KR100827352B1 - 유도전신저항성 바실러스 메가테리움 ｈｋ-ｉｓｒ1 균주 및이의 배양액을 포함하는 미생물 제제와 이를 이용한인삼병 방제 방법 - Google Patents

유도전신저항성 바실러스 메가테리움 ｈｋ-ｉｓｒ1 균주 및이의 배양액을 포함하는 미생물 제제와 이를 이용한인삼병 방제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유도전신저항성 바실러스 메가테리움 HK-ISR1 균주를 포함하는 인삼병원균 미생물 제제에 관한 것으로서, 구체적으로 인삼뿌리 및 지상부 병원균에 대하여 유도전신저항성을 가지는 바실러스 메가테리움 HK-ISR1 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제 또는 상기 미생물 제제를 이용한 인삼병 방제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 제제는 인삼 병원균에 길항 능력은 없으나, 식물 자체에 유도전신저항성을 유발하여 발병억제능력을 가지므로 환경친화적 미생물농약으로 유용하게 이용될 수 있다.
바실러스 메가테리움 균주, 미생물 제제, 유도전신저항성, 인삼뿌리썩음병균, 인삼지상부병균.

Description

유도전신저항성 바실러스 메가테리움 ＨＫ-ＩＳＲ1 균주 및 이의 배양액을 포함하는 미생물 제제와 이를 이용한 인삼병 방제 방법{Microbial agents against ginseng plant pathogens that contains induced systemic resistant Bacillus megaterium HK-ISR1 strain and cultured solution therefrom and prevention methods for ginseng plant disease using the same}
도 1은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) HK-ISR1 균주(이하 “HK-ISR1"이라 칭함)의 16S RNA 서열이다.
도 2는 HK-ISR1 균주의 지방산 함량을 나타내는 가스크로마토그램이다.
도 3은 HK-ISR1 균주 현탁액을 토양에 관주하고, 지상부에 역병 병원균 파이토프토라 캑토럼(Phytophthora cactorum)의 유주포자 접종시 건전 유묘수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 바실러스 메가테리움을 처리한 묘삼뿌리조직에서 실린드로카본 디스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)의 접종에 의한 표피세포벽의 리그닌 집적효과를 나타내는 사진이다.
도 5는 HK-ISR1 균주에 침지한 묘삼이 인삼뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans)으로 오염된 토양에 이식했을 때의 입묘율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 HK-ISR1 균주에 침지한 묘삼이 인삼뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans)으로 오염된 토양에 이식했을 때의 근부 이병율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 개갑된 인삼 씨앗을 HK-ISR1 균주 배양액에 침지하여 파종된 처리구, 무처리 대조구, 길항성 바실러스 서브틸리스 및 관행 농약재배구의 건전묘삼 비율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 개갑된 인삼 씨앗을 HK-ISR1 균주 배양액에 침지하여 파종된 처리구, 무처리 대조구, 길항성 바실러스 서브틸리스 및 관행 농약재배구의 건전묘삼 수량을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 유도전신저항성 바실러스 메가테리움 HK-ISR1 균주를 포함하는 인삼병원균 미생물 제제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인삼뿌리 및 지상부 병원균에 대하여 유도전신저항성을 가지는 바실러스 메가테리움 HK-ISR1 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제 또는 상기 미생물 제제를 이용한 인삼병 방제 방법에 관한 것이다.
고려인삼은 우리나라의 천혜적, 독점적, 역사적 생물자원으로 아득한 선사시대로부터 오늘날까지 인류의 보건을 위해 사용되고 있는 생약의 왕이다. 합성의약품의 부작용과 성인병의 극복에 서양의학이 한계를 보임에 따라 인삼을 비롯한 생 약제 및 천연물에 기대하는 대체의학이 날로 발전하고 있다. 인삼의 효능으로서 암 예방, 노화억제, 간장보호, 당뇨병억제, 피로회복, 뇌기능강화 등이 이미 밝혀졌고 최근에는 환경호르몬의 피해를 막아주며 비만을 억제하고 에이즈 환자에 대한 효과가 유전자 차원에서 이루어지고 있음이 알려져 있다.
고려인삼의 효능은 동양최고(4000년 전)의 의서인 신농본초경에 상술되어 있으며 중국에서 한의약재로 수천 년간 그 효과를 입증해온 고려인삼은 한반도에서 생산되는 것이 최고양질의 것으로 입증되어왔다. 2003년도의 우리나라 인삼수출은 2002년도 보다 30% 증가하였으며 2004년도는 2003년도보다 40%증가하였다. 그러나 우리나라의 인삼재배 여건은 재배기간이 6년으로 길어서 뿌리썩음병이 많아 반 이상이 결주되고 한번 심은 곳은 20년이 지나도 뿌리썩음병으로 인하여 연작이 불가능하므로(조대휘 : 청정원료삼생산을 위한 병해충 방제. 19-30, 고품질 인삼생산을 위한 기술적 접근 전략. 2004. 농촌진흥청 작물과학원. 발간 등록번호 11-1390625-060010-01) 심을 땅이 부족하여 새로운 흙을 복토하고 심는데 10년~15년 뒤 다시 심는 경우가 많다. 이러한 경우 병이 많이 발생하므로 농약을 과다사용하게 되고 따라서 인삼에 농약 잔류량이 많아 구주와 미주지역에 수출했다가 반품되는 사례가 많았다(박형달 : 인삼의 농약안정성조사 현황 및 방향. 47-56. 고품질 인삼생산. 농촌진흥청 작물과학원. 발간등록번호. 11-1390625-060010-01).
세계적으로 농산물시장이 개방화되므로 국토가 좁은 우리나라 농업은 독점적 자원인 인삼재배에서 새로운 활로를 찾아야 하며, 이를 위하여 잔류량이 있는 화학농약을 대체할 수 있는 환경친화적인 인삼병 방제방법의 개발이 시급한 실정이다.
연작지의 재작을 위하여 싸이론과 밧사미드 등 훈증제를 이용한 화학적 방제법을 권장해 왔으나 성공률이 토양요인에 따라 불안정하고 잔류문제와 환경문제로 수년 내 사용이 중지될 것으로 보이며 또한 답전윤환 재배는 아직 체계화되지 못하고 있는 실정이다.
최근 길항미생물을 활용하는 방법이 활발히 진행되어 수종이 시판되고 있다. 그러나 토양요인이 다양하여 포장에 따라 효과가 없는 경우도 많은데, 이러한 주된 이유는 길항성 미생물의 근권 정착의 정도가 다르기 때문이다. 길항미생물제의 효과가 성공적으로 발휘되려면 인삼 근권에 항시 유효밀도로 고루 분포하여 병원균이 근접할 수 없게 하여야 하는데, 근권 전체에 골고루 정착시켰다 하더라도 지속적으로 유효밀도를 유지하기가 쉽지 않다. 이는 길항균이 장기간 정착하는 동안 스스로 양분부족 등의 불리한 환경변화를 초래하여 지속적으로 증식하기 어려운 상태를 만들기 때문이다. 즉 길항성 미생물제의 효과는 시간적, 공간적으로 병원균이 길항균의 작용범위 안으로 밀접하게 있어야 한다는 속성 때문에 완전한 효과를 발휘하기에는 지극히 어려운 제약을 받는다. 최근에는 식물체가 가지고 있는 방어기작을 작동시키는 유도전신저항성 물질 또는 유도전신저항성 미생물들을 활용하여 식물병을 방제하는 연구가 활발하며, 타 작물에서는 유도전신저항성(Induced Systemic Resistance) 물질 및 미생물이 시판되고 있다(박경석 : ISR을 이용한 환경 친화형 병해방제기술. 69-103. 환경친화적 식물병방제 대응기술개발. 2004 학술심포지엄. 농촌진흥청. 발간등록번호. 11-390093-000103-01, Ray Hammerschmidt : Chap6;Induced Plant Resistance to Fungal Pathogens : Mechanisms and Practical Applications. 179-200. 2004. Food Product Press).
이에. 본 발명자들은 건전인삼포 토양에서 근부병 방제능력이 있는 미생물을 선발하는 과정에서 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) HK-ISR1을 동정 및 선발하였으며, 상기 균주가 기내배양실험을 통하여 인삼병원균에 대하여 길항성이 나타나지 않았음에도 불구하고 인삼에 직접 처리하였을 때 높은 병방제 효과를 보여 유도전신저항성(Induced Systemic Resistance)작용이 있음을 확인하고, 그 효과를 포장실험으로 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인삼병 방제용 미생물, 상기 미생물을 포함하는 미생물 제제 및 인삼병 방제 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼병에 대하여 인삼 자체의 유도전신저항성을 유발하는 신규 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) HK-ISR1 균주를 제공한다.
또한, 상기 바실러스 메가테리움 HK-ISR1 균주 또는 그의 배양액을 유효성분으로 함유하는 인삼병 방제용 미생물 제제를 제공한다.
아울러, 상기 미생물 제제를 이용하여 인삼병을 방제하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 인삼병에 대하여 인삼 자체의 유도전신저항성을 유발하는 신규 바실러스 메가테리움 HK-ISR1 균주를 제공한다.
본 발명자들은 1차적으로 선별된 길항 균주를 분류동정하기 위하여 균주로부터 16S rRNA를 분리하고 이에 대한 염기서열(도 1 참조)을 바탕으로 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 탐색 프로그램을 이용하여 공시균주와 유전자 유사성을 비교한 결과, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) AY030338, DQ105968, AY505510의 염기와 동일하였다(100% 일치). 이 후, MIDI Shertork 미생물 동정 시스템을 이용하여 본 발명의 균주가 가지는 고유한 지방산의 구성 특성을 조사하여 공시균주와 비교한 결과 바실러스 메가테리움과 75%의 유사도를 보여주었다(도 2 참조). 이에 본 발명자들은 상기 결과를 바탕으로 본 균주를 바실러스 메가테리움으로 분류하고, 바실러스 메가테리움 HK-ISR1으로 명명하였으며, 2006년 7월 21일자로 대한민국 수원시 권선구 서둔동 225번지에 위치한 한국농업미생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KACC 91261P).
본 발명자들은 본 발명의 바실러스 메가테리움 균주 HK-ISR1(이하 "HK-ISR1" 이라 칭함)의 생리적 특성을 조사하기 위하여 HCN(hydrogen cyanide), 프로테나아제(proteinase), 셀룰라아제(Cellulase), 펙티나아제(Pectinase), 글루코나아제(Glyconase), IAA(indole acetic acid) 생산여부를 조사하였다. 그 결과, HK-ISR1 균주는 HCN, 프로테나아제, 셀룰라아제, 펙티나아제, 글루코나아제 및 IAA를 생산하지 않았다.
본 발명자들은 상기 HK-ISR1 균주의 인삼병원균에 대한 길항능력을 조사하였다. 그 결과, 인삼병원균들의 균사생육이 전혀 저해되지 않음으로 본 발명의 HK-ISR1 균주는 인삼병원균들의 생육을 직접 억제하는 길항작용은 없는 것을 확인하였다(표 1 참조). 이후 본 발명자들은 HK-ISR1 균주의 배양액을 인삼유묘 줄기 주위의 토양에 관주하고, 지상부에 역병의 유주포자(Phytophthora cactorum)를 접종하여 HK-ISR1 균주와 병원균이 직접적으로 접촉하지 않도록 하였다. 그 결과, 역병 병원균만 처리한 구에서는 평균건전유묘수가 0.8인데 비하여, 역병 병원균과 HK-ISR1의 배양액을 함께 처리한 구에서는 1.5로서 유의성있는 차이를 보였다(도 3 참조). 이를 통하여, 병원균은 침입했을 때 HK-ISR1 균주에 의해 직접 억제되지 않지만, 인삼으로 하여금 방어 관련 유전자의 발현을 유도하여 전신 저항성을 유도함으로써 병해를 억제시킴을 알 수 있었다.
이 후, 본 발명자들은 HK-ISR1에 의한 유도저항성이 일어난 인삼 뿌리 조직의 변화를 관찰하였다. 상기 실험에서 전신 저항성을 보인 인삼 뿌리를 채취하여 뿌리 세포벽의 리그닌 축적여부를 조사하였다. 그 결과, 표피조직세포의 세포벽에 뚜렷이 리그닌이 집적되어 HK-ISR1 균주가 인삼에서 전신저항을 유도하고 있음을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
식물 병원균이 침입 시 병이 발생하려면 1차적인 난관은 세포벽을 통과하여 진전되어야 한다는 것이다(1994, Schafer, W. Annual Review of Phytopathology 32:461-477). 그러나 저항성 식물은 병원균 침입시 세포벽의 변화를 초래하여 기 계적인 강도를 증가시킴으로써 병원균이 생성하는 세포벽 분해효소에 대응한다(1978, Ride, J. P., Annals of Applied Biology 89:302-306). 이러한 세포벽 변화의 한 종류가 리그닌 축적이나 페놀릭 컴파운드(phenolic compound)로 이들은 식물의 저항성과 밀접한 관련이 있다(1992, Nicholson,R.L., Hammerschmidt, R. Annual Review of Phytopathology 30:369-389). 저항성 식물에 식물병원균 침입 초기에 병원균과 접한 식물 세포는 리그닌 또는 페놀릭 컴파운드를 다량 생산하고 이러한 반응은 병원균 균사의 새로운 세포로 이동되는 것을 차단하고 격리하는 기능을 한다(1993, Stein, B.D., Klomparens , K., Hammerschmidt , R. Journals of Phytopathology 137:177-188). 그러므로 본 발명의 HK-ISR1에 의한 유도저항성으로 인하여 증가한 리그닌 축적은 인삼 자체의 병원균에 대한 저항성을 높여줌을 알 수 있다.
본 발명자들은 HK-ISR1 균주 배양액이 묘삼에서 뿌리썩음병 억제효과를 내는지의 여부를 조사하였다. HK-ISR1 배양액에 묘삼을 침지한 후 뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans)으로 이병된 토양과 피트모스(Peat moss)를 혼합하고, 이를 이용하여 묘삼을 재배하였다. 이 후 묘삼의 입묘율을 측정하고, 뿌리썩음 정도를 측정하여 뿌리썩음병의 이병율을 조사하였다. 그 결과 입묘율의 경우, HK-ISR1 균주 배양액 처리구는 79%로 무처리구 11%보다 약 7배 이상 증가하였으며, 건전토양의 입묘율 86%와 통계적 유의차가 없었다(도 5 참조). 근부 이병율의 경우, HK-ISR1 배양액 처리구가 20%, 무처리구는 50%로 통계적 유의차를 보였으며, 60%의 방제 효과를 보였다(도 6 참조). 이를 통하여 HK-ISR1 균주가 인삼 근부병 을 억제함을 확인하였다.
본 발명자들은 HK-ISR1 균주 배양액이 농가 포장에서 뿌리썩음병 억제효과와 수량에 미치는 효과를 조사하였다. 조사시, 개갑된 인삼씨를 배양액에 침지하였다가 파종하였고, 무처리구, 공지된 길항균 처리구, HK-ISR1 균주 처리구 및 관행적으로 사용되는 농약 처리구로 나누어 수행하였다. 그 결과, 건전묘삼비율은 HK-ISR1 균주 처리구가 47.3%로 가장 높았으며, 관행 농약 처리구보다 2배가 넘는 효과를 보였다. 또한 길항성 미생물 제제인 바실러스 서브틸리스 보다 높은 효과를 보였다(도 7 및 표 2 참조). 건전묘삼 수량의 경우 농약 관행구에 비하여 HK-ISR1 균주가 2.6배 증가하였으며, 길항미생물 제제보다 높게 증가하였다(도 8 및 표 3 참조). 건전묘삼비율이 높다는 것은 파종 후 동결 전과 동결 후 저온기에 씨앗에 발생하는 병균과 발아 후 봄, 여름, 가을까지 묘포의 여러 가지 뿌리썩음병과 지상부병들에 의한 피해 및 자란 묘삼이 동결 전, 후 저온기 뿌리썩음병균에 저항하여 살아남았기 때문에 수량이 높아진 것으로 보인다. 수량 비율이 성묘비율의 차이보다 큰 것은 수량이 성묘비율의 증대만으로 기인한 것이 아니고 유도저항성 미생물이 묘삼뿌리 생장을 촉진한 결과라고 볼 수 있다. 일반적으로 생육촉진 근권세균(plant growth promoting rhizobacteria)들이 유도전신저항성을 가져오는 것으로 알려져 있다. 상기 결과를 통해 본 발명의 HK-ISR1 균주는 근부병균인 실린드로카폰 디스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)는 물론 역병균인 파이토푸토라 캑토룸(Phytophthora cactorum)에 대하여 유도저항성 억제능력을 보이며, 역병의 지상부 이병을 막는 것으로 보아 병원균의 침입시 방어관련 유전자의 발현을 유도하여 나타나는 효과로 모든 근부병원균과 지상부 병원균들에 대하여 유도저항성 억제 능력을 가지고 있음을 알 수 있다.
또한, 상기 HK-ISR1 균주 및 그의 배양액을 유효성분으로 함유하는 인삼병 방제용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 인삼병 방제용 미생물 제제는 인삼뿌리썩음병균 및 역병에 대해 유도전신저항성을 가진 상기 HK-ISR1 균주 및 그의 배양액을 함유한다.
본 발명의 인삼병 방제용 미생물 제제가 유도전신저항성을 나타내는 병원균에는 실린드로카폰 디스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 라이족토니아 솔라나이(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 스클레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 후자리움 솔라나이(Fusarium solani), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea), 파이토프토라 캑토룸(Phytophthora cactorum), 피시움 얼티멈(Pythium ultimum), 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides) 등이 있다.
본 발명의 미생물 제제는 미생물의 안정적인 제제화를 목적으로 수화제, 입제 또는 캡슐화의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 미생물 제제에 있어서, 상기 HK-ISR1 균주 또는 그의 배양액을 인삼병 방제용 조성물에 포함된 채로 공급될 수도 있고, 장기간 보존을 위하여 별도로 보관하였다가 사용 직전에 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 미생물을 장기간 보존하기 위하여 별도로 공급되는 경우에는 글리세롤 저장용액에 -70℃ 이하로 보존하거나 -20 ~ -80℃에서 동결건조로 보존하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 수화제는 미생물을 접종한 고체 배지를 건조시켜 분쇄한 후, 계면활성제 및 증량제/영양제를 첨가하고 혼합하여 제조된다. 상기에서 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알켈온 알킬페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용한다.
본 발명의 입제는 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량제/영양제 및 붕해제를 첨가하여 제조된다. 상기에서 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알켈온 알킬페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부 터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin) 및 칼슘 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용한다. 또한 본 발명의 입제는 미생물에 표면 활성제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제 및 흐름제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 것을 추가로 첨가하여 제조될 수 있다.
본 발명의 미생물 제제의 적용은 인삼의 뿌리나 이에 근접한 토양에 HK-ISR1 균주를 집중하여 살포하거나 지상부에 수시로 살포하는 것이 바람직하다. 또한, 미생물 제제의 적용은 밀리리터(㎖)당 1× 106 ~ 1× 109 개의 미생물 농도로 희석한 용액을 인삼의 뿌리에 직접 살포하거나, 밀리리터당 1× 106 ~ 1× 109 개의 미생물 농도로 희석한 용액에 인삼을 침지시킬 수 있다. 본 발명의 미생물 제제를 이용하여 방제효과를 얻을 수 있는 인삼병원균으로는 실린드로카폰 디스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 라이족토니아 솔라나이(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 스클레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 후자리움 솔라나이(Fusarium solani), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea), 파이토프토라 캑토룸(Phytophthora cactorum), 피시움 얼티멈(Pythium ultimum), 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides) 등이 있다.
따라서 본 발명의 미생물 제제는 인삼뿌리썩음병균 및 역병균을 포함하는 지 상부 병원균에 대하여 전신저항을 유도함으로써 우수한 방제능력을 가지며, 환경공해와 인체독성이 없어 환경친화적인 인삼뿌리썩음병균 및 인삼지상부병 방제용 미생물 제제로 유용하게 사용될 수 있다.
아울러, 상기 미생물 제제를 이용하여 인삼병을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 인삼병 방제 효과가 있는 HK-ISR1 균주 또는 이의 배양액을 인삼 또는 그 주위의 토양에 적용하여 인삼병원균을 방제하는데, 이 때 상기 HK-ISR1 균주를 뿌리나 토양에 직접 적용하거나 상기에서 제조한 미생물 제제의 형태로 적용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방제 방법은 인삼의 뿌리나 토양에 상기 HK-ISR1 균주를 희석한 용액을 집중하여 살포하거나, 인삼을 1~2시간 동안 미생물 제제에 침지할 수 있다.
본 발명의 미생물을 인삼 또는 그 주위의 토양에 직접 살포하거나 미생물 제제의 형태로 지상부에 살포하는 것이 바람직하며, 미생물 제제에 적용되는 미생물의 수는 밀리리터(㎖)당 1× 104 ~ 1× 109 cfu/㎖의 미생물 농도로 희석하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제제예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 인삼병원균의 분리 동정
본 발명자들은 인삼뿌리 및 지상부에 병증을 보이는 인삼을 채집하였으며 인삼의 이병부위와 건전부위의 경계부위를 3 ㎜ 정도 크기로 절단하여 차아염소산 나트륨에 약 30초간 침지하고 멸균수로 씻어낸 다음 필터페이퍼로 물기를 제거한 후 한천배지 평판에 올려놓았다. 이것을 20℃의 항온기에서 7일간 배양하여 현미경상에서 형태적 특징을 토대로 동정하였다.
그 결과, 상기 미생물들은 실린드로카폰 디스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 라이족토니아 솔라나이(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 후자리움 솔라나이(Fusarium solani), 보트라이티스 시네리아(Botrytis nerea), 파이토프토라 캑토룸(Phytophthora cactorum), 피시움 얼티멈(Pythium ultimum), 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides)임을 확인하였다.
< 실시예 2> 탐색된 유도전신저항성 미생물의 동정
본 균주의 선발은 인삼 및 타작물의 근권으로부터 분리한 바실러스(Bacillus ) 속 세균 106균주를 인삼 종자실험과 묘삼실험을 통해 선발하였다.
인삼뿌리썩음병의 생물검정을 위하여 사용한 토양은 수원에 소재한 KT&G 소 속 원료연구소의 이병포장으로부터 이병토양을 채집하여 2 mm 채로 친 후 4℃에 보관하면서 사용하였다. 플라스틱 포트(20×30×20 cm, W×L×D)에 멸균한 피트모스(peat moss)를 15 cm 까지 채운 다음 이병토양 1 cm를 덮고 멸균한 피트모스를 20 cm까지 채웠다. 바실러스 106균주는 TSA 배지에 2일간 배양하여 세균현탁액(1×108 cfu/㎖)을 조제하고 개갑 처리한 인삼종자를 1시간 세균현탁액에 침지하였다. 침지한 인삼종자는 준비한 포트에 파종하고 멸균수가 든 플라스틱 용기에 넣어 물을 주었다. 이때 수분이 포트 하단부로부터 토양 표면에 도달한 후 인삼종자가 파종된 포트를 꺼내어 실내(약 20℃)에 위치하였는데 물은 일주일마다 같은 방법으로 물주기를 하였다. 인삼종자 파종 30일 후 건전주 및 뿌리생장을 조사하고 1회 이상 재실험을 수행하여 뿌리썩음병 방제효과가 있는 길항미생물을 1차적으로 선발하였다.
묘삼실험은 저온 보관 중이던 이병토양을 피트모스와 혼합(이병토:피트모스, 1:3 w/w)하여 원형 플라스틱 포트(20×20 cm)에 담아 준비하였다. 1차 선발한 길항미생물은 TSA 배지에서 2일간 배양하여 세균현탁액(1×108 cfu/㎖)을 조제하고 1년생 묘삼을 1시간 동안 세균현탁액에 침지하였다. 침지한 묘삼은 준비된 포트에 10주씩 이식하고 성장실에서 재배하였다. 물주기는 포트 하단으로부터 물이 스며들게 플라스틱 용기에 물을 채우고 묘삼이 이식된 포트를 담그어 물주기를 하였고 일주일에 한번씩 물주기를 하였다. 출아율과 뿌리썩음병 이병율은 처리 30일 후에 육안으로 조사하였다.
탐색된 유도전신저항성 미생물의 분류동정을 위해 16S rRNA를 분리하고 이에 대한 염기서열(도 1 및 서열번호 1)을 바탕으로 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 탐색 프로그램을 이용하여 공시균주와 유전자 유사성을 분석하였다. 그 결과 바실러스 메가테리움(Bacillus metaterium) AY030338, DQ105968, AY505510의 공시균주들과 1401개의 염기 중 1401개의 염기서열 모두가 동일하였다(100% 일치).
Shertork 미생물 동정 시스템(Shertork Microbial Identification System)(1988, Norman, D.J., Yuen, J.M.F. Can. J. Plant Pathol. 20:171-175, 2000, Walcott, R.R et al . Phytopathology 90:191-196)을 이용하여 유도전신저항성 균주가 가지는 고유한 지방산의 구성 특성(도 2)을 비교 분석한 다음 이의 결과를 바탕으로 분류, 동정하였다. 그 결과 바실러스 메가테리움과 74.5%의 유사도를 보였다.
본 발명자는 유도전신저항성 균주의 분류동정을 위하여 16S rRNA 염기서열 비교 데이터 및 균주가 가지는 지방산 구성의 특성을 근거로 바실러스 메가테리움으로 분류하고, 바실러스 메가테리움 HK-ISR1으로 명명하였으며 2006년 7월 21일자로 대한민국 수원시 권선구 서둔동 225번지에 위치한 한국농업미생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 : KACC 91261P).
본 발명자들은 동정 균주인 바실러스 메가테리움 HK-ISR1 균주(이하 “HK-ISR1"이라 칭함)의 생리적 특성을 조사하기 위하여 HCN(hydrogen cyanide), 프로테나아제(proteinase), 셀룰라아제(Cellulase), 펙티나아제(Pectinase), 글루코나아 제(Gluconase), IAA(indole acetic acid) 생산 여부를 조사하였다.
HCN 활성은 글리신(glycine: 4.4 g/ℓ)이 첨가된 TSA(Tryptic soy agar: Becton, Dickinson and company, USA)에 상기 동정된 HK-ISR1 균주를 페트리디쉬에 플레이팅하고 피크르산(picric acid) 용액을 적신 필터 페이퍼 스트립(Whateman Co. USA)을 페트리디쉬 뚜껑에 붙여 28℃ 배양기에 2-4일간 배양하면서 필터 페이퍼의 색깔 변화로 HCN 생산 여부를 조사하였다. 프로테나아제 활성은 스킴 밀크 배지(스킴 밀크 100 g, 효모 추출물 1.5 g, 박토 아가 15 g/1ℓ, 증류수, DIFCO, USA)에 HK-ISR1 균주를 접종하여 48시간 후 형성한 억제대(clearing zone)로 판정하였다. 셀룰라아제 활성은 Teather 및 Wood 방법(1982, Applied and Environmental Microbiology 43:777-780)으로 LB 배지(트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, NaCl 10 g, DIFCO, USA)에 24 시간 배양한 HK-ISR1 균주의 현탁액 10 ㎕를 조제한 배지에 점적하여 25℃에서 48시간 동안 배양한 후 콩고 레드(1 ㎎/㎖) 용액(Sigma, USA)을 추가하여 15분간 배양하여 판정하였다. 펙티나아제 활성은 애플 펙틴이 함유된 배지[(NH4)2SO4 2.0 g, KH2PO4 4.0 g, Na2HPO4 6.0 g, FeSO4·7H2O 1 mg, MgSO4 0.2 g, CaCl2 1 mg, H3BO3 10 ug, MnSO4 10 ug, ZnSO4 70 ug, CuSO4 50 ug, MoO3 10 ug, Apple pectin 5 g, Yeast extract 1 g, Agar 15 g, DW 1000 ㎖)]에 HK-ISR1 균주를 배양하여 1% HTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide) 용액을 플레이트에 첨가하고 10분간 방치한 후 억제대를 관찰하여 판정하였다. IAA 생산 여부는 TSA 배지에 5 mM 1-트렙토판을 첨가하고 니트로셀룰로오스 막 디스 크(nitrocellulose membranse disk)를 배지 위에 올려놓고 HK-ISR1 균주를 점종한 후 28℃에서 3일간 배양하여 살코프스키 시약(Salkowski reagent)(1951, Plant Physiology 26:192-195)과 반응시켜 생산 여부를 판정하였다.
그 결과, 본 발명에서 동정된 HK-ISR1 균주는 HCN, 프로테나아제, 셀룰라아제, 펙티나아제, 글루코나아제 및 IAA를 생산하지 않았다.
< 실시예 3> HK - ISR1 균주의 인삼병원균에 대한 길항능력 및 유도전신저항성( Induced Systemic Resistance ) 조사
본 발명자들은 HK-ISR1 균주가 상기 실시예 1에서 분리한 인삼병원균의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 대치배양을 수행하였다. 구체적으로, HK-ISR1 균주를 TSA 배지를 이용하여 28℃에서 48시간 동안 배양하였다. 대치배양실험을 위한 배지로 PDK 배지[포테이토 덱스트로스 브로스(Potato Dextrose Broth) 10 g, 펩톤(Peptone) 5 g, 아가(Agar) 15 g, 증류수 1 ℓ, DIFCO, USA]를 사용하였다. 멸균된 직경 8 mm의 페이퍼 디스크에 HK-ISR1 균주 현탁액 70 ㎕를 접종 후 페트리디쉬에 분주하여 준비된 PDK 배지의 평판위에 치상하였다. 대치배양을 위해 상기 실시예 1에서 분리한 인삼병원균들을 각각 PDA 배지[포테이토 덱스트로스 아가(Potato Dextrose Agar) 38 g, 아가(Agar) 5 g, 증류수 1 ℓ, DIFCO, USA]에서 7일간 배양한 후 직경 6 mm의 살균된 콜크보러를 이용하여 균사가 자란 배지를 떼어낸 다음 PDK 배지 평판 위에 HK-ISR1 균주와 대치하여 치상하였다. HK-ISR1 균주와 인삼병원균을 치상하여 25℃의 항온기에서 10일간 배양한 후 병원균의 생육저해 정도를 조사하였다.
그 결과, 인삼병원균들의 균사생육이 전혀 저지되지 않음으로 상기 HK-ISR1 균주는 인삼병원균들의 생육을 직접 억제하는 길항작용은 없는 것으로 확인되었다(표 1).
이 후, 인삼유묘 줄기 주위의 토양에 HK-ISR1 균주의 현탁액을 관주하고, 지상부에 역병의 유주포자(Phytophthora cactorum)를 접종하여 HK-ISR1 균주와 병원균이 접촉하지 않도록 처리하였다. 역병 병원균만 처리한 구에서는 평균건전유묘수가 0.8인데 HK-ISR1 균주를 처리한 구는 1.5로서 유의성이 있는 차이를 보였다(도 3). 이를 통해, 병원균이 침입시 HK-ISR1 균주에 의해 직접 억제되지는 않지만 인삼으로 하여금 방어관련 유전자의 발현을 유도하여 전신저항성을 유도함으로써 병해를 억제시키고 있음을 확인할 수 있었다.
바실러스 메가테리움 균주 HK - ISR1 의 인삼 병원균에 대한 항균성
병원균 항균활성＊
실린드로카폰 디스트럭탄스 ( Cylindrocarpon destructans ) -
라이족토니아 솔라나이 ( Rhizoctonia solani ) -
스클레로티니아 스클레로티오룸 (Sclerotinia sclerotiorum ) -
후자리움 솔라나이 (Fusarium solani) -
보트라이티스 시네리아 (Botrytis cinerea) -
파이토프토라 캑토룸 (Phytophthora cactorum) -
피시움 얼티멈 (Pythium ultimum) -
알터나리아 파낙스 (Alternaria panax) -
콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides) -
＊ 항균활성 ; - : 억제대가 없음.
< 실시예 4> 인삼뿌리조직 변화에 의한 HK - ISR1 균주의 유도저항성 조사
실시예 3에서 처리한 묘삼에서 뿌리를 채취하여 뿌리세포벽의 리그닌(lignin) 축적여부를 조사하였다. 30일된 뿌리를 얇게 자라 포르말린-초산-알코올로 고정하고 에탄올과 TBA(tertiary butyl alcohol)로 탈수하고 뿌리조직을 푸로로글루시놀-염산 용액(Sigma, USA)에 1분간 염색하여 현미경하에서 뿌리조직에 축적된 리그닌을 관찰하였다.
그 결과 표피조직세포의 세포벽에 뚜렷이 리그닌이 집적되어 HK-ISR1 균주가 인삼에 전신저항을 유도하고 있음을 확인할 수 있었다(도 4).
< 실시예 5> HK - ISR1 균주 배양액의 인삼뿌리썩음병 방제효과 조사
본 발명자들은 HK-ISR1 균주가 묘삼에서 뿌리썩음병 억제효과를 내는지 여부를 확인하였다. 구체적으로 HK-ISR1 균주를 TSA(Tryptic soy agar, Becton, Dickinson and company, USA)에 2일간 배양하여 1× 108 cfu/㎖ 농도의 현탁액을 제조하여 묘삼을 현탁액에 1시간 동안 침지하고 공지된 뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans)으로 이병된 토양과 피트모스를 1:3(w/w)으로 혼합하여 플라스틱 포트(20 cm×20 cm×20 cm)에 담아 포트 당 묘삼 10 뿌리를 이식하고 생육상(growth chamber)에서 재배하였다. 30일후에 줄기가 출아한 수를 조사하여 입묘율을 측정하고, 뿌리썩음 정도를 측정하여 뿌리썩음병의 이병율을 조사하였다.
그 결과, 입묘율의 경우, HK-ISR1 균주 배양액 처리구는 79%로 무처리구 11%보다 7배 이상 증가하며, 건전토양의 입묘율 85%와 통계적 유의차가 없었다(도 5). 근부 이병율(개체별 뿌리썩음 이병 정도의 총합비율)의 경우, HK-ISR1 균주 배양액 처리구가 20%이며, 무처리구는 50%로 통계적 유의차를 보였으며 하기의 식으로 계산한 결과, 60%의 방제효과를 보였다(도 6).
[방제효과=(무처리 발병율-처리구 발병율/무처리 발병율)× 100]
이를 통해 HK-ISR1 균주가 인삼 근부병을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 6> HK - ISR1 균주 배양액의 처리가 인삼수량 및 건전묘삼비율 증대에 미치는 효과의 포장시험
본 발명자들은 HK-ISR1 균주 배양액이 농가 포장에서 뿌리썩음병 억제효과와 수량에 미치는 효과가 있는지의 여부를 확인하였다. 구체적으로 본 발명의 HK-ISR1 균주를 TSA 배지에 2일간 배양하여 현탁액을 제조하였다. 2004년 11월 개갑(開匣)된 인삼씨에 1× 108 cfu/㎖ 농도의 HK-ISR1 균주 현탁액을 멸균수로 100배 희석하여 칸 당 3 ℓ씩 피트모스에 뿌려 상토를 혼합하였다. 이 후 심기 전 종자를 30분간 HK-ISR1 균주 현탁액(1× 108 cfu/㎖)에 침지하였다가 파종하였다. 한편, 길항균 처리군은 1×107 cfu/㎖ 농도의 길항균 현탁액을 멸균수로 100배로 희석하여 칸 당 3 ℓ씩 피트모스에 뿌려 상토를 혼합하였다. 이 후 심기 전 종자를 30분간 길항균 현탁액(1× 107 cfu/㎖)에 침지하였다가 파종하였다. 관행 농약재배구는 토로스 수화제 1000배 희석액에 인삼종자를 침지 처리하였다. 4개 처리구(무처리구, 길항균 처리구, HK-ISR1 균주구 및 농약 관행구)를 3 반복(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)으로 난괴배치 하였다. 2006년 3월에 묘삼생산량을 처리별 조사를 한 결과 건전묘삼비율(파종 종자수에 대한 건전한 묘삼수)이 47.3%로 HK-ISR1 균주 처리구가 가장 높아 농약 관행구의 21.7%보다 배가 더 높았다. 또한, 길항균 처리구 즉, 길항성 미생물 제제인 바실러스 서브틸리스의 36.2%보다 11.1% 가 높았다(도 7 및 표 2). 건전묘삼 수량은 농약 관행구에 비하여 HK-ISR1 균주 처리구가 2.6배가 늘어났으며(p=0.01) 길항미생물 제제보다 16%가 늘어났다(도 8 및 표 3).
상기 결과를 통하여 일반 포장에서도 HK-ISR1 균주가 뿌리썩음병원균들을 충분히 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
Figure 112006062323859-pat00001
* 같은 문자의 평균치간 유의차가 없음.
Figure 112006062323859-pat00002
* 같은 문자의 평균치간 유의차가 없음.
< 제제예 1> 미생물 제제의 제조
<1-1> 수화제의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 3에서 인삼뿌리썩음병원균에 대해 억제 활성을 가짐을 확인한 HK-ISR1 균주 또는 이의 배양액을 이용하여 인삼뿌리썩음병원균 방제용 미생물 제제를 제조하기 위해, 안정적인 제제화를 목적으로 분말로 물에 희석하였을 때 수화되는 수화제를 제조하였다. 구체적으로, 수화제는 원분을 70℃의 건조기 내에서 2시간가량 건조하여 분쇄하였다. 그 다음에 계면활성제 및 증량제를 첨가하여 혼합하였다. 혼합물을 제트-오-밀(Jet-O-mill, Aljet 사)을 통과시켜 분쇄하고 분쇄분은 수화성을 검사한 후 수화제 형태의 미생물 제제를 제조하였다.
<1-2> 입제의 제조
본 발명자들은 HK-ISR1 균주를 이용한 미생물 제제의 안정적인 제제화를 목적으로 입자 상태로 원상태대로 사용할 수 있는 입제를 제조하였다. 구체적으로, 입제는 원분을 70℃의 건조기 내에서 2시간가량 건조하여 분쇄하였다. 분쇄분은 다시 제트-O-밀을 통과시켜 분쇄한 다음, 미생물 분쇄분, 계면활성제, 증량제/영양제 및 붕해제를 균주의 포자 50%, 폴리카르복실레이트 3%, 소듐리그노설포네이트 3%, 소듐 다이알킬 설포석시네이트 1%, 전분 10%, 벤토나이트 20%, 탈크 13%로 구성으로 혼합하여 혼합분의 전체 분체량의 35% 정도로 가수하고 반죽을 하였다. 반죽이 끝난 후 조립기를 이용하여 입제화(지름 1 mm, 길이 1-5 mm)하고 70℃의 건조기 내에서 건조하였다. 건조물은 16-30 메쉬체를 통과시켜 분제를 제거한 후 입제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐화 제형의 제조
본 발명자들은 HK-ISR1 균주를 이용한 미생물 제제의 안정적인 제제화를 목적으로 캡슐화 제형을 제조하고자 하였다. 구체적으로, 콩가루 11%, 녹두 6%, 쌀가루 4%, 감자전분 4%, 호밀가루 4%, 황토 3%를 섞어 121℃에서 20분간 가압멸균을 하고 난 다음 식기 전에 다시 완전히 섞어 찬물에서 냉각시켰다. 교반기에서(d = 5 cm, 200 rpm 이상) 10분 이상 완전히 섞어준 후, 교반이 계속되는 상태에서 첨가제와 바실러스 메가테리움 균주 HK-ISR1을 넣고 완전히 섞어 미생물 살균 캡슐화 제형을 제조하였다.
<1-4> 미생물 유기물질(퇴비) 제조
커피박, 코이어, 피트모스, 유기질 비료 등을 건열 또는 증기 소독하여 미생물 제제를 30℃에서 배양하였다.
인삼뿌리 및 지상부 병원균에 대하여 유도전신저항성을 가지는 바실러스 메가테리움 HK-ISR1 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제는 인삼 병원균에 길항 능력은 없으나, 식물 자체에 유도전신저항성을 유발하여 발병억제능력을 가지므로 환경친화적 미생물농약으로 유용하게 이용될 수 있다.
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Claims (9)

  1. 하기의 균학적 특징을 가지고, 인삼병에 대하여 인삼 자체의 유도전신저항성을 유발하며 수탁번호 KACC 91261P로 기탁된 신규 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) HK-ISR1 균주:
    ⅰ) 그람 염색시 양성을 나타내는 간균;
    ⅱ) 시안화수소(hydrogen cyanide), 프로테나아제(proteinase), 셀룰라아제(Cellulase), 펙티나아제(Pectinase), 글루코나아제(Gluconase), IAA(Indole acetic acid) 에 비활성; 및
    ⅲ) 지방산의 구성 특성이 바실러스 메가테리움 공시균주와 75% 유사함.
  2. 삭제
  3. 제 1항의 바실러스 메가테리움 HK-ISR1 균주 또는 그의 배양액을 유효성분으로 함유하는 인삼병 방제용 미생물 제제.
  4. 제 3항에 있어서, 인삼병은 실린드로카폰 디스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 라이족토니아 솔라나이(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 후사리움 솔라나이(Fusarium solani), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea), 파이토프토라 캑토룸(Phytophthora cactorum), 피시움 얼티멈(Pythium ultimum), 및 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인삼병원균에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 미생물 제제는 입제, 수화제 또는 캡슐제인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 미생물 제제는 바실러스 메가테리움 균주 HK-ISR1 또는 그의 배양액에 계면활성제, 증량제 또는 영양제를 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  7. 제 3항에 있어서, 상기 미생물 제제에 포함되는 미생물은 밀리리터(㎖) 당 1 × 106 ~ 1× 109 cfu/㎖ 인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  8. 제 3항의 미생물 제제를 이용하여 인삼병을 방제하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 미생물 제제는 인삼의 뿌리나 이에 근접한 토양에 살포하거나 지상부에 수시로 살포하며, 묘삼 또는 종자를 침지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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