KR20150003061A - 인삼 뿌리썩음 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 신규한 바실러스 속 am-1058 균주 및 그 배지 조성물 - Google Patents

인삼 뿌리썩음 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 신규한 바실러스 속 am-1058 균주 및 그 배지 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인삼 재배시 주요 병원균으로 발병되는 인삼뿌리썩음병원균에 대해 항진균활성을 갖는 길항미생물 바실러스 속 AM-1058(KCTC-12420BP) 균주 및 이를 포함하는 인삼뿌리썩음병 방제용 미생물제제를 이용하여 인삼 재배 시 발병되는 병원균 방제에 관한 것으로, 본 발명은 토양으로부터 분리된 길항미생물 바실러스 속 AM-1058(KCTC-12420BP)이 Cylindrocarpon destuctans, Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Serratia marcescens 4종의 인삼뿌리썩음병원균에 대해 높은 항진균활성과 인삼 생육시 뛰어난 생육적 친화력을 가지며 최적화된 대량배양용 배지 및 넓은범위의 pH와 높은 온도에서의 생육의 가능과 항진균 활성을 나타내었다.
보다 더 자세한 것으로 길항미생물 바실러스 속 AM-1058(KCTC-12420BP) 균주 및 포자 또는 제형 혼합물이 포함된 미생물제제를 이용 인삼뿌리썩음병을 발병시키는 병원균에 대한 방제성이 지속적이며 환경오염의 문제가 없는 친환경 미생물제제에 관한 것이며 인삼의 연작 또는 경작 예정지 및 경작 중인 인삼의 뿌리썩음병을 개선하기 때문에 향후 인삼 경작에 필요한 미생물제제로 친환경농업의 농자재로 사용할 수 있다.

Description

인삼 뿌리썩음 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 신규한 바실러스 속 AM-1058 균주 및 그 배지 조성물{Novel microorganism of Bacillus sp. AM-1058 strain with antifungal activity againt Ginseng Root Rot pathogens and its culture medium of the same}
본 발명은 인삼뿌리썩음병에 대한 항진균활성을 갖는 바실러스 속 AM-1058(Bacillus sp. AM-1058)(KCTC-12420BP) 균주 및 그 배양액의 용도에 관한 것이다.
인삼(Ginseng)의 뿌리썩음병은 병원균으로 하여금 토양에 묻혀있는 뿌리부위를 가해하므로 공기전염성 병해의 국부적인 병반과는 달리 식물 전체를 죽게하는 전신감염성의 병해적 특성을 나타내며 토양전염성 병원균으로 대부분의 생활을 토양에서 완성하는 토양 서식 병원균으로서 토양 내 혹독한 환경에서도 견딜 수 있는 후막포자와 같은 내구체를 형성함에 따라 효과적 방제 어려움이 있다(Shin. et al., 2012, Kor . J. Soil Sci . Fert ., 45(3): 370-376; Lee, 2004, Res . Plant Dis . 10(4): 248-259).
토양 속에 있는 지하부 또는 토양을 대상으로 방제한다는 것은 약제의 시용방법, 침투력, 효율성 및 경제적인 면에서 많은 어려움 있으며 지속적인 토양소독제의 시용은 토양생태계의 파괴 및 환경오염, 농약의 잔류독성으로 인한 식품 안전성의 문제를 비롯해 처리비용이 많이 든다는 문제 등으로 인하여 사용이 제한되고 있다. 따라서 친환경적 인삼뿌리썩음병의 방제대책으로 생물학적인 병 방제 전략 탐구와 함꼐 일차적으로 경작지 토양에서의 뿌리 썩음병 발병조건 및 병원성 원인균의 밀도를 개선하는 것이 중요하고(Chung et al ., 2006, Kor . J. Medicinal Corp Sci. 14:202-205; Kim et al ., 1997. Plant Pathol. J. 13: 342), 생물학적 방제 시 목적에 맞는 적합한 유용 길항미생물인가의 여부, 선발된 길항미생물의 처리법, 길항미생물의 토양 내에서 생태적인 특성, 작물과의 상호관계 등의 정확한 조사가 필요하다.
2003년 이후 국내 인삼재배 면적은 매년 지속적으로 증가(19,010ha - 2010년, 인삼통계자료집)되고 있으나 경쟁력 강화를 위한 친환경 안전재배기술 개발 미흡하며 소비자는 더 안전한 인삼을 요구하고 있으나 농가는 유기재배와 GAP재배를 기피, 안전한 인삼생산을 위해서는 농약잔류가 문제가 되지 않는 확립된 친환경 인삼재배기술이 필요하다. 재배특성상 경종적 방법만으로는 효과적 방제가 불가능하며 현재 인삼재배에 등록된 30여개 농약 중 재배 기간 중(본포) 뿌리썩음병 방제로 사용할 농약이 전무(6년생 초작지 1,651억원 피해)하다. 인삼은 한 장소에서 4-6년동안 재배가 되므로 연작에 대한 병해 발생 가능성이 매우 높으며, 연작으로 인한 병해는 Cylindrocarpon destructans , Fusarium solani , Phytophthora cactorum , Erwina cartovora , Pseudomonas fluorescens 등에 위한 병해가 단독으로 또는 복합적으로 작용하고 있다고 보고 되어 있다(Shin. et al., 2012, Kor . J. Soil Sci . Fert ., 45(3): 370-376; Lee et al ., 2006, Kor . J. Medicinal Crop Sci . 14: 78-79; Chung, 1997, Reptr . Tottori Mycol . Inst . 12: 127-138).
홍삼 소비 증가로 고년근(6년근) 생산 재배농가(2,136ha - 2010년, 인삼통계자료집)가 증가되고 있으나 오랜 재배 기간에 따른 뿌리썩음병 발병으로 안전성이 확보된 재배환경 개선 필요하며(홍삼포 중도 폐포율 30~60%-풍기인삼시험장), 인삼의 품목별 총 수출량이 매년 조금씩 증가(수출량 3,298톤 - 2010년, 인삼통계자료집)하고 있으나 친환경 안전재배기술에 의한 수출제한 요소인 농약잔류 문제해결 시 수출증대 가능하다. 인삼병 방제 연구는 세계적으로 인삼종주국으로 알려진 우리나라가 가장 활발하며 인삼에 대한 생물학적 방제도 1978년 토양 중 길항균을 증식시키는 방법을 발표하였다. 인삼병해의 생물학적 방제에 관한 본격적 연구는 1980년도에 한국인삼연초연구소에서 연구를 시작하였고 1931년에 3개의 사상균, 2개의 세균을 혼합한 동결건조제품을 상품화 하였으나 시장에는 출시되지 않았다. 인삼뿌리썩음병의 생물학적 방제는 Cylindrocarpon destructans , Botrytis cinerea에 의한 뿌리썩음병 방제균으로 Bacillus sp.를 이용한 연구들이 보고있으나 생물인 묘삼에 대한 연구는 미미한 실정이다(Kim et al., 2012. J. Pestic . Sci. 16(2):178-186; Kang et al., 2012. J. Pestic . Sci . 16(4):357-363). 또한 2012년 Streptomyces sp. 계통이 선발되었으나 아직 실용화된 것이 없다(Kim et al., 2012. Kor . J. Mycol . 40(1):44-48).
현재 식물병해에 대한 길항미생물을 이용한 미생물농약은 총 20여종 이상 품목 등록되어여 있으며, 이들 중 대부분은 바실러스속(Bacillus sp.)의 균주를 이용한 미생물농약이 대부분을 차지하고 있으며 대상작물로는 시설작물(고추, 오이, 가지)에 한정되어져 있고 탄저병, 흰가루병, 역병, 잿빛곰팡이병 등 일부 식물병원균에 대해서만 적용되고 있다. 미생물제제 개발 기술의 경우 국외기술과 비교해 제제화 및 생물활성 평가기술 이외에는 경쟁력이 다소 낮은 편이다.
이에 본 발명자들은 고소득 다년생 작물인 인삼에 대하여 다양한 병원성을 갖는 미생물들을 효과적으로 방제할 수 있도록 이들 병원성 미생물들에 대하여 우수한 항진균 활성을 보이는 길항미생물 토양으로부터 탐색분리한 결과 신규한 바실러스 속 AM-1058(Bacillus sp. AM-1058)(KCTC-12420BP) 균주를 확보하여, 동정하고 그 대량배양을 최적화함으로써 인삼뿌리썩음병을 발생시키는 주요 식물병원균Cylindrocarpon destuctans, Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Serratia marcescens 등의 방제용 친환경 미생물제제를 제조하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인삼뿌리썩음병을 발생시키는 Cylindrocarpon destuctans, Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Serratia marcescens 등 주요 식물병원균에 대한 항진균활성을 가지는 신규한 바실러스 속 AM-1058 균주(Bacillus sp. AM-1058)(KCTC-12420BP)의 분리, 동정 및 상기 균주의 배지를 최적화함으로써 인삼뿌리썩음병 방제용 친화경 미생물제제를 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 Bacillus sp.(KCTC-12420BP)균주의 분리 동정하는 단계와; 상기 균주의 형태학적 특성을 조사하는 단계와; 상기 균주와 이를 포함한 배양액을 이용한 인삼 병원균에 대한 생육저지 효과를 측정하는 단계와; 본 발명 균주의 대량 배양을 위한 배지의 최적화 단계와; 본 발명 균주와 이를 포함한 배양액의 인삼 뿌리썩음병의 방제효과를 실험하고 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명은 인삼 뿌리썩음 방지에 유용한 Bacillus속 길항 미생물 균주를 제공하는 효과가 있을 뿐 아니라 이를 포함한 배양액의 친환경 미생물제제를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 발명 바실러스 속 AM-1058 균주(Bacillus sp. AM-1058)(KCTC-12420BP)의 16S rRNA 유전자 분석 결과이다.
도 2는 본 발명 바실러스 속 AM-1058 균주(Bacillus sp. AM-1058)(KCTC-12420BP)의 주사전자현미경 사진이다.
도 3은 본 발명 바실러스 속 AM-1058 균주(Bacillus sp. AM-1058)(KCTC-12420BP) 및 이를 포함한 배양액을 이용한 Cylindrocarpon destuctans, Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Serratia marcescens 4종의 인삼뿌리썩음병원균에 항진균 활성을 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명 인삼 뿌리썩음병에 대해 항진균활성이 있는 바실러스 속 AM-1058(Bacillus sp. AM-1058)(KCTC-12420BP)의 대량배양 배지에서의 D.C.W 측정 및 pH값을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명 인삼 뿌리썩음병에 대해 항진균활성이 있는 바실러스 속 AM-1058 균주(Bacillus sp. AM-1058)(KCTC-12420BP)의 묘삼에 대한 이병율 및 방제율에 대한 결과를 보인 그래프이다.
도 6은 본 발명 인삼 뿌리썩음병에 대해 항진균활성이 있는 바실러스 속 AM-1058 균주(Bacillus sp. AM-1058)(KCTC-12420BP)의 생물검증에 대한 결과이다.
이하, 본 발명을 신시예에 따라 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 권리범위를 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.
< 실시예 1> Bacillus sp .( KCTC -12420BP)균주의 분리 동정
인삼의 병원균의 병해와 생장을 억제시키는 길항미생물을 선발하기 위해 인삼 재배 경작지 토양으로부터 균원 시료를 사용하였으며, 균원시료 1 g 멸균 생리식염수 9 mL에 현탁하여 10진 희석법으로 희석하고, 103, 104의 희석액 0.1 mL을 MA(Malts extract agar), LB(Luria-Bertani agar) 및 NA(Nutrient agar) 한천 복합배지에 도말접종하여, 30℃에서 2일간 배양하여 단일 콜로니의 미생물을 분리하였다. 순수 분리한 균주들 중 인삼 주요 식물병원균을 방제할 수 있는 균주를 선발하기 위하여 각각의 분리 균주를 MB(Malts extract broth), LB(Luria-Bertani broth) 및 NB(Nutrient broth) 액체배지에 30℃, 180rpm으로 2일간 배양 후 균주의 배양상등액을 8 mm paper disc에 100 uL를 점적하여 건조한 후 PDA(Potato dextrose agar)에 인삼뿌리썩음병, 점무늬병, 역병, 모잘록병, 잿빛곰팡이병과 대치배양하여 균사생장을 억제력이 가장 우수한 균주를 최종선발 하였다. 길항세균의 분류학적 동정을 위해 16S rRNA sequencing을 통하여 동정하였으며, 총 분석길이 1421bp의 염기서열을 분석하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 분리 균주의 염기서열을 바탕으로 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Blast 프로그램을 이용하여 공지 균주들과 염기서열을 비교하였다.
비교 결과 본 발명의 균주는 바실러스 근연종이지만 신규한 것으로서 이를 2013년 6월 17일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 특허 균주로 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12420BP를 부여받았다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC12420
수탁일자 : 20130612
<실시예 2> 본 발명 Bacillus속 균주의 전자현미경을 이용한 형태학적 특성
길항미생물인 바실러스 속 AM-1058 균주의 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 형태학적 특성을 확인한 결과 도 2에서 보는 바와 같이 바실러스의 전형적 막대 형태를 보였다.
<실험예 1> 본 발명 균주와 이를 포함한 배양액을 이용한 인삼 병원균에 대한 생육저지효과
본 발명 식물병원균에 대한 길항미생물인 바실러스 속 AM-1058(Bacillus sp. AM-1058) 균주가 생산하는 항진균성 활성물질에 의한 식물병원균 생육의 항진균활성 정도를 측정하기 위해 먼저 PDA 평판배지에 인삼 병원균 배양 절편(8mm)를 올려 21℃에서 3일간 병원균을 1차 배양하여, paper disc diffusion방법을 이용하여 본 발명 균주인 바실러스 속 AM-1058(Bacillus sp. AM-1058) 균주 배양액을 paper disc(mm)에 100 uL를 점적한 후 인삼 병원균 배양 PDA 평판배지에 올려 놓고 21℃에서 5일간 2차 배양을 하였다. 길항 미생물이 인삼 식물병원균에 항진균 활성은 균사의 생육 저해 거리를 조사하였다.
조사결과 [표 1]과 [표 2]에서 보는 바와 같이 인삼식물병원균에 항진균활성이 조사되었으며, 특히 인삼 뿌리 썩음병 5종에 대해서 모두 항진균 활성을 보이는 것으로 나타났다.
인삼 식물병원균 항진균력
잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea) ++
시들음병(Fusarium oxysporum f. sp.) +
모잘록병(Fusarium roseum) +++
역병(Phytophthora cactorum) ++++
점무늬병(Cladosporium sp.) ++++
균핵병(Sclerotinia sclerotiorum) +
흑색썩음병(Stromatinia narcissi) ++++
인삼 뿌리썩음병 항진균력
Cylindrocarpon destructans ++++
Fusarium moniliforme ++
Fusarium solani +
Serratia marcescens ++++
*항진균활성 정도: -: 0mm, +: 1~3:, ++: 3~5, +++: 5~7, ++++: 7~9.
<실험예 2> 본 발명 균주의 대량 배양을 위한 배지의 최적화
본 발명 길항미생물인 바실러스 속 AM-1058(Bacillus sp. AM-1058) 균주를 10 L 용기에서 대량배양을 수행하였으며, 본 발명에 따르면, 대량생산을 위하여 대량배양용 생산배지로는 CSL(corn steep liquor) 1%, CSL 1% + 1% Glucose, CSL 0.5%, CSL + 0.5% Glucose의 배지를 이용하여 길항균주를 접종(O.D 0.3, 접종 seed 량 3%)하고 30℃, 130rpm으로 진탕배양하여 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72hr 간격으로 sampling하여 D.C.W 측정 및 pH값을 측정하였다.
실험결과 도 4에 나타낸 바와 같이 최적화된 대량배양용 생산배지 조성은 1%(v/v) CSL + 1%(w/v) glucose를 이용하여 배양한 배지에서 길항미생물의 균체량 증가와 항진균 활성이 좋은 것으로 나타났다.
<실험예 3> 본 발명 균주 및 이를 포함한 배양액의 인삼 뿌리썩음병에 대한 방제효과
본 발명 바실러스 속 AM-1058 균주 및 이를 포함한 배양액의 묘삼에서 직접적인 인삼 뿌리썩음병에 대한 방제효과 여부를 확인하였다. 묘삼을 멸균된 증류수를 사용하여 1차 세척 후 3% 차염소산나트륨을 사용하여 한 번 더 세척 후, 70% 알코올을 적신 솜으로 닦은 후 UV등에서 약 10분간 조사 살균한 후 실험에 사용하였다. 묘삼에 뿌리썩음병균 접종시키기 위하여 1회용 주사기를 사용하여 상처를 낸 다음 본 발명 균주와 이를 포함한 각각의 배양액(250배 희석액, 1000배 희석액)과 뿌리썩음병원균 포자 현탁액 (106 cfu/mL)을 반응 시킨 후 대조구(DW), 감염구(병원균포자현탁액), 처리구(병원균포자현탁액+길항미생물 배양액), 양성대조구(화학농약+병원균포자현탁액)별로 처리하여, 화분에서 30일간 생육 후 병원균의 발병력 및 발병억제력을 확인하였다.
병발병 억제력 (%) = [(길항미생물 무처리구 발병률-길항미생물 처리구 발병률)/길항미생물 무처리구 발병률]
실험 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 본 발명 균주를 처리하지 않은 대조구에서는 시간이 지날수록 인삼뿌리썩음병이 발병하여 발병율이 90%로 높게 나타났으며, [표 3] 내지 [표 4]에 나타낸 바와 같이 처리구는 화학농약과 대등한 방제율 60%로 나타났다. 또한 도 6에 나타낸 바와 같이 묘삼을 조사한 결과 무처리구에서는 뿌리 썩음으로 인해 지상부의 생육 억제와 지하부의 뿌리썩음을 확인 할 수 있었으며, 처리구에서는 지상부 및 지하부의 생육이 정상으로 성장하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명 균주와 이를 포함한 배양액은 친환경 농약 소재로 이용할 수 있을 것으로 확인되었다.
1주
처리구 희석 발병율(%) 방제율(%) 비교
물처리 0 - 오염확인구
병원균처리 10 - 길항미생물 무처리구 발병율
바실러스 속 AM-1058
+ 병원균처리		 10 90 길항미생물 처리구 발병율
바실러스 속 AM-1058
+ 화학농약		 ,000 0 100
2주
처리구 희석 발병율(%) 방제율(%) 비교
물처리 0 - 오염확인구
병원균처리 30 - 길항미생물 무처리구 발병율
바실러스 속 AM-1058 + 병원균처리 30 70 길항미생물 처리구 발병율
바실러스 속 AM-1058 + 화학농약 ,000 30 70
3주
처리구 희석 발병율(%) 방제율(%) 비교
물처리 0 - 오염확인구
병원균처리 90 - 길항미생물 무처리구 발병율
바실러스 속 AM-1058 + 병원균처리 30 70 길항미생물 처리구 발병율
바실러스 속 AM-1058 + 화학농약 ,000 40 60
4주
처리구 희석 발병율(%) 방제율(%) 비교
물처리 0 - 오염확인구
병원균처리 90 - 길항미생물 무처리구 발병율
바실러스 속 AM-1058 + 병원균처리 40 60 길항미생물 처리구 발병율
바실러스 속 AM-1058 + 화학농약 ,000 40 60
<110> andong national university industry-academic cooperation foundation <120> Novel microorganism of Bacillus sp. AM-1058 strain with antifungal activity againt Ginseng Root Rot pathogens and its culture medium of the same <130> 2013-0628 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1421 <212> RNA <213> Bacillus sp. AM-1058 <400> 1 tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60 acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120 atggttgtyt gaacygcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180 ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240 ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300 ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360 gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420 gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540 tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600 aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660 tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720 gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780 agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840 gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960 tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080 ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200 caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260 gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380 cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg a 1421

Claims (5)

  1. 서열목록 1의 유전자 염기서열을 가지며 인삼 뿌리썩음 병원균에 항진균 활성이 있는 길항미생물 바실러스 속(Bacillus sp.) AM-1058(KCTC-12420BP) 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 병원균은 Cylindrocarpon destuctans , Fusarium moniliforme , Fusarium solani, Serratia marcescens 중 어느 하나인 것이 특징인 균주.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 바실러스 속 AM-1058의 점무늬병 유발균Cla dosporium sp.속 균주, 모잘록병 유발균 Fusarium roseum 균주, 잿빛곰팡이병 유발균 Botrytis cinerea 균주, 역병 유발균 Phytophthora cactorum 균주 중 어느 하나의 식물병원균에 대하여 항진균활성을 가지는 길항미생물 바실러스 속 AM-1058(KCTC-12420BP) 균주 또는 이를 포함한 배양액.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 배지는 1% CSL에 1% glucose를 함유하는 것이 특징인 배지조성물.
  5. 제 3항 기재의 바실러스 속 AM-1058(KCTC-12420BP) 균주 또는 이를 포함한 배양액을 유효성분으로 하는 인삼 뿌리썩음병 방제용 미생물제제.
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