KR101334742B1 - 신규의 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 식물 뿌리썩음병 방지 용도 - Google Patents

신규의 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 식물 뿌리썩음병 방지 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규의 바실러스 서브틸리스 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로 뿌리썩음병원균의 생육을 저해하는 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604, 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 뿌리썩음병원균 방제용 조성물, 및 상기 조성물을 이용하여 인삼 뿌리썩음병원균을 방제하는 방법 및 상기 균주를 이용하여 시린드로카폰 디스트럭탄스 또는 푸사리움 솔라니의 생육을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 개발된 활성 길항 미생물은 수질 및 토양에 친화적이기 때문에 환경공해가 없으며, 특히 활성 길항 미생물은 인삼의 연작 또는 재작하였던 경작 예정지뿐 아니라 경작 중인 인삼의 뿌리썩음병을 개선하기 때문에 인삼 경작에 획기적으로 기여할 것으로 기대된다.

Description

신규의 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 식물 뿌리썩음병 방지 용도 {A novel Bacillus subtilis strain and use thereof for protecting the rust of plant roots}
본 발명은 신규의 바실러스 서브틸리스 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로 뿌리썩음병원균의 생육을 저해하는 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604, 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 뿌리썩음병원균 방제용 조성물, 및 상기 조성물을 이용하여 인삼 뿌리썩음병원균을 방제하는 방법 및 상기 균주를 이용하여 시린드로카폰 디스트럭탄스 또는 푸사리움 솔라니의 생육을 억제하는 방법에 관한 것이다.
1992년 이전의 식물의 뿌리썩음병에 관한 연구는 주로 복합 뿌리썩음병과 인삼 뿌리썩음병원균인 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans (Zinssm.) Scholten)에 의한 일종의 넓은 의미의 뿌리썩음병에 대한 연구가 주로 수행되어 왔으나, 실제적인 뿌리썩음병에 관한 연구는 1992년부터 집중적으로 수행되기 시작하였다. 그러나, 이 병원균에 대한 연구결과는 아직 적은 실정이다. 전 세계적으로 상기 병원균은 주로 수목류나 구근류인 수선화, 시클라멘, 알팔파 그리고 인삼 등에서 병이 발생된다는 보고가 있다 (표 1).
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인삼의 뿌리썩음병 방제연구는 여러 연구자들에 의하여 여러 가지 방법으로 시도되었으나 시린드로카폰 디스트럭탄스에 의한 뿌리썩음병의 병발생 기작과 병원균의 생리, 생태적인 기초연구가 미흡하여 뿌리썩음병의 확실한 예방이나, 방제방법은 아직 없다. 또한, 연작장해의 원인이 토양에 존재하는 뿌리썩음병원균으로 규명되었으나 발병 후에는 효과적인 방제수단이 없어서, 인삼 이식 후 발생한 뿌리썩음병이 포장 내에서 주변으로 확산되는 것만 막고 있는 실정이었다. 인삼경작에서 재작은 인삼을 수확하고 7-10년 정도 다른 작물을 경작하다가 인삼을 다시 경작하는 것이고, 연작은 인삼을 수확한 후 다른 작물을 재배하지 않고 1-2년간 경작 예정지 관리 후 다시 인삼을 경작하는 것이다. 인삼은 연작에 의한 장해가 발생되는 대표적인 작물로서 주요 인삼 산지에서는 필요 재배면적의 증가로 인한 초작지의 절대부족으로, 초작지 확보를 위하여 타지역으로 이동하여 재배하는 소위 출입경작을 하고 있는 실정이다. 그러나 계속되는 인삼경작에 초작지가 점점 줄어들고, 초작지의 절대부족으로 인한 원거리 출장경작은 생산비의 증가와 관리소홀 유발과 새로운 지역의 기상 및 토양조건 변화에 따른 적응 부족으로 인삼의 생산성과 품질이 저하되기도 한다. 인삼 수확 후 4-5년 내 다시 인삼을 연작 또는 재작하였을 때 인삼포장에서 뿌리가 흑갈색으로 부패하며 잎이 조기 홍엽화되는 뿌리썩음병이 발생한다.
초작지에서는 토양 내 뿌리썩음병원균의 밀도가 그다지 높지 않아 초기 뿌리썩음병 발생량이 적어도 6년 근 수확 시 50%정도는 결주된다고 인삼경작자들은 인식하고 있으며, 초작지에서의 뿌리썩음병 발생은 특별한 경우를 제외하고 일반적으로 재배 중에 부패하여 없어지는 50%의 일부라고 생각하고 있다. 그러나, 연작장해가 발생한 포장에서 이식 1-2년 내에 뿌리썩음병에 의한 초기 결주율이 30%, 심한 경우는 80%에 달하고 이후 급속히 진전되어 3-4년생에서 인삼은 100% 결주되기도 한다.
이러한, 연작 장해증상은 뿌리가 흑갈색으로 부패하며 잎이 조기에 말라가면서 뿌리가 썩는 증상을 보이며, 이와 같은 증상이 식물병원균의 일종인 시린드로카폰 디스트럭탄스(인삼)스콜튼 (Cylindrocarpon destructans (Zinssm.) Scholten)이 인삼에 대한 병원성인 것이 확인된 후, 이 병원균의 생리적 특성과 배양 중에 아미노산의 이용도와 분비에 대한 연구가 진행되었다. 처음에는 이 균을 시린드로카폰 라디시콜라 (C. radicicola)로 명명하였고, Scholten에 의하여 시린드로카폰 디스트럭탄스로 재 명명되었다. 시린드로카폰 디스트럭탄스의 생육 배지의 탄소원, 질소원 별 균사 생육량과 독소생성량의 차이와 이 균의 생육에 미치는 온도의 영향 등이 보고되었고, 시린드로카폰 디스트럭탄스에 의한 인삼 뿌리썩음병의 발병 특성과 배양온도, 빛, 배지의 pH, 배지 종류 등 다양한 요인에 의한 생육차이가 보고된 바 있다. 그 후 생육특성에 관련된 보고는 인삼의 연작장해에 관련된 뿌리썩음병원균으로 시린드로카폰 디스트럭탄스가 재분리 확인되자, 이 병원균에 대한 관심과 인삼의 연작장해를 해결하고자 하는 연구의 일환으로 이 병원균의 선택배지 개발을 위해 온도, pH등 배양조건과 항균물질 첨가에 따른 생육 특성 등이 보고된 바 있다.
인삼 재배시 뿌리썩음증 관련 병원균들은 파이토프소라 칵토롬 (Phytophthora cactorum), 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani) 등이 보고되었다. 이러한 병원균 중에서 연작 장해의 원인균으로 알려져 있고 후막포자를 형성하면서 토양 전염성으로 병을 일으키는 시린드로카폰 디스트럭탄스에 의한 피해가 주로 관찰되었다. 그리고 이 병의 전형적인 흑색의 병반 조직으로부터 시린드로카폰 디스트럭탄스가 분리되고 병원성도 확인됨에 따라, 이 병원균에 대한 관심이 고조되게 되었다. 이 병원균은 연작지 뿐만 아니라 초작지에서도 시린드로카폰 디스트럭탄스에 의한 뿌리썩음병에 주의가 필요하다는 보고도 있다.
그 동안 토양 내 존재하는 토양 병원균의 밀도를 감소시키는 방법으로 인삼이 경작된 토양에 담수하는 방법과 토양 훈증제를 사용하는 방법이 알려져 있으나 사용방법의 번거로움이 있는 단점이 있었다. 가을에 인삼을 수확한 토양에 유기 수은 훈증제를 처리한 후 시간별로 토양 미생물의 밀도변화를 조사하면 증식 속도가 빠른 세균들은 처리 20일 후, 처리 전 수준으로 회복되었으나 증식속도가 늦은 진균이나 방선균밀도는 처리 직후 급격히 감소하였다가 다음해 봄에 인삼 이식시기 정도에 미생물의 밀도가 정상 수준으로 회복되어 토양 유해진균류의 방제효과가 크지 않음을 알 수 있다. 그리고 뿌리썩음병원균을 토양표면으로부터 30cm에 접종하고 인삼을 이식한 경우에 뿌리썩음병이 발생되지만 50cm 이하에 뿌리썩음병원균을 접종하면 발병되지 않으므로 상면 토양을 40cm정도 깊이까지 훈증하는 방법에 의해 방제효과가 조금 기대되지만, 인삼경작 중에 뿌리썩음병원균에 의하여 뿌리가 부패할 경우, 인삼이 경작되고 있는 상태에서는 훈증제에 의한 방제는 불가능하여 사용에 어려움이 있다.
이렇게, 인삼경작에 가장 큰 문제가 되는 뿌리썩음병을 방지하기 위하여 국내외의 많은 연구자들이 여러 가지 재배방법과 화학합성 농약으로 방제를 시도하였으나 아직도 선발된 농약의 방제가가 낮아 사용에 어려움이 있으며 일부 경작자는 무분별하게 농약을 오남용하여 원료 인삼뿐만 아니라 수질과 토양을 오염시키고 있는 실정이다. 또한, 외국의 경우 홍삼 제품도 수입 당사국의 사용금지 농약을 규제 대상으로 하고 있어서, 한국에서 사용 허가된 농약이라도 수입 당사국에서 사용 금지된 농약이면 잔류되는 농약 사용에 주의가 필요하다. 요즈음은 전 세계적으로 유기합성된 농약에 의한 피해에 대한 우려와 여러 가지 환경공해 때문에 작용기작이 확실한 환경친화적 저독성 농약 개발의 중요성이 크게 인식되고 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 환경친화적이고 저독성의 뿌리섞음병을 방제할 수 있는 새로운 살균제를 찾기 위해 예의 노력한 결과, 인삼의 연작과 재작 시 발생하는 뿌리썩음병을 방제하기 위한 환경 친화적인 미생물자원으로부터 인삼 뿌리썩음병 유발 미생물을 방제하는 길항 미생물을 새롭게 개발하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명에서 개발된 활성 길항 미생물은 수질 및 토양에 친화적이기 때문에 환경공해가 없으며, 특히 활성 길항 미생물은 인삼의 연작 또는 재작하였던 경작 예정지뿐 아니라 경작 중인 인삼의 뿌리썩음병을 개선하기 때문에 인삼 경작에 획기적으로 기여할 것으로 기대된다.
본 발명의 하나의 목적은 신규의 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 (수탁번호: KCTC 11758BP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 뿌리썩음병원균 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 인삼 뿌리썩음병원균을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 이용하여 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 또는 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)의 생육을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주 또는 조성물의 뿌리썩음병원균 방제 용도를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 신규의 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 (수탁번호: KCTC 11758BP)를 제공한다.
상기 균주는 뿌리썩음병원균의 생육을 억제하는 것을 특징을 가지며, 바람직하게는 인삼 뿌리썩음병원균의 생육을 억제할 수 있으며, 이로 인해 인삼 재배에 있어서 커다란 문제로 대두되고 있는 인삼 뿌리썩음병을 방제할 수 있다.
본 발명에서 용어, "인삼 뿌리썩음병"이란 인삼 연작 재배시 50% 이상 발생하는 토양 식물병으로 뿌리가 흑갈색으로 부패하며 잎이 조기 홍엽화되는 현상이 발생되는 병이다. 현재까지 확실한 인삼 뿌리썩음병의 병발생 기작과 병원균의 생리, 생태적인 기초 연구가 미흡하여 확실한 예방이나 방제 방법이 미진한 상태이다. 이에 본 발명자들은 새로운 예방이나 방제 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 본 발명자들이 개발한 신규 균주인 상기 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604가 인삼 뿌리썩음병원균의 일종인 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 또는 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)의 생육을 억제하여 인삼 뿌리썩음병을 방제할 수 있다는 것을 최초로 규명하였다.
본 발명의 상기 균주는 뿌리썩음병을 일으키는 균주의 생육을 억제하는 길항 능력을 가진 균주로서, 바람직하게는 인삼 뿌리썩음병을 일으키는 균주의 생육을 억제할 수 있다. 본 발명에서 "인삼 뿌리썩음병원균"은 인삼 뿌리썩음병을 일으킬 수 있는 균주는 제한 없이 포함되나, 그 예로 파이토프소라 칵토롬 (Phytophthora cactorum), 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani) 등이 있으며, 바람직하게 본 발명의 상기 균주가 생육을 억제할 수 있는 병원균으로는 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 또는 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani) 일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 균주가 시린드로카폰 디스트럭탄스 또는 푸사리움 솔라니의 생육을 저해할 수 있음을 확인하였다 (실시예 1 및 4 참조).
본 발명에서 용어, "시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans)"는 디스트럭탄스(인삼)스콜튼 (Cylindrocarpon destructans (Zinssm.) Scholten)와 혼용되어 사용되어질 수 있다. 상기 병원균은 인삼 연작 장해의 원인균으로 알려져 있으며, 후막포자를 형성하여 토양 전염성으로 병을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 또한 뿌리썩음병의 전형적인 흑색의 병반 조직으로부터 상기 균주가 분리되어 병원성이 확인되었으며, 상기 병원균의 생육을 억제한다면 곧 인삼 뿌리썩음병을 방제할 수 있다.
본 발명에서 용어, "푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)"는 인삼 뿌리썩음병의 병원균으로 알려진 균으로 상기 균에 감염되면 인삼 뿌리의 표면이 연한 갈색 또는 적갈색으로 변하며 뿌리 속까지 연부 (soft rot)하게 된다.
본 발명자들은 인삼 뿌리썩음병원균인 푸사리움 솔라니 균주와 시린드로카폰 디스트럭탄스 균주에 억제 활성을 나타내는 균주를 탐색하던 중 자외선에 노출하여 돌연변이가 유도된 길항 균주를 분리하였으며, 구체적으로는 충청남도 음성의 토양 시료 중에서 분리하였다 (도 1).
본 발명이 제공하는 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자 (rDNA)의 서열은 서열번호 1로 기재된다 (도 2). 공지 균주의 rDNA 서열과 비교하여 보면, 서열번호 1로 기재되는 rDNA의 서열은 공지의 바실러스 서브틸리스 균주 AB017589와 99% 유사성을 보이며, 또 다른 공지의 바실러스 서브틸리스 균주 AB017590과도 99% 일치성을 나타냈다. 본 발명이 제공하는 균주의 크기는 평균적으로 0.6-0.7 X 1.5-1.6㎛ 정도로 일반적인 바실러스 서브틸리스의 크기인 1.2-2.5㎛보다 약간 작았으며 편모는 한 개였고, 그 길이는 대략 7.5㎛로 균체 크기의 5배 정도였다 (도 3). 상기 균주의 분류상의 위치를 비교한 결과, 바실러스 서브틸리스로 분류하였고, 지방산의 구성성분과 비율, 균체 외형 등의 특징을 근거로 본 발명의 균주를 "바실러스 서브틸리스 B-5604"으로 명명하였으며, 2010년 9월 13일에 한국생명공학연구원 생물자원센터(대한민국 대전시 유성구 과학로 111)에 수탁번호 KCTC 11758BP로 기탁하였다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 상기 균주는 푸사리움 솔라니 및 시린드로카폰 디스트럭탄스의 생육을 억제하는 것을 확인하였다 (실시예 4 참조). 또한 본 발명의 균주가 인삼 뿌리썩음병 억제 효과가 있는 지를 조사하고자, 인삼 뿌리의 3/4는 뿌리썩음병원균이 존재하는 토양으로 덮고, 그 위는 뿌리썩음병 방제 길항 미생물인 상기 균주를 질석 등에 흡착시킨 후 건조시킨 토양을 덮어 관찰한 결과, 뿌리썩음병원균이 존재하는 토양 부분은 그대로 썩었으나, 뿌리썩음병 방제 길항 미생물인 상기 균주를 질석 등에 흡착시킨 약제 부착부에서 생육했던 부분은 뿌리썩음병이 개선되어 생육상태가 양호한 것을 확인하였다 (도 4). 아울러, 뿌리썩음병원균이 존재하는 경작지를 대조구로, 뿌리썩음병원균의 방제 미생물을 동량의 질석에 흡착시킨 후 건조시킨 질석을 뿌리썩음병원균이 존재하는 토양과 1:1로 섞어 인삼 위를 덮은 시험구를 비교한 결과, 뿌리썩음병원균이 존재하는 토양은 많이 썩었으나, 본 발명의 상기 길항 미생물을 처리하는 군에서는 뿌리썩음병이 개선되어 생육 상태가 양호한 것을 확인하였다 (도 5). 이와 같은 결과는 본 발명에서 개발한 균주가 인삼 뿌리썩음병을 효과적으로 방제할 수 있음을 시사하는 것이다. 따라서, 본 발명의 신규한 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604는 인삼 뿌리썩음병원균에 대하여 우수한 길항 능력을 갖고 있으며, 환경공해와 인체독성이 없어 환경 친화적인 인삼 뿌리썩음병원균 방제용 미생물로 이용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 (수탁번호: KCTC 11758BP) 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 뿌리썩음병원균 방제용 조성물을 제공한다.
뿌리썩음병원균은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 미생물의 안정적인 제제화를 목적으로, 수화제, 입제 또는 캡슐화의 형태로 제제될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 미생물 또는 배양액을 인삼 뿌리썩음병원균 방제용 조성물에 포함된 채로 공급될 수도 있고, 장기간 보존을 위해 별도로 보관하였다가 사용 직전에 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 미생물을 장기간 보존하기 위해 별도로 공급되는 경우에는 글리세롤 저장용액에 -70℃ 이하로 보존하거나 -20 내지 -80℃에서 동결건조 보존하여 사용할 수 있다.
본 발명의 수화제는 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제 및 증량제/영양제를 첨가하여 혼합하여 제조할 수 있다. 상기에서 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린 (dextrin), 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 입제는 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량제/영양제 및 붕해제를 첨가하여 제조할 수 있다. 상기에서 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트 (bentonite), 탈크 (talc), 다이아라이트 (dialite), 카올린 (kaolin) 및 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 입제는 미생물에 표면 활성제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제 및 흐름제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 것을 추가로 첨가하 여 제조할 수 있다.
상기 조성물은 식물의 뿌리 또는 그 주위의 토양에 적용하여 뿌리썩음병원균을 방제할 수 있다. 보다 바람직하게는 인삼의 뿌리 또는 그 주위의 토양에 적용하여 인삼 뿌리썩음병원균을 방제할 수 있다. 조성물을 적용하는 방법으로는, 상기 균주의 배양액 또는 균주를 직접 도말 (spreading), 살포 (spraying), 침지 (soaking)하거나, 상기 균주 배양액 또는 균주를 질석, 규조토, 퍼라이트에 흡착시켜 산포하거나, 경작 예정지 관리 시에는 토양을 갈아 엎는 중에 균주 배양액 또는 흡착시킨 균주를 섞는 방법을 이용할 수 있다. 이 밖에도 공지의 농약 투여법, 미생물 적용법 등이 이용될 수 있다.
상기 조성물의 적용은 인삼의 뿌리나 이에 근접한 토양에 바실러스 서브틸리스 B-5604를 집중하여 살포하고, 미생물의 유효량은 경작지 면적 (㎡) 당 미생물의 수가 1 X 107 내지 5 X 107마리가 살포되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 4 X 107마리일 수 있다.
또한, 미생물의 적용은 조성물에 포함되는 미생물의 유효량이 미리리터 (㎖) 당 1 X 106 내지 1 X 109 마리의 미생물 농도로 희석한 용액을 인삼의 뿌리에 직접 살포하거나, 미리리터 (㎖) 당 1 X 106 내지 1 X 109 마리의 미생물 농도로 희석한 용액에 인삼을 1 내지 2시간 동안 침지시킬 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 (수탁번호: KCTC 11758BP) 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 뿌리썩음병원균 방제용 조성물을 이용하여 인삼 뿌리썩음병원균을 방제하는 방법을 제공한다.
방제하는 방법은 상기 조성물을 인삼의 뿌리나 이에 근접한 토양에 집중하여 살포하거나, 침지시켜서 인삼 뿌리썩음병원균을 방제할 수 있으며, 구체적인 내용은 상기에서 설명한 바와 같다.
아울러, 상기 조성물은 인삼 뿌리썩음병원균의 생육을 억제하여 인삼 뿌리썩음병원균을 방제할 수 있으며, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 설명도 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 (수탁번호: KCTC 11758BP)를 이용하여 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 또는 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)의 생육을 억제하는 방법을 제공한다.
상기 균주, 생육 억제 대상이 되는 균주 및 생육을 억제하는 방법은 상기에서 설명하는 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 (수탁번호: KCTC 11758BP), 또는 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 (수탁번호: KCTC 11758BP) 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 뿌리썩음병원균 방제용 조성물의 뿌리썩음병원균 방제 용도를 제공한다.
방제 용도는 상기 균주 또는 조성물을 식물의 뿌리나 이에 근접한 토양에 집중하여 살포하거나, 침지시켜서 뿌리썩음병원균을 방제하여 수행할 수 있으며, 구체적인 내용은 상기에서 설명한 바와 같다. 바람직하게 상기 식물은 인삼일 수 있으며, 이에 따라 인삼 뿌리썩음병원균을 방제할 수 있다.
아울러, 상기 균주 또는 조성물은 뿌리썩음병원균의 생육을 억제하여 뿌리썩음병원균을 방제할 수 있으며, 뿌리썩음병원균에 대한 설명도 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 개발된 길항 미생물은 인삼 뿌리썩음병 균주에 특이적인 살균제 내성 작용기작이 있음을 규명하여 새로운 작용기작의 살균작용을 하는 활성물질을 탐색할 수 있는 탐색계를 제작 탐색하여 새로운 작용기작을 갖고 살균제 내성작용기작을 극복할 수 있는 활성미생물로서 사용될 수 있을 것이다. 또한, 인삼의 뿌리썩음병 원인균의 생장을 효과적으로 저해하여 인삼 경작에 환경공해를 주지 않고 인체에 독성이 없는 친환경 인삼 뿌리썩음병 방제제 또는 농약의 안정적 공급으로 국내의 인삼 경작농가의 경영비용 절감, 환경오염 감소, 경쟁력 높은 고품질 인삼제품의 안정적 공급 및 수출 증대에 기여할 것이다. 그리고 푸사리움 솔라니 균주는 미국 인삼뿐 아니라, 일본 인삼에서도 문제를 일으키는 것으로 알려져 있으므로 확보한 활성미생물은 국가 경쟁력을 제고시키고 국가 경제의 활성화에 이바지할 것으로 기대된다.
도 1은 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans)에 억제활성을 나타내는 길항 균주를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 B-5604의 16S rRNA를 암호화하는 유전자 rDNA의 서열을 나타낸 도이다 (서열번호 1).
도 3은 본 발명의 길항 미생물의 전자현미경 사진이다.
도 4는 길항 미생물의 식물 뿌리썩음병 부분방지 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 식물에 길항 미생물의 처리 여부에 따른 결과를 나타낸 도이다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 길항 미생물의 선발
본 발명자들은 인삼의 뿌리썩음병원균의 생육을 억제하는 길항 미생물을 탐색하기 위하여, 충청남도 음성의 토양 시료 중에서 뿌리썩음병원균이 생산하는 저해활성이 있는 물질에서도 생육할 수 있는 미생물 중에서 길항 미생물을 탐색하였다. 인삼의 뿌리썩음병원균의 생육을 억제하는 길항 미생물의 탐색은 토양 시료를 증류수에 단계적으로 희석하여 뿌리썩음병원균이 생산하는 저해활성이 있는 물질을 분리배지에 도말한 후 후보 균주를 선발 분리하는 방법에 의해 수행하였다.
본 발명자들이 사용하는 미생물 분리배지 (이스트 추출물 0.1%, 폴리펩톤 0.5%, 1인산수소칼륨 0.05%, 2인산칼륨0.05%, 황산마그네슘 칠배결정수 0.02%, 한천 1.5%, 수소이온농도 7.2)는 멸균 후 50℃ 정도로 온도를 낮추어 두고, 일반 세균의 생육을 억제하기 위하여 첨가 항생제로 콜리스틴 (colistin)을 5㎎/ℓ 농도로 증류수에 녹인 용액과, 나릴디식 산 (Nalidixic acid)를 10㎎/ℓ 농도로 메탄올에 녹인 용액을 멸균한 분리 배지 1ℓ당 1㎖씩 넣어 잘 섞은 후 굳힌 분리용 배지를 사용하였다. 준비된 분리용 배지에 토양시료를 단계적으로 희석하고 도말하여 28℃에서 배양하면서 균들을 생육시키며 분리하였다. 길항 미생물의 탐색은 뿌리썩음병원균이 생산하는 저해활성이 있는 항생물질에서도 생육할 수 있는 미생물 중에서 선발하였다. 길항 미생물의 탐색은 일차적으로 선발한 미생물을 순수 분리하여 뿌리썩음병 원인균인 푸사리움 솔라니 균주를 녹말당 한천배지에서 배양하는 중에 탐색하려는 균주를 옆에 도말하여 푸사리움 솔라니 균주의 생육에 저해활성이 있는 길항 미생물을 2차로 선발하였다.
1차로 선별된 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis)를 카페인 (caffein) 50mM 농도로 처리하여 살아남은 균주들을 다시 자외선에서 노출하여 돌연변이가 유도된 길항 균주 중에서 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 균주에 저해활성을 나타내는 균주를 선별하였다 (도 1). 시린드로카폰 디스트럭탄스 균주에 저해활성이 있던 바실러스 서브틸리스를 LBG (tryptone 1.0%, yeast extract 0.5%, NaCl 1.0%, glucose 1.0%)에 접종하여 12-18시간 동안 배양하고 5mM 카페인, 0.1M MgSO47H2O, 0.03% tween 80이 함유된 균액 4㎖(A550=0.4)를 유리로 된 평판에 분주하였다. 분주 후 20cm 상단에 부착한 2개의 단파장 자외선등(10W)과 1개의 장파장 UV등으로 10초-2분간 조사하여 생존율이 0.1% 이내의 조건(90초 조사)에서 살아남은 균주를 LB 한천평판에 도말하고 30℃로 배양한 후 균주를 선발하였다. 선발된 균주를 LB 액체 배지에서 배양한 후 생산배지(sucrose 30g, soybean meal 20G, MnCl24H2O 5mg, FeSO47H2O 50mg per liter)에 24-48시간 배양하여 시린드로카폰 디스트럭탄스의 고역가 피검균 평판에서 모균주에 비해 억제활성이 증대된 균주를 선별하였다.
실시예 2: 탐색된 길항 미생물의 동정
상기 실시예 1에서 선별한 길항 미생물 균주의 16S rRNA을 암호화하는 유전자 (rDNA)의 서열을 도 2에 나타냈다 (서열번호 1). 공지의 바실러스 서브틸리스 균주인 AB017589와 AB017590의 rDNA 서열과 비교하여 보면, 서열번호 1로 기재되는 상기 실시예 1에서 선별한 바실러스 서브틸리스의 rDNA 서열은 공지의 바실러스 서브틸리스 균주 AB017589와 99% 유사성을 보이며, 또 다른 공지의 바실러스 서브틸리스 균주 AB017590과도 99% 일치성을 나타냈다.
상기 실시예 1에서 선별한 바실러스 서브틸리스 균주의 형태를 광학현미경으로 확인한 후 전자현미경에서 8800배의 배율로 확대 후 사진으로 확인하였는데, 균주의 크기는 평균적으로 0.6-0.7 X 1.5-1.6㎛ 정도로 일반적인 바실러스 서브틸리스의 크기인 1.2-2.5㎛보다 약간 작았으며 편모는 한 개였고 그 길이는 대략 7.5㎛로 균체 크기의 5배 정도였다 (도 3).
그러나 염기서열 유사도가 99% 이상 일치하는 균주가 많으면 이를 이용한 동정은 불가능하다고 판단되었으므로, 함유 지방산 분석 비교로도 정확한 동정이 불가능하였다. 그러므로 길항 미생물 균주를 영양 아가 (nutrient agar) 평판 배지에서 37℃에서 24시간 배양한 후 균체를 얻어 Chun 과 Goodfellow 방법 (Chun J. & Goodfellow M. (1995) Aphylogenetic analysis of the genus Nocardia with 16S rRNA gene sequences.　 Int.J.Syst.Bacteriol. 45: 240-245)에 따라 DNA를 얻어 gyrA 유전자를 p-gyrA-f (5'-CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT-3', 서열번호 2)와 p-gyrA-r (5'-CAA GGT AAT GCT ATT GCT-3', 서열번호 3) 두 종류의 프라이머를 사용하여 PCR을 실행하여 유전자를 증폭하였고 PCR 조건과 염기서열 분석을 Chun 과 Goodfellow 방법에 따라 동정하였다. 그 결과, 상기 신규 균주의 분류상의 위치를 확인하기 위하여 가장 많이 이용되는 미생물의 16S rDNA 염기서열 비교 데이터를 근거로 상기 신규 균주를 바실러스 서브틸리스로 분류하였고, 지방산의 구성성분과 비율, 균체 외형 등의 특징을 근거로 본 발명의 상기 실시예 1에서 선별한 균주를 새로운 균주인 "바실러스 서브틸리스 B-5604"으로 명명하였으며, 2010년 9월 13일에 한국생명공학연구원 생물자원센터(대한민국 대전시 유성구 과학로 111)에 수탁번호 KCTC 11758BP로 기탁하였다.
실시예 3: 바실러스 서브틸리스 B-5604의 배양 조건
인삼 뿌리썩음병에 억제 활성이 있는 길항 미생물인 바실러스 서브틸리스 B-5604는 LB배지 (카제인 펩톤 1%, 이스트 추출물 0.5%, 소금 0.5%, 고압멸균 후)에서 28℃, 24시간 진탕 배양한 배양액과 20% 글리세린을 1:1 비율로 섞어 2㎖씩 냉동 바이알에 넣어 -70℃에서 냉동 보관하면서 활성물질 생산 배양에 사용하였다.
활성미생물로부터 인삼 뿌리썩음병에 저해 활성이 있는 활성물질을 생산하기 위하여 냉동된 바실러스 서브틸리스 B-5604 바이알을 녹여, 1리터 용량 삼각 플라스크에 활성물질 생산 배지(가용성 전분1%, 파마메이드 0.5%, 포도당 0.2%, 황산암모늄 0.1%, 인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7배 결정수 0.05%, 염화칼슘0.1%, 염화나트륨 0.3%, 초기 pH 7.0)로 조성된 배지 100㎖에 접종하여 28℃에서 48시간 200rpm의 속도로 진탕 배양하였다. 배양시의 생성되는 거품 소포제는 실리콘오일을 적당량 사용하였다.
실시예 4: 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604가 보여주는 푸사리움 솔라니 또는 시린드로카폰 디스트럭탄스 균주의 생육 억제 효과
바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 균주 B-5604가 푸사리움 솔라니 또는 시린드로카폰 디스트럭탄스 균주의 생육을 억제한다는 사실을 확인하기 위해, PDA 배지에서 푸사리움 솔라니 또는 시린드로카폰 디스트럭탄스 균주의 생육 억제 활성을 분석하였다. PDA 배지에서 37℃, 72시간 동안 배양시킨 푸사리움 솔라니 또는 시린드로카폰 디스트럭탄스 균주를 멸균된 스패츄라로 3X3 mm 취하여 PDA 배지에 얹어 배양하고, 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604를 멸균된 한백금니로 취하여 그 옆에 나란히 일자로 그어 28℃, 48시간 동안 배양한 결과, 푸사리움 솔라니 또는 시린드로카폰 디스트럭탄스 균주의 생장이 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604의 인삼 뿌리썩음병 억제 효과
활성미생물의 인삼 뿌리썩음병 억제 활성을 인삼 경작지에서 확인하기 위하여 충청남도 증평 소재의 경작지에서 시험하였다.
시험개시일시는 5월 시험 당시 휴경중인 인삼경작지에서 뿌리썩음병원균의 존재를 확인하고 경작지에 2년근 인삼을 5000칸 중 1칸 (주: 한 칸의 규격은 1.8x 0.9 m이며 시험에 사용된 인삼 수는 500 여뿌리)에 2년근 인삼을 이식하여 인삼뿌리의 3/4은 뿌리썩음병원균이 존재하는 토양으로 덮고, 그 위에 상기 실시예 3의 방법으로 배양한 뿌리썩음병 방제 길항 미생물을 동량의 질석 등에 흡착시킨 후 건조시킨 토양을 덮어 동년 8월에 인삼을 캐내어 뿌리썩음병 방제 길항 활성미생물 처리구에 대한 인삼의 뿌리썩음병 개선도를 조사하였다.
뿌리썩음병 방제 활성 균주 처리구에 대한 인삼의 뿌리썩음병 개선도를 육안으로 판정한 결과, 뿌리썩음병원균이 존재하는 토양 부분 (아래 부분)은 그대로 썩었으나, 뿌리썩음병 방제 길항 미생물을 질석 등에 흡착시킨 약제 부착부에서 생육했던 부분 (윗 부분)은 뿌리썩음병이 개선되어 생육상태가 양호한 것을 확인하였다 (도 4).
그리고 길항 미생물의 뿌리썩음병 억제실험은 인삼경작지에서 뿌리썩음병원균의 존재를 확인하고 경작지에 2년근 인삼 5000칸 중 1칸에 2년근 인삼을 이식하여 뿌리썩음병원균이 존재하는 토양으로 덮은 대조구를 경작하였다. 시험군은 2년근 인삼을 이식하고 상기 실시예 3의 방법으로 배양한 뿌리썩음병 방제 길항 활성미생물을 동량의 질석에 흡착시킨 후 건조시킨 질석을 뿌리썩음병원균의 존재하는 토양과 1:1로 섞어 인삼 위를 덮어 동년 8월에 인삼을 캐내어 대조구와 뿌리썩음병 방제 길항 미생물 처리구에 대한 인삼의 뿌리썩음증 개선도를 조사하였다.
뿌리썩음병 방제 활성 미생물 처리구에 대한 인삼의 뿌리썩음병 개선도를 육안으로 판정한 결과, 뿌리썩음병원균이 존재하는 토양은 많이 썩었으나, 길항 활성미생물을 흡착시킨 질석 처리군은 뿌리썩음병이 개선되어 생육상태가 양호한 것을 확인하였다 (도 5).
한국생명공학연구원 KCTC11758BP 20100913
서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

  1. 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 및 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)의 생육을 억제하는 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 (수탁번호: KCTC 11758BP).
  2. 제1항의 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 (수탁번호: KCTC 11758BP) 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 시린드로카폰 디스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니 방제용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 인삼 뿌리 또는 그 주위의 토양에 적용하는 것을 특징으로 하는 시린드로카폰 디스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니 방제용 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 수화제, 입제 또는 캡슐제인 것인 시린드로카폰 디스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니 방제용 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 또는 그의 배양액에 계면활성제, 중량제 및 영양제를 첨가하여 제조되는 것인 시린드로카폰 디스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니 방제용 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 조성물에 포함되는 미생물의 유효량은 미리리터 (㎖) 당 1 X 106 내지 1 X 109 마리인 것인 시린드로카폰 디스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니 방제용 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 조성물에 포함되는 상기 미생물의 유효량은 경작지 면적 (㎡) 당 미생물의 수가 1 X 107 내지 5 X 107 마리가 살포되는 것인 시린드로카폰 디스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니 방제용 조성물.
  10. 제2항, 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 이용하여 시린드로카폰 디스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니를 방제하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조성물을 인삼의 뿌리나 이에 근접한 토양에 집중하여 살포하거나, 침지시키는 것을 특징으로 하는 시린드로카폰 디스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니를 방제하는 방법.
  12. 제1항의 바실러스 서브틸리스 균주 B-5604 (수탁번호: KCTC 11758BP)를 이용하여 시린드로카폰 디스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 또는 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)의 생육을 억제하는 방법.
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