CN114717155B - 一种用于防治党参根腐病的多粘类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种用于防治党参根腐病的多粘类芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物病害生物防治技术领域、微生物资源的开发与利用领域，具体涉及一种用于防治党参根腐病的多粘类芽孢杆菌及其应用，所述的多粘类芽孢杆菌YF对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)具有显著的抑制效果，抑菌率最高达到了73.08％；加入多粘类芽孢杆菌YF无菌滤液的孢子不能形成芽管，萌发率为4.5％，空白对照组的萌发率为95％，可以在抑制镰刀菌孢子萌发和/或菌丝生长中的应用；施用多粘类芽孢杆菌YF发酵液的地块存活率显著高于空白对照和阳性对照组，说明多粘类芽孢杆菌YF能够防治党参根腐病，可以在防治党参根腐病中应用。

Description

一种用于防治党参根腐病的多粘类芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域、微生物资源的开发与利用领域，特别涉及一种用于防治党参根腐病的多粘类芽孢杆菌及其应用。
背景技术
党参(Codonopsis pilosula)为桔梗科多年生草质藤本植物，以其干燥根入药，具有增强免疫力、扩张血管、抗溃疡、降压、增强造血功能等作用；因具有增强免疫作用的而作为中草药饲料添加剂，在我国养殖业当中广泛应用。我国党参资源丰富，由于其适宜多种生态环境，在山地、林缘、灌丛均可生长，分布在我国东北、华北及西北等各省，甘肃省是党参的著名产区，人工栽培面积逐年增加，也是我国党参的分布中心,定西、天水、陇南等地均有种植,约占全国总产量的60％。但是，由于党参连作障碍极其严重，导致的根腐病发病率极高，一旦发病病情很难控制，直至整株死亡。近年来，党参根腐病在定西市种植区普遍发生，并且呈逐年增加的趋势，尤其重茬种植的党参发病率更高。目前党参根腐病的防治主要以化学农药为主，2020年我们调查显示在实际的防治过程当中存在化学农药用药量大，但是效果并不理想，并且大量使用造成了土壤环境的污染和土壤微生物菌群的破坏，且农药残留问题严重。因此，党参根腐病的安全有效的防治是目前种植当中急需解决的问题。
通过植物病理学研究发现，对党参威胁最大的根腐病，主要是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的。专利CN111996130B公开了一种植物根腐病生防菌及其应用，所述生防菌命名为寡雄腐霉Pyo34-3，可以防治由大豆疫霉、终极腐霉、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和拟茎点霉等引起的植物根腐病；专利CN107318897A公开一种黄花蒿烟草醋液抑制三七根腐病原真菌的应用。在所述应用中，黄花蒿烟草醋液稀释25倍液至100倍液时，对三七根腐病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)抑制率达到79.17％～100％。随着绿色农业理念的发展，微生物菌剂防治各种病害逐渐的被人们青睐起来。但是对于党参根腐病的生物菌剂防治目前未有报道。
针对上述技术问题，本发明提供了多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在防治党参根腐病中的应用。
发明内容
本发明的首要目的是提供多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在抑制镰刀菌生长中的应用，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,联系电话为：010-64807355。
优选的，所述的镰刀菌为尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)。
本发明的第二目的是提供多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在抑制镰刀菌孢子萌发和菌丝生长中的应用，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,联系电话为：010-64807355。
优选的，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在发酵培养基上发酵培养，发酵培养条件为30～37℃，发酵时间：36～48h。
优选的，所述的发酵培养基配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，硫酸镁5g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙1g/L，pH为6.5～7.5。
本发明的第三目的是提供多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在防治党参根腐病中的应用，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,联系电话为：010-64807355。
优选的，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF防治党参根腐病的方法为：在党参栽种前用发酵液的稀释液进行浸根处理，待出苗后每个月用发酵液的稀释液喷施党参茎基部或滴灌在土壤中，用药3-4次。
本发明的第四目的是提供一种防治党参根腐病的微生物菌剂，所述的微生物菌剂含有所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF，于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,联系电话为：010-64807355。
优选的，所述的微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF的浓度为1×108-1×1010CFU/mL。
本发明的第五目的是提供所述的微生物菌剂的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)将所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF接种于液体培养基中培养，培养12h至OD600值为1时即为种子液；
(2)将步骤(1)得到的种子液接种于发酵培养基中扩大培养，种子液的接种量的体积比为3％，至发酵液中的菌体浓度达到1×109-1×1010CFU/mL，获得所述微生物菌剂。
本发明与现有技术相比的有益效果是：(1)本发明所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)具有显著的抑制效果，抑菌率最高达到了73.08％，稀释50倍发酵上清液稀释仍然具有明显的抑菌效果，抑菌率达到50.38％。(2)加入多粘类芽孢杆菌YF无菌滤液的孢子不能形成芽管，萌发率为4.5％，空白对照组的萌发率为95％，可以在抑制镰刀菌孢子萌发和/或菌丝生长中的应用；(3)施用多粘类芽孢杆菌YF发酵液的地块存活率显著高于空白对照和阳性对照组，说明多粘类芽孢杆菌YF能够防治党参根腐病，可以在防治党参根腐病中应用。
附图说明
图1为多粘类芽孢杆菌在培养基的菌落照片。
图2为多粘类芽孢杆菌对党参根腐病镰刀菌的抑菌效果。
图3为多粘类芽孢杆菌的基于16srDNA序列的系统发育树。
图4为多粘类芽孢杆菌YF对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)孢子萌发的抑制作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的保护范围并不受以下实施例的限制。
以下实施例所述的液体培养基的配方为：葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，硫酸镁5g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙1g/L，pH为6.5～7.5。
以下实施例所述的PDA培养基的配方为：马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。
以下实施例所述的LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。
实施例1、菌株的分离、纯化和鉴定
2019年9月20日从甘肃省定西市临洮县玉井镇养殖户羊粪堆肥采集样品，采用稀释涂布法对微生物分离纯化，称取样品10g加入装有90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，所得样品悬液稀释成10﹣1、10﹣2、10﹣3、10﹣4、10﹣5等不同稀释浓度，分别涂布在LB培养基上，每个稀释度重复次3次，于30℃培养箱倒置培养，挑取其中的单菌落进行平板划线纯化，得到纯菌株，在LB培养基上为圆形，突起，乳白色，粘稠状，不透明，表面湿润光滑边缘不整齐，具有很强的粘性，见图1，将其命名为YF。
将党参根腐病真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)用8mm打孔器制成菌饼接种于PDA培养基中央后，将得到的细菌纯培养用十字交叉法接种于菌饼2.5cm处对峙培养，于28℃培养4d，选取有明显抑菌带的菌株进行保藏，抑制效果见图2。
筛选拮抗效果好的菌株进行16srDNA分子生物学鉴定，确定菌株为多粘类芽孢杆菌，其分类命名为Paenibacillus polymyxa，基于16srDNA序列的系统发育树如图3所示，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF的16srDNA序列如SEQ ID No.1所示。
将筛选得到的菌株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21517，联系电话为：010-64807355。
以下实施例中，将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF，简写为多粘类芽孢杆菌YF。
实施例2、多粘类芽孢杆菌YF的抑菌效果测定
将实施例1分离得到的所述多粘类芽孢杆菌YF接种于液体培养基中培养48h，取发酵液用无菌滤膜过滤成无菌滤液后，加入凉至50℃PDA培养基中分别制成稀释倍数为10倍、50倍、100倍、150倍的固体平板，然后将尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)制成8mm的菌饼接种于该稀释梯度平板，以不加无菌滤液为对照。
结果如表1所示，可以看到多粘类芽孢杆菌YF对尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)具有显著的抑制效果，抑菌率最高达到了73.08％，稀释50倍发酵上清液稀释仍然具有明显的抑菌效果，抑菌率达到50.38％。
表1多粘类芽孢杆菌不同稀释倍数发酵液对尖孢镰刀菌的抑制
Figure BDA0003628976980000041
实施例3、多粘类芽孢杆菌YF对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制作用
在加2％蔗糖溶液的多粘类芽孢杆菌YF发酵无菌液中分别加入尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)孢子悬浮液(浓度为1×104个/mL)，置于载玻片上30℃保湿培养，以不加无菌滤液为对照，24h后观察各处理组的孢子萌发情况，计算萌发率。
镜检观察发现，加入多粘类芽孢杆菌YF无菌滤液的孢子不能形成芽管，萌发率为4.5％，空白对照组的萌发率为95％(图4)。
实施例4、田间试验防治党参根腐病的效果
分组及试验处理：将多粘类芽孢杆菌YF发酵液分别按照50倍、100倍、150倍进行稀释，并设空白对照及阳性对照(精甲·咯菌腈(先正达亮盾))每个处理设3个重复，每个处理小区30m2。
施药方法：党参栽种前用50倍、100倍、150倍稀释液进行浸根处理；以(精甲·咯菌腈(先正达亮盾))浸根处理为阳性对照，以不做任何处理党参为空白对照。待出苗后，处理组和阳性对照每月分别使用上述浓度的多粘类芽孢杆菌YF发酵液和(精甲·咯菌腈(先正达亮盾))喷施党参茎基部或滴灌在土壤中，直至党参收获统计党参存活率。
结果分析：实验结果如表2所示，可以看出，施用多粘类芽孢杆菌YF发酵液的地块存活率显著高于空白对照和阳性对照组，说明多粘类芽孢杆菌YF能够防治党参根腐病。
表2不同处理组党参存活率
Figure BDA0003628976980000042
综上所述，本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21517，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)具有显著的抑制效果，抑菌率最高达到了73.08％，稀释50倍发酵上清液稀释仍然具有明显的抑菌效果，抑菌率达到50.38％。加入多粘类芽孢杆菌YF无菌滤液的孢子不能形成芽管，萌发率为4.5％，空白对照组的萌发率为95％，可以在抑制镰刀菌孢子萌发和/或菌丝生长中的应用；施用多粘类芽孢杆菌YF发酵液的地块存活率显著高于空白对照和阳性对照组，说明多粘类芽孢杆菌YF能够防治党参根腐病，可以在防治党参根腐病中应用。
序列表
<110> 兰州交通大学
<120> 一种用于防治党参根腐病的多粘类芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 1
tgcagtcgag cggggttgat agaagcttgc ttctattaac ctagcggcgg acgggtgagt 60
aacacgtagg caacctgccc acaagacagg gataactacc ggaaacggta gctaataccc 120
gatacatcct attcctgcat gggagaagga ggaaagacgg agcaatctgt cacttgtgga 180
tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg acgatgcgta 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcaac gccgcgtgag 360
tgatgaaggt attcggatcg taaagctctg ttgccaggga agaacgtctt gtagagtaac 420
tgctacaaga gtgacggtac ctgagaagaa agcctcggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt agggggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540
ctctttaagt ctggtgttta atcccgaggc tcaacttcgg gtcgcactgg aaactgggga 600
gcttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatgt 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tgggctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag 720
cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgctag 780
gtgttagggg tttcgatacc cttggtgccg aagttaacac attaagcatt ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcagtggagt 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc cctctgaccg 960
gtctagagat agacctttcc ttcgggacag aggagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgagtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat gcttagttgc 1080
cagctagtca agctgggcac tctaagcaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtactac aatggccggt 1200
acaacgggaa gcgaaatcgc gaggtggagc caatcctaga aaagccggtc tcagttcgga 1260
ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaattgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttacaa 1380
cacccgaagt cggtgggtaa cccgcaagga gccagccggt gggtaaag 1428

Claims (8)

1.多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在非疾病治疗目的的抑制镰刀菌生长中的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话为：010-64807355，所述的镰刀菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus  polymyxa)YF在发酵培养基上发酵培养，发酵培养条件为30～37℃，发酵时间：36～48h。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，硫酸镁5g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙1g/L，pH为6.5～7.5。
4.多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在非疾病治疗目的的抑制镰刀菌孢子萌发和/或菌丝生长中的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus  polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话为：010-64807355，所述的镰刀菌为尖孢镰刀菌(Fusarium  oxysporum)。
5.多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在防治党参根腐病中的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话为：010-64807355。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus  polymyxa)YF防治党参根腐病的方法为：在党参栽种前用发酵液的稀释液进行浸根处理，待出苗后每个月用发酵液的稀释液喷施党参茎基部或滴灌在土壤中，用药3-4次。
7.一种防治党参根腐病的微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂含有多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF，于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所, 联系电话为：010-64807355，所述的微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF的浓度为1×108-1×1010CFU/mL。
8.如权利要求7所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
（1）将所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF接种于液体培养基中培养，培养12h至OD600值为1时即为种子液；
（2）将步骤（1）得到的种子液接种于发酵培养基中扩大培养，种子液的接种量的体积比为3%，至发酵液中的菌体浓度达到1×109-1×1010CFU/mL，获得所述微生物菌剂。
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