CN115975847B - 一种用于防治当归根腐病的特基拉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物病害生物防治技术领域、微生物资源的开发与利用领域，具体涉及一种用于防治当归根腐病的特基拉芽孢杆菌及其应用，所述的特基拉芽孢杆菌SY89于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24998；对燕麦镰刀菌具有显著的抑制效果；可以在抑制镰刀菌孢子萌发和/或菌丝生长中的应用；抑制燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)产恩镰孢菌素和/或降解恩镰孢菌素，说明特基拉芽孢杆菌SY89能够防治当归根腐病，可以在防治当归根腐病中应用。
Description
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域、微生物资源的开发与利用领域，特别涉及一种用于防治当归根腐病的特基拉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels，为伞形科(Apiaceae)多年生草本植物，主要分布于甘肃省，广泛用于免疫系统、造血系统、心血管系统、中枢神经系统等方面，致使当归的经济价值得到提升，有广阔发展前景。但是，由于当归连作障碍极其严重，导致的根腐病发病率极高，一旦发病病情很难控制，初始阶段叶片会因水分流失而蜷缩下垂，后期叶片伏于地面，茎和根变为褐色，并逐渐腐烂呈现湿腐状，有当归腐烂臭味，直至整株死亡。近年来，当归根腐病普遍发生，并且呈逐年增加的趋势，尤其重茬种植的当归发病率更高。通过植物病理学研究发现，对当归威胁最大的根腐病，主要是由镰刀菌引起的。镰刀菌所产生的恩镰孢菌素(enniatins，ENNs)属于六酯肽类真菌毒素，恩镰孢菌素对大多数对植物生理有影响，帮助病原菌侵染并在寄主植物上成功定殖和繁殖，造成植物枯萎和坏死。病害从春季开始，夏季达到高峰，阻碍根系的生长，造成维管组织坏死，最终导致植株萎蔫死亡。
目前当归根腐病的防治方法如下：选用健壮无病种苗移栽，移栽前用1：1：150的波尔多液浸泡10～15分钟，晾干栽植。或育苗时用多菌灵、托布津按种子重量的0.3～0.5％拌种。及时拔除病株，集中烧毁。病穴中施一撮石灰粉，并用50％退菌特600～1000倍液或50％托布津800～1000倍液全面喷洒病区，以防蔓延。但是，现有防治主要以化学农药为主，但是由于长期使用导致的抗药性增强，效果并不理想，并且大量使用造成了土壤环境的污染和土壤微生物菌群的破坏，且农药残留问题严重。因此，当归根腐病的安全有效的防治是目前种植当中急需解决的问题。
针对上述技术问题，本领域的研究人员也做了诸多研究，例如专利CN112625948B公开了一株具有固氮功能的特基拉芽孢杆菌S1及其在堆肥中的应用；专利CN106701624B公开了一株拮抗枸杞根腐病的特基拉芽孢杆菌；专利CN111690566A公开了一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)D5-8，并提供了特基拉芽孢杆菌D5-8在防止粮食霉变中的应用。随着绿色农业理念的发展，微生物菌剂防治各种病害逐渐的被人们青睐起来。但是对于防治当归根腐病的特基拉芽孢杆菌菌剂目前未有报道。
发明人在研究过程中，意外的分离得到了一株特基拉芽孢杆菌，所述的一株特基拉芽孢杆菌能够促进植物生长，防治当归根腐病，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的首要目的是提供一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89，于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24998，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,联系电话为：010-64807355。
本发明的第二目的是提供病原菌抑制剂，所述的病原菌抑制剂含有所述的特基拉芽孢杆菌SY89，所述的病原菌抑制剂对根腐病原病菌具有抑制作用。
优选的，所述的根腐病病原菌为镰刀菌。
优选的，所述的镰刀菌为燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)。
本发明的第三目的是提供病害抑制剂，其特征在于，所述的病害抑制剂含有所述的特基拉芽孢杆菌SY89，所述的病害为当归根腐病。
优选的，所述的病原菌抑制剂或所述的病害抑制剂，含有特基拉芽孢杆菌SY89的浓度为1×108-1×1010CFU/mL。
本发明的第四目的是提供所述的特基拉芽孢杆菌SY89在抑制镰刀菌生长中的应用。
本发明的第五目的是提供所述的特基拉芽孢杆菌SY89在抑制镰刀菌孢子萌发和/或菌丝生长中的应用。
优选的，所述的镰刀菌为燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)。
本发明的第六目的是提供所述的特基拉芽孢杆菌SY89在抑制燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)产恩镰孢菌素和/或降解恩镰孢菌素中的应用。
优选的，所述的恩镰孢菌素包括恩镰孢菌素A、恩镰孢菌素A1、恩镰孢菌素B和恩镰孢菌素B1中的一种或几种。
本发明的第七目的是提供所述的特基拉芽孢杆菌SY89在防治药用植物根腐病中的应用。
优选的，所述的药用植物为当归。
本发明与现有技术相比的有益效果是：(1)本发明所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89对燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)具有显著的抑制效果，抑菌率最高达到了70.22％；(2)加入特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89无菌滤液的燕麦镰刀菌孢子不能形成芽管，萌发率抑制率达到90％，可以在抑制镰刀菌孢子萌发和/或菌丝生长中应用；(3)所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89对当归根腐病菌燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)中的毒素恩镰孢菌素B具有较好的抑制作用，抑制率为77.64％；特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89可以降解恩镰孢菌素B，且降解率随着时间的显著提升，最高达到76.03％，说明特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)SY89对恩镰孢菌素B具有较好的降解作用；(4)特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)SY89可分泌伊枯草菌素、泛革素、表面活性素、聚酮合酶和非核糖体多肽合酶等脂肽类物质，对当归根腐病菌燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)具有较好的拮抗作用，并且可使病原菌菌丝皱缩断裂；(5)施用特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89发酵液的当归苗病情指数显著低于空白对照和阳性对照，说明特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)SY89能够防治当归根腐病，可以在防治当归根腐病中应用。
附图说明
图1为特基拉芽孢杆菌SY89基于16s rDNA序列的系统发育树。
图2为特基拉芽孢杆菌SY89对当归根腐病燕麦镰刀菌的抑菌效果。
图3为特基拉芽孢杆菌SY89对当归根腐病镰刀菌的菌丝抑制情况扫描电镜图。
图4为特基拉芽孢杆菌SY89对燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)中恩镰孢菌素B的抑制效果。
图5为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89的抑菌物质PCR鉴定。
图6为特基拉芽孢杆菌SY89预防及治疗当归根腐病的效果统计。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的保护范围并不受以下实施例的限制。
以下实施例中所述的富集培养基的配方为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母膏5g/L，pH为6.5～7.5。
以下实施例中所述的LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。
以下实施例中所述的PDA培养基的配方为：马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。
实施例1、菌株的分离、纯化和鉴定
2020年10月20日从甘肃省定西市渭源县会川镇当归种植区采集土壤样品，采用稀释涂布法对微生物分离纯化，称取样品1g加入装有9mL无菌水稀释成10﹣1、10﹣2、10﹣3、10﹣4、10﹣5等不同浓度，涂布于LB固体培养基，于30℃培养箱倒置培养，挑取单菌落平板划线纯化，得到纯菌株。筛选拮抗效果好的菌株命名为SY89。菌落呈不规则形态，边缘光滑湿润，不透明，微黄色，菌体杆状，呈革兰氏阳性。通过16s rDNA分子生物学鉴定，确定菌株为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，基于16s rDNA序列的系统发育树如图1所示，所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89的16s rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
将筛选得到的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89于2022年06月02日在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.24998，联系电话为：010-64807355。
以下实施例中，将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89，简写为特基拉芽孢杆菌SY89。
实施例2、特基拉芽孢杆菌SY89的抑菌效果测定
将特基拉芽孢杆菌SY89在LB固体培养基培养24h后，接种于以当归根腐病病原菌燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)为中心的PDA培养基的三边，计算抑制率并使用扫描电镜观察菌丝生长情况。培养条件为：温度为28℃，培养时间为5天。
实验结果如图2和3所示，特基拉芽孢杆菌SY89对当归根腐病菌燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)具有较好的抑制作用，抑菌率为75.59％，并且可使病原菌菌丝皱缩断裂。
实施例3、特基拉芽孢杆菌SY89对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制作用
将特基拉芽孢杆菌SY89无菌滤液(100％、60％和20％(V:V)，用无菌水稀释)与菌燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)孢子悬浮液以1:1(V:V)的比例混合(最终含量为PDA中的无菌滤液分别为50％、30％和10％)。将不含特基拉芽孢杆菌SY89无菌滤液的LB液体培养基与菌燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)孢子悬液按与空白对照相同的比例混合。将混合物在凹形载玻片上于28℃培养。10h和24h后观察孢子萌发情况，计算萌发抑制率(表1)。
实验结果如表1所示，特基拉芽孢杆菌SY89无菌滤液可以很好的抑制燕麦镰刀菌孢子的萌发，抑制率达到90％以上。
表1培养滤液对燕麦镰刀菌孢子萌发的影响
实施例4、特基拉芽孢杆菌SY89抑制恩镰孢菌素B效果测定
将实施例1分离得到的特基拉芽孢杆菌SY89接种到已灭菌的富集培养基中，摇床震荡培养，使用无菌水稀释到1×108CFU/mL，所述的培养条件为：温度为30-37℃，转速为150-180rpm，培养时间为36-48h；将其以10％v/v的接种量接种到100mL恩镰孢菌素B的产生菌燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)发酵液中共培养，培养条件为：温度为28℃，转速为150-180rpm，培养时间为10天；培养基中恩镰孢菌素B使用高效液相色谱(HPLC)测定，分析抑制效果。HPLC检测恩镰孢菌素B的具体检测条件为：安捷伦C18柱的尺寸为250mm×4.6mm，5μm，流动相为乙腈/水(v/v)为7:3，流速为1mL/min，进样体积为10μL，激发波长为210nm。以不接种特基拉芽孢杆菌SY89的燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)发酵液为对照。
实验结果如图4所示，A为恩镰孢菌素B标准曲线，B为对照组液相色谱图，C为接种特基拉芽孢杆菌SY89的液相色谱图，根据峰面积及标准曲线计算得出，特基拉芽孢杆菌SY89对当归根腐病菌燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)中的毒素恩镰孢菌素B具有较好的抑制作用，抑制率为77.64％。
实施例5、特基拉芽孢杆菌SY89降解恩镰孢菌素B效果测定
将实施例1中培养的特基拉芽孢杆菌SY89以10％(v/v)的接种量接种到含有20μg/mL恩镰孢菌素B的无机盐M9培养基中培养，培养条件为：温度为25℃，转速为150-180rpm，培养时间为10天；在第3、7、10天取样使用高效液相色谱(HPLC)测定恩镰孢菌素B残留，分析降解效果。以20μg/mL恩镰孢菌素B标准品为对照。HPLC检测恩镰孢菌素B的具体检测条件同实施例2。
实验结果如表2所示，特基拉芽孢杆菌SY89可以降解恩镰孢菌素B，且降解率随着接种时间增长显著提升，最高达到76.03％，说明特基拉芽孢杆菌SY89对恩镰孢菌素B具有较好的降解作用。
表2特基拉芽孢杆菌SY89对恩镰孢菌素B的降解效果
实施例6、特基拉芽孢杆菌SY89抑菌物质鉴定
采用含菌液1.5μL、引物1μL、标准缓冲液12.5μL2×主混合液和无菌无酶水10.5μL的25μL反应液测定特基拉芽孢杆菌SY89菌株抑菌物质基因。引物序列由上海生工生物技术公司合成，采用PCR扩增方案鉴定。PCR扩增子在1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳分析，并使用2kb的分子标记确定条带的大小。
实验结果如图5所示，特基拉芽孢杆菌SY89可分泌伊枯草菌素、泛革素、表面活性素、聚酮合酶和非核糖体多肽合酶等脂肽类物质。
实施例7、特基拉芽孢杆菌SY89对当归根腐病的防治作用
当归根用消毒液冲洗，表面用5％次氯酸钠去污3min，用无菌蒸馏水冲洗，室温风干。将消毒后的当归根用75％乙醇消毒过的针表面损伤。在治疗组中，采用针刺法将浓度为105CFU/mL(1mL)的致病孢子接种到当归根中，然后在0h、12h、24h和48h后加入108CFU/mL(1mL)的特基拉芽孢杆菌SY89的发酵液。预防组的病原菌孢子接种顺序与拮抗菌接种顺序颠倒。接种后的当归根置于灭菌培养皿(18cm)中，放置湿滤纸(以保持高湿度)，并用保鲜膜覆盖。培养皿置于25℃培养箱。
实验结果如图6所示，预防组接种48h后，预防效果最好，达到70.45％。在治疗组中，同时接种病原菌和特基拉芽孢杆菌SY89疾病指数最低，防治效果最好，达到59.33％。
综上所述，本发明所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89对燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)具有显著的抑制效果，抑菌率最高达到了70.22；加入特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89无菌滤液的孢子不能形成芽管，萌发率抑制率达到90％，可以在抑制镰刀菌孢子萌发和/或菌丝生长中的应用；所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89对当归根腐病菌燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)中的毒素恩镰孢菌素B具有较好的抑制作用，抑制率为77.64％；特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)SY89可以降解恩镰孢菌素B，且降解率随着时间的显著提升，最高达到76.03％，说明特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89对恩镰孢菌素B具有较好的降解作用；特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89可分泌伊枯草菌素、泛革素、表面活性素、聚酮合酶和非核糖体多肽合酶等脂肽类物质，对当归根腐病菌燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)具有较好的拮抗作用，并且可使病原菌菌丝皱缩断裂；施用特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89发酵液的当归苗病情指数显著低于空白对照和阳性对照，说明特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89能够防治当归根腐病，可以在防治当归根腐病中应用。
Claims (7)
1.一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89，其特征在于，于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24998。
2.病原菌抑制剂，其特征在于，所述的病原菌抑制剂含有权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌SY89，所述的病原菌抑制剂对根腐病病原菌镰刀菌具有抑制作用。
3.如权利要求2所述的病原菌抑制剂，其特征在于，含有特基拉芽孢杆菌SY89的浓度为1×108-1×1010CFU/mL。
4.如权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌SY89在抑制燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)生长中的应用。
5.如权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌SY89在抑制燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)孢子萌发和/或菌丝生长中的应用。
6.如权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌SY89在抑制燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)产恩镰孢菌素B和/或降解恩镰孢菌素B中的应用。
7.如权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌SY89在防治药用植物根腐病中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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