斑病发病率为87.2％；处理一中添加了不加拮抗菌的猪粪有机肥，同样侵染了褐斑病(85.7％)，但是添加了类芽孢杆菌Lzh-N1微生物有机肥之后(处理二)，发病率明显降低(32.5％) 并且染病叶片同样减少(60.58％)；芽孢杆菌Lzh-N1复合菌剂微生物有机肥对梨树褐斑病具有更好的生防效果(发病率27.8％，染病叶片减少72.3％)，并且明显提高根系活力，促进根系的生长。
表1类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂微生物有机肥对梨树褐斑病的防治效果和对根系生长的促进作用
Figure BDA0001632934950000081
实施例6类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂微生物肥料对梨果实品质、产量和发病率的影响(大田试验)
试验地点：山东省济南市历城区黄河河务局梨基地(华山镇后张村)。
供试品种：黄金梨，砧木为杜梨，种植密度为2m×3m，树龄为16年，调查其发现侵染褐斑病。
试验处理：随机选择60株褐斑病发病植株，试验设4个处理：
对照：不施有机肥
处理1：施用不加拮抗菌的猪粪有机肥
处理2：施用含拮抗菌类芽孢杆菌Lzh-N1的微生物肥料
处理3：施用含拮抗菌类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48复合菌剂微生物肥料
每个处理选择长势一致的15株梨树。2015年11月施入各试验组肥料，采用放射状施肥，每株施肥5.0kg，挖深35cm、宽25cm的3条沟，土肥混匀后，埋土、浇水，其它措施同常规管理，连续处理2年。在2017年8月27 日果实成熟期时，随机选取成熟度一致、大小均匀、无机械损伤和无病虫害的30个果实，测定果实品质和相关指标，所有指标均取3次测定结果的平均值。调查并记录植株病情指数，计算防治效果。
试验结果表明，如表2，连续2年施用含类芽孢杆菌Lzh-N1微生物肥料后，果实固形物含量为14.1％，平均单果重为343.85g，可溶性总糖8.74％，有机酸含量0.17％；施用含类芽孢杆菌Lzh-N1复合菌剂微生物肥料后，果实固形物含量为14.1％，平均单果重为344.01g，可溶性总糖8.83％，有机酸含量0.16％，与对照和处理一相比较，果实硬度降低，可溶性总糖升高，有机酸含量降低，由此可见，施用含类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂的微生物肥料可以提高果实品质。
表2类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂微生物肥料对黄金梨果实品质的影响
Figure BDA0001632934950000091
经过连续2年施用含类芽孢杆菌Lzh-N1(处理2)及其复合菌剂(处理3) 微生物肥料后，2017年梨树亩产分别为3769.94、3814.31kg，比处理1和对照增产显著。可见，施用含类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂微生物肥料可以明显提高果实产量。
经过连续2年施用含类芽孢杆菌Lzh-N1(处理2)及其复合菌剂(处理3) 微生物肥料，2017年梨褐斑病的病情指数分别为0.34，0.31，防治效果分别为31.04％、33.69％(表3)。可见，施用含类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂的微生物肥料可以降低梨褐斑病的病情指数，提高防治效果。
表3类芽孢杆菌Lzh-N1及其复合菌剂微生物肥料对黄金梨产量及其染病情况的影响
Figure BDA0001632934950000092

Claims (12)

1.一株可防治梨树褐斑病的类芽孢杆菌Lzh-N1，其特征在于，所述类芽孢杆菌Lzh-N1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.13455，保藏日期为2016年12月15日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，命名为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)。
2.如权利要求1所述的可防治梨树褐斑病的类芽孢杆菌Lzh-N1在防治梨树褐斑病方面的应用。
3.如权利要求1所述的可防治梨树褐斑病的类芽孢杆菌Lzh-N1的发酵液在防治梨树褐斑病方面的应用。
4.如权利要求1所述的可防治梨树褐斑病的类芽孢杆菌Lzh-N1在制备微生物肥料方面的应用。
5.含有如权利要求1所述的类芽孢杆菌Lzh-N1的微生物肥料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)发酵液的制备
将类芽孢杆菌Lzh-N1的种子液接种于pH为7.0的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为6％(v/v)，在28℃、200rpm条件下发酵48h，即得类芽孢杆菌Lzh-N1的发酵液；
(2)微生物肥料的制备
将步骤(1)获得的发酵液与有机肥的体积质量比按1:10-15的比例混合，混匀后，进行固体发酵，发酵温度不超过50℃，发酵过程中每天翻堆2次，发酵7-8天后，当类芽孢杆菌Lzh-N1的含量达到1×108cfu/g以上时，即得含类芽孢杆菌Lzh-N1的微生物肥料。
6.如权利要求5所述的含有类芽孢杆菌Lzh-N1的微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵液与有机肥的体积质量比按1:12的比例。
7.如权利要求5或6任一所述的含有类芽孢杆菌Lzh-N1的微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述有机肥为猪粪堆肥。
8.如权利要求5所述制备方法获得的含类芽孢杆菌Lzh-N1的微生物肥料。
9.含有如权利要求1所述的类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48复合菌剂微生物肥料的制备方法，具体步骤如下：
(1)发酵液的制备
将类芽孢杆菌Lzh-N1的种子液接种于pH为7.0的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为4％(v/v)，在28℃、200rpm条件下发酵48h，同时将浑圆链霉菌zh-48的种子液接种于高氏一号液体培养基中，接种量为6％(v/v)，在28℃、200rpm条件下发酵48h，最后将类芽孢杆菌Lzh-N1发酵液和浑圆链霉菌Lzh-48发酵液按体积比4:1的比例混合即得类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48的混合发酵液；
所述浑圆链霉菌(Streptomyces globosus)Lzh-48保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13456，保藏日期为2016年12月15日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，命名为浑圆链霉菌Streptomyces globosus；
(2)复合菌剂微生物肥料的制备
将步骤(1)获得的发酵液与有机肥的体积质量比按1:20-30的比例混合，混匀后，进行固体发酵，发酵温度不超过50℃，发酵过程中每天翻堆2次，发酵5-6天后，当拮抗菌含量达到1×108cfu/g以上时，即得含有类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48复合菌剂微生物肥料。
10.如权利要求9所述的含有类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48复合菌剂微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵液与有机肥的体积质量比按1:25的比例。
11.如权利要求9或10任一所述的含有类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48复合菌剂微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述有机肥为猪粪堆肥。
12.如权利要求9所述制备方法获得的含有类芽孢杆菌Lzh-N1和浑圆链霉菌Lzh-48复合菌剂的微生物肥料。
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