KR101563645B1

KR101563645B1 - 식물 병원균에 대하여 항균 활성과 효소활성을 갖는 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 kr-pbs6 균주

Info

Publication number: KR101563645B1
Application number: KR1020140013774A
Authority: KR
Inventors: 노문철; 박찬선; 오현미; 이우송; 김진한
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2014-02-06
Filing date: 2014-02-06
Publication date: 2015-10-27
Also published as: KR20150093027A

Abstract

본 발명은 식물 병원균에 대하여 항균 활성을 갖는 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

식물 병원균에 대하여 항균 활성과 효소활성을 갖는 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6 균주{Bacillus amyloliquefaciens KR-PBS6 as a novel strain with antifungal and enzyme activity}

세계적인 인구증가와 더불어 식량확보라는 문제를 해결하기 위해 농작물의 재배환경도 비약적으로 발전을 하였다. 그러나 농작물 재배시 야생동물, 해충 및 식물성 병원균 등이 생산량에 영향을 미쳐서 세계적으로 220조원에 달할 만큼 경제적으로 손실을 준다. 이 중 우리나라는 3면이 바다로 둘러싸여 있으며 국토의 65%가 산지로서 인구에 비해 땅이 좁고, 최근에는 시설재배를 이용해 원예작물의 재배 면적이 점차 증가하고 있는 추세로서, 주로 재배하는 작물은 수박, 오이, 가지, 고추, 딸기, 참외, 토마토, 멜론, 상추, 부추 등을 재배하며, 병해충에 대한 구제방법으로 유기합성 농약과 생물학적 제제(생물 농약 또는 미생물 농약)를 사용한다. 이 중 유기합성 농약은 1900년대 초에 개발된 것으로, 단기간에 작물의 생산 증대, 안정 공급, 노동력의 경감 등 효과를 볼 수 있다. 그러나 토양오염, 지하수 오염, 농산에 대한 농약축적, 저항성 병원균의 출현 등 부작용을 초래하여, 근년에 들어 선진국을 중심으로 안전 지향, 건강 지향, 자연 지향이라는 사회적 요구가 높아지고 있어 사용에 제한이 많아졌다.

그리하여, UN 환경개발회의의 리오 선언 이후 지구환경 보호를 위해 화학농약의 남용을 제한하고, 이를 대체하기 위하여 미생물 자체 또는 그 기능을 이용한 생물농약이 주목 받고 있다. 생물농약이란 미생물 자체를 직접 이용하거나 함유된 제제를 이용하여 병해충을 방제하는데 사용되는 농약이라 할 수 있다. 이러한 생물농약은 지금까지 알려진 종류로는 크게 미생물 살충제, 미생물 살균제, 미생물 제초제 등으로 구별되며, 독성이 거의 없고, 생태계에 영향이 적고, 약효가 지속 가능하며, 투자비용이 적은 장점이 있다. 그러나 약효 발현이 늦고 제품의 안정성 및 생산 방법상의 난점이 문제가 되고 있다.

이때 개발되는 생물농약 중 미생물제제는 길항 미생물에 의한 생물학적 방제효과와 각종 효소활성에 따른 토양 부숙능을 나타낸다. 이러한 미생물제제의 원리는 이들이 생산하는 항생물질 의한 항생작용, 각종 분해효소에 의한 토양 내 잔류물질 분리를 통한 부숙작용 등에 주된 작용기작을 두고 있다.

현재 미생물제제로 사용가능하게 등록된 대표적인 미생물로는 바실러스 속(Bacillus sp.), 캔디다 속(Candida sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 락토코쿠스 속(Lactococcus sp.), 로도박터 속(Rhodobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 등이 있다. 그리고 유용미생물에 대한 연구가 지속되면서 매년 더욱 많은 미생물이 사용 가능 미생물로 등록되고 있는 실정이고 2000년대 초기까지 약 2조원의 시장을 형성할 정도로 매년 1520%의 고도성장을 유지할 것으로 예측되고 있다. 제품으로 개발 가능한 균주의 대부분이 토양전염에 의해 발생하는 Fusarium solani(모잘록병, 뿌리썩음병), Botrytis cinerea(잿빛 곰팡이병), Rhizoctonia solani(잘록병), Stemphylium herbarum(썩음병, 잎마름병), Diaporthe ambigua(줄기마름병), Colletotrichum acutatum(탄저병), Phytophthora cactorum(역병), Phytophthora capsici(역병), Didymella bryoniae(덩굴마름병) 등에 대한 식물병 방제용으로 제품으로 개발되어 시판되지만, 아직 큰 시장을 점유하지 못하고 있는 실정이다. 상기한 바와 같이, 친환경농업을 위해 생물농약의 사용으로 갈 추세이고, 그 중 식물성 병원균에 대한 피해를 줄이기 위해 길항 작용을 갖는 다양한 미생물이 연구되었지만, 각종 작물의 병해를 유발하는 다양한 병원성 균에 대해 효과적으로 방제할 수 있는 우수한 길항작용을 갖는 미생물은 보고되지 않았다.

이러한 배경 하에 본 발명자들은 각종 작물의 병해를 유발하는 다양한 병원성균에 대하여 효과적으로 방제할 수 있는 우수한 길항작용을 가지는 미생물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 다양한 병원균, 특히 탄저병, 잘록병, 모잘록병, 잎마름병, 덩굴마름병, 줄기마름병, 썩음병, 잿빛 곰팡이병 및 뿌리 썩음병에 탁월한 길항활성과 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 α-아밀라아제(α-amylase) 효소활성을 모두 보이는 균주를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 푸사리움 솔라니(Fusarium solani ), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스템필리움 허바룸(Stemphylium herbarum), 디아포더 암비구아(Diaporthe ambigua), 콜레토르리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum) 및 디디멜라 브리오니에(Didymella brtoniae)로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 병원균에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 수탁번호 KCTC18239P인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 식물병 방제용 미생물 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 푸사리움 솔라니(Fusarium solani ), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스템필리움 허바룸(Stemphylium herbarum), 디아포더 암비구아(Diaporthe ambigua), 콜레토르리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum) 및 디디멜라 브리오니에(Didymella brtoniae)로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 병원균에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 수탁번호 KCTC18239P인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주를 제공한다.

본 발명에서 용어, "바실러스"는 자연계에 널리 분포하는 호기성, 또는 통성혐기성의 그람 양성 간균 속으로, 바실러스 속에 속하는 미생물로서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 등이 있다. 본 발명자들은 항균 활성 및 효소 활성이 우수하여 생물 농약으로 사용할 수 있는 미생물로서, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스에 속하는 신규한 균주를 하기와 같이 규명하였다.

구체적으로, 본 발명에서는 항균 활성 및 효소 활성이 우수하여 생물 농약으로 사용할 수 있는 미생물을 규명하기 위하여 전북 정읍시 내장산에서 부숙능이 좋은 토양을 채취해 0.85% NaCl를 사용해 10⁵까지 희석하여 LB 배지를 사용해 분리하였다. 이 후 LB 배지에 순수 분리하여 -80℃ 냉동고에서 보관하였다. 그 후 LB 배지를 사용해 2일간 배양하여 10,000 rpm, 15 분간 원심분리하여 상등액을 0.25㎛ 필터로 여과하여 배양액과 균체를 분리하였다. 그 후 PDA배지에 구멍을 뚫고, 정제된 배양액을 100 ㎕씩 분주한 후 푸사리움 솔라니, 보트리티스 시네레아, 라이족토니아 솔라니, 스템필리움 허바룸, 디아포더 암비구아, 콜레토르리쿰 아쿠타툼, 및 디디멜라 브리오니에 균주를 배양시켜 상기 균 모두에 대하여 항균활성이 우수한 균주를 분리하였다. 최종적으로 LB 배지에 탈지분유, 카르복시메틸셀룰로오스, 솔로블 스타치를 사용하여 프로테아제, 셀룰라아제, 알파-아밀라아제활성이 우수한 균주를 최종 선택하였고, 이 균주를 동정한 결과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스에 속하는 신규 균주로 규명되었다. 이에 본 발명자는 이를 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6로 명명하고, 한국생명공학연구원 유전자 은행에 2013년 1월 30일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KCTC18239P를 부여받았다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6 균주는 푸사리움 솔라니(Fusarium solani ), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스템필리움 허바룸(Stemphylium herbarum), 디아포더 암비구아(Diaporthe ambigua), 콜레토르리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum) 및 디디멜라 브리오니에(Didymella brtoniae) 균주 모두에 대하여 우수한 항균 활성을 나타낸다(도 1 내지 7; 및 표 2).

상기 푸사리움솔라니는 모잘록병과 뿌리썩음병의 원인균이며, 보트리티스 시네레아는 잿빛 곰팡이병의 원인균이며, 라이족토니아 솔라니는 잘록병과 뿌리썩음병의 원인균이며, 스템필리움 허바룸은 썩음병과 잎마름병에 원인균이며, 디아포더 암비구아는 줄기마름병의 원인균이며, 콜레토르리쿰 아쿠타툼은 탄저병에 원인균이며, 디디멜라 브리오니에는 덩굴마름병의 원인균이므로, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6는 탄저병, 잘록병, 모잘록병, 잎마름병, 덩굴마름병, 줄기마름병, 썩음병, 잿빛 곰팡이병 또는 뿌리썩음병에 대한 생물학적 방제제로서 유용성을 지닌다.

또한, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 상기 균주는 생물 방제 효과뿐만 아니라, 단백질 분해효소인 프로테아제, 섬유소 분해효소인 셀룰레아제 그리고 전분 분해효소인 알파-아밀라아제를 생산한다(도 8 및 표 3).

따라서, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6는 생물학적 방제 효과와 효소 활성을 통한 토양 부숙 효과를 모두 지녀, 친환경 농업을 위한 생물 농약으로서 유용하게 사용될 수 있는 균주이다.

여기서, 생물 농약이란 농작물의 식물 병원균을 방제하기 위해 자연환경에서 분리 채집된 미생물을 제품화한 것으로 정의될 수 있다.

한편, 모잘록병, 뿌리썩음병, 잿빛 곰팡이병, 잘록병, 썩음병, 잎마름병, 줄기마름병, 탄저병 및 덩굴마름병은 농작물의 수확에 있어서 막대한 피해를 초래하는 대표적인 병해이다.

그 중 식물의 탄저병은 콜레토트리쿰 아쿠타툼에 의해 일어나며, 농작물의 잎, 줄기, 과일, 꽃 등을 가리지 않고 파괴하는데, 우리나라 음식에서 빼놓을 수 없는 양념 채소인 고추 작물에서 특히 심한 병해 중의 하나이다(Han K. S. et al., Res. Plant Dis. (2009) 15(2), 88-93).

뿌리 썩음병은 식물체의 뿌리의 일부 또는 전부가 분해되거나 썩는 증상으로, 이의 병원균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 감염되면 뿌리의 내부 조직이 파괴되고 검게 썩을 뿐만 아니라 뿌리의 흡수 능력이 떨어지므로 잎이 떨어지고 결실률이 현저하게 떨어지는 피해를 입힌다(Kim W. G., Korean J. Plant Pathol. (1996) 12(1), 21-32, Jeon H. M., 지치 뿌리썩음병균의 분리동정 및 발생실태조사 (2012) 순천대학교 농학석사학위논문).

잿빛 곰팡이병은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)에 의해 일어나며 시설재배에서 많이 발생하는 병으로, 일반적으로 농작물 중 과채류의 경우 개화 후 꽃부분에서 흔히 발병되기 때문에 열매의 피해가 크다(Cheong S. S. et al., Kor. J. Mycol. (2013) 41(1) 38-41).

잘록병은, 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 의해 발병될 수 있는 토양 전염성 질병으로서, 식물의 일부분, 예컨대 줄기 부분이 잘록하게 마른 증상을 나타낸다.

모잘록병은, 거의 모든 작물에 발생할 수 있는 병으로서 특히 발아하여 얼마되지 않은 어린 묘나 가식한 묘의 줄기 밑둥이 잘록해지면서 쓰러져 죽는 병으로 알려져 있다. 모잘록병은 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)가 대표적인 원인균으로 알려져 있다.

줄기 마름병은, 나무의 원줄기나 가지 등에 발생하는 병으로, 처음에는 표면에 암갈색의 병반이 생겨 점차 부정형이 되며, 병이 걸린 부위는 움푹해이거나 부풀어 터져 가지가 죽게되는 병으로, 동고병으로도 불린다. 줄기 마름병은 디아포더 암비구아(Diaporthe ambigua) 등의 기생으로 발병하는 것으로 알려져 있다.

덩굴 마름병은, 자낭균에 의한 식물병으로서, 수박, 참외, 멜론, 오이, 박, 수세미 등의 잎, 줄기, 열매 또는 열매자루에 발생하는 병이다. 잎에는 처음 소형의 갈색 반점이 생기고, 진전되면 부정형의 대형 갈색병반(1~2cm)으로 확대된다. 줄기와 과경에는 회백색의 작은 반점이 나타나고, 진전되면 줄기를 따라 상하로 병반이 확대되며, 심하면 줄기 전체가 고사하고, 병반상에는 작은 흑색점(병자각, 자낭각)이 많이 형성된다. 상기 덩굴 마름병의 대표적인 병원균으로 디디멜라 브리오니에(Didymella bryoniae)가 알려져 있다.

썩음병은, 병든 부분이 불규칙하게 썩으면서 변색하는 병으로, 스템필리움 허바룸(Stemphylium herbarum)의 기생으로 발생할 수 있다.

잎 마름병은, 잎이 시들어가는 증상을 나타내는 식물의 병으로, 스템필리움 허바룸(Stemphylium herbarum)에 의해 양파, 마늘, 파 등에 특히 나타날 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 균주가 탄저병 및 뿌리썩음병을 비롯한 다양한 식물병을 일으키는 병원균에 대하여 강한 길항작용을 나타내기 때문에, 상기 균주를 친환경적인 무공해 생물농약으로 사용할 경우, 유기합성 농약에 의한 생태계 파괴 및 독성 문제 해소에 유용할 수 있으며, 각 농가의 금전적 부담을 줄일 수 있다. 또한 미생물의 특성상 지속가능하여 향후 장기적인 이익을 볼 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6 균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 식물병 방제용 미생물 제제를 제공한다.

상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6에 대해서는 앞서 설명한 바와 같으며, 상기 균주는 푸사리움 솔라니, 보트리티스 시네레아, 라이족토니아 솔라니, 스템필리움 허바룸, 디아포더 암비구아, 콜레토르리쿰 아쿠타툼 및 디디멜라 브리오니에 균주 모두에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내므로, 상기 균에 의해 야기되는 식물병 방제용으로 사용될 수 있다. 또한 상기 미생물제제는 식물병 방제제로서 사용되는 것 이외에도, 토양 개량제 등의 전반적인 미생물제제로서 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

특히, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6는 농작물의 경작시 문제를 일으키는 식물병원균의 오염에 따른 피해를 줄일 수 있고, 여러 효소활성을 가지므로 이에 따른 토양개선효과를 보는데 적합하다.

상기 식물병원균의 오염에 따른 피해는 푸사리움 솔라니, 보트리티스 시네레아, 라이족토니아 솔라니, 스템필리움 허바룸, 디아포더 암비구아, 콜레토르리쿰 아쿠타툼 및 디디멜라 브리오니에의 생육을 포함한다.

또한, 상기 균에 대한 항균 활성을 나타내는 한, 상기 균주뿐만 아니라, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물 또는 이들의 혼합물 역시 상기 미생물 제제에 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에서 용어, "포자"는 세균 등의 번식 세포를 말하며, 본 발명의 목적상 상기 포자는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 번식 세포를 의미한다. 본 발명에서 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 포자는 푸사리움 솔라니, 보트리티스 시네레아, 라이족토니아 솔라니, 스템필리움 허바룸, 디아포더 암비구아, 콜레토르리쿰 아쿠타툼 및/또는 디디멜라 브리오니에에 대한 항균 활성을 나타내어 식물병 방제용 미생물 제제에 포함되어 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 균주를 배양한 다음 수득한 산물을 의미하며, 배양된 균주를 포함하거나, 배양된 균주가 제거된 형태 모두 포함한다.

한편, 본 발명의 상기 균주는 생균제로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 액상 생균제, 생균분말의 형태로 사용할 수 있다.

이때, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6 균주를 포함하는 생균제 및 생균 분말은 부형제, 희석제를 더 포함할 수 있으며, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6 균주는 단독으로 또는 다른 추출물, 부산물과 함께 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6 균주는, 각각 통상의 방법에 따라 배양액, 분말의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 균주를 이용한 미생물 제제에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 스테비아 추출물, 광물유 및 천연소재 추출물 등을 들 수 있다.

이러한 본 발명의 미생물 제제는 사용할 때 물에 500 내지 1,000배 희석해서 옆면 살포 및 뿌리에 관주하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 상기 미생물 제제를 식물 또는 상기 식물의 생육 환경에 유입시키는 단계를 포함하는, 식물의 방제 방법을 제공한다.

상기 미생물 제제 및 방제에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

바람직하게, 상기 식물병은 모잘록병, 뿌리썩음병, 잿빛 곰팡이병, 잘록병, 썩음병, 잎마름병, 줄기마름병, 탄저병 또는 덩굴마름병일 수 있다.

상기의 미생물제제는 작물을 정식하기 전 토양을 개간할 때, 정식한 후 15일부터 또는 장마철과 발병직전 시기에 식물체 지상부에 경엽처리 방법과 식물체 뿌리부분에 관주를 이용해 살포하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6 균주는 탄저병, 잘록병, 모잘록병, 잎마름병, 덩굴마름병, 줄기마름병, 썩음병, 잿빛 곰팡이병 또는 뿌리썩음병의 원인이 되는 식물병원균에 대하여 우수한 항균활성 및 생육 억제 효과를 보이고, 프로테아제와 셀룰라아제, 알파-아밀라아제의 효소활성이 우수하여 토양부숙능에 영향을 미친다. 따라서, 본 발명의 상기 균주는 생균제 및 생균 분말로 사용되어, 생태계 파괴를 막을 수 있는 친환경적인 미생물제제로 매우 유용하다.

도 1은 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 2는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 3은 보트리티스 시네리아(Botritis cinerea)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 4는 스템필리움 허바룸(Stemphylium herbarum)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 5는 디아포더 암비구아(Diaporthe ambigua)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 6은 콜레토르리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 7은 디디멜라 브리오니에(Didymella bryoniae)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 프로테아제, 셀룰라아제, 알파-아밀라아제에 대한 효소활성을 나타낸 것이다.

이하, 하기 예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 사용 균주의 분리

본 실시예에서는 푸사리움 솔라니, 보트리티스 시네레아, 라이족토니아 솔라니, 스템필리움 허바룸, 디아포더 암비구아, 콜레토르리쿰 아쿠타툼 및 디디멜라 브리오니에를 시험균주로 하여 이에 항균력을 갖는 미생물을 분리하기 위하여 전북 정읍시에 위치한 내장산에서 토양 시료를 수거하여 하였다. 시료 채취는 표토층의 15 센티미터 전후의 깊이를 선정하여 채취하였으며, 잡초, 낙엽 등의 이물질을 제거하였다. 이를 지퍼백에 담아 밀봉한 후, 0 ~ 4℃의 상태로 실험실에 운반하였다. 채취한 시료 1 g을 토양 희석 한천평판법으로 10⁵ 배까지 희석하여 희석액 0.1 mL를 LB 배지에 분주하여 배지 전면에 골고루 편 다음, 37℃ 배양기에서 2일간 배양 후 생성되는 콜로니를 순수 분리하여 LB 고체 배지(표 1)에 옮겨 -80℃에서 보관하면서 사용하였다.

시험 균주는 푸사리움 솔라니, 보트리티스 시네레아, 라이족토니아 솔라니, 스템필리움 허바룸, 디아포더 암비구아, 콜레토르리쿰 아쿠타툼 및 디디멜라 브리오니에를 사용하였으며, 7 균주에 공통적으로 강한 항균력을 나타내는 가장 우수한 한 균주를 선별하였다. 선별된 균주의 균총은 LB 고체 배지에서 원형의 콜로니를 형성하며, 갈색을 내면서 나타났다.

배지 성분	농도(g/L)
효모추출물(Yeast extract)	5.0
Tryptone	10.0
NaCl	10.0
한천(Agar)	15.0

실시예 2: 분리한 균주 동정

선별한 균주의 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 16S ribosomal RNA의 염기서열을 분석하였다. 선별한 균주를 변형된 colony PCR 법을 사용하여 PCR 증폭하였다. 16S rRNA 증폭에 사용된 프라이머(primer)는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 서열번호 1), 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 2), UP-1S(5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3', 서열번호 3), UP-2R(5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3', 서열번호 4)로 증폭한 후, PCR 산물 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 증폭 산물을 정제하여 DNA sequencer 3730xl(applied biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 최종 선별한 균주의 16S rDNA를 DDBJ/NCBI/Genebank와 Ribosomal database project의 데이터 베이스에서 상동성을 분석한 결과, 바실러스 속의 종을 포함하는 계통학적 그룹에 속하는 균주로서, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NBRC 15535T (AB255669) 표준균주를 포함하는 근연종과 99% 이상의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되었다.

한편, gyrB 유전자는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 그룹의 근연종인 바실러스 서브틸리스 subsp. 서브틸리스(B. subtilis subsp. subtilis ), 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 아트로패우스(B. atrophaeus), 바실러스 벨레젠시스(B. velezensis), 바실러스 발리스모티스(B. vallismortis), 바실러스 서브틸리스 subsp. 스피지지엔이(B. subtilis subsp. spizizenii) 및 바실러스 소노렌시스(B. sonorensis)의 중간 유연관계를 파악하는데 최근 가장 유용한 정보로 사용되고 있으므로, 상기 분리된 균주의 gyrB 유전자의 염기서열을 기초로 분자계통학적 분석을 수행하였다. 그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(DQ309294)와 99.07%의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되었다.

또한, 균체 지방산 조성을 분석한 결과에서도 주요 지방산으로 C₁₅ _:0 anteiso(40.43%), C₁₅ _:0 iso (24.73%)를 나타내었으며, C₁₄ _:0, C₁₆ _:0과 같은 포화지방산과 C₁₄ _:0 iso, C₁₆ _:0 iso, C₁₇ _:0 iso 그리고 C₁₇ _:0anteiso와 같은 분지형 지방산을 함유하는 특징을 나타내었으며, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 표준 균주의 주요 균체지방산 조성과도 유사한 균체지방산 조성을 갖는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명의 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스에 속하는 신규 균주임을 최종 확인하였으며, 이를 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6라 명명하였다. 또한 이를 대전광역시 유성구 과학로 125에 위치한 한국생명공학연구원 생명자원센터(Korea Collection for Type Culture; KCTC)에 2013년 1월 30일자로 기탁 완료하고, 수탁번호로 KCTC18239P를 부여받았다.

실시예 3: 각종 식물 병원균에 대한 항균활성 측정

식물 병원균으로는 식물에 막대한 피해를 야기하는 다양한 병원균인 Rhizoctonia solani AG-2-1 KACC 40123(잘록병), Botrytis cinerea KACC 40573(잿빛 곰팡이병), Fusarium solani KACC 40384(모잘록병, 뿌리 썩음병), Diaporthe ambigua KACC 41219(줄기마름병), Colletotrichum acutatum KACC 40689(탄저병), Didymella brtoniae KACC 40669 (덩굴마름병), Stemphylium herbarum(썩음병, 잎마름병)의 7 종의 시험균을 한국농업미생물자원센터에서 분양받아 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KR-PBS6의 항균활성 범위를 조사하였다.

구체적으로, 감자한천배지(PDA, Difco)에 각 병원균을 배양하여 종균으로 사용하였고, LB배지에서 생육시킨 분리 균주의 배양액을 원심분리 후 0.25㎛ 필터로 걸러 시료로 사용하였다. 그 다음, 먼저 굳힌 한천배지에 직경 5 mm의 구멍을 뚫어 전처리가 된 배양액을 넣어 흡습시켰고, 그 가운데에 각 병원균을 배양하여 25℃에서 3~7일간 배양했다.

여기서, 길항미생물이 각종 병원균에 미치는 영향을 저지원의 유무로 조사하였고, 그 결과를 하기 표 2 및 도 1 내지 7에 나타내었다.

그 결과, 상기 표 2 및 도 1 내지 7에 나타낸 바와 같이 본 발명의 균주는 시험한 7종 균주 모두에 우수한 항균 활성을 나타내었고, 특히 Diaporthe ambigua KACC 41219(줄기마름병), Colletotrichum acutatum KACC 40689(탄저병), Didymella brtoniae KACC 40669 (덩굴마름병), Stemphylium herbarum(썩음병, 잎마름병) 균에 대하여 항균 활성이 특히 더 우수한 결과를 나타내었다.

실시예 4: 분리균주의 효소활성 측정

분리 균주의 효소활성 측정은 LB 배지에 1% 스킴 밀크(skim milk)를 첨가하여 투명환의 크기를 측정하여 프로테아제 활성을 측정하고, 셀룰라아제 활성은 LB배지에 CMC를 0.5%를 첨가하여 24시간 배양 후 0.2% Congo-red로 15분간 염색하여 1M NaCl로 탈색하는 과정을 거쳐 노란환의 크기를 측정하였다. α-아밀라아제 활성은 1% soluble starch를 넣은 배지에 24시간 배양 후 Rugol's 용액을 떨어뜨려 주위에 생성되는 노란환의 크기를 측정하였고 그 결과를 하기 표 3 및 도 8에 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 균주는 프로테아제, 셀룰라아제, 및 아밀라아제 활성이 우수한 결과를 나타내었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC18239P

20130130

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Bacillus amyloliquefaciens KR-PBS6 as a novel strain with antifungal and enzyme activity <130> PA131319KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F Primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R Primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP-1S Primer <400> 3 gaagtcatca tgaccgttct gcaygcnggn ggnaarttyg a 41 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP-2R Primer <400> 4 agcagggtac ggatgtgcga gccrtcnacr tcngcrtcng tcat 44

Claims

푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스템필리움 허바룸(Stemphylium herbarum), 디아포더 암비구아(Diaporthe ambigua), 콜레토르리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum) 및 디디멜라 브리오니에(Didymella brtoniae)로 이루어진 모든 병원균에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 수탁번호 KCTC18239P인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 탄저병, 잘록병, 모잘록병, 잎마름병, 덩굴마름병, 줄기마름병, 썩음병, 잿빛 곰팡이병 또는 뿌리 썩음병에 대하여 방제 효과를 가지는 것이 특징인 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 프로테아제, 셀룰라아제 및 아밀라아제 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스템필리움 허바룸(Stemphylium herbarum), 디아포더 암비구아(Diaporthe ambigua), 콜레토르리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum) 및 디디멜라 브리오니에(Didymella brtoniae)로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 병원균에 의하여 야기되는 식물병 방제용 미생물 제제.
삭제
제4항에 있어서, 상기 식물병은 탄저병, 잘록병, 모잘록병, 잎마름병, 덩굴마름병, 줄기마름병, 썩음병, 잿빛 곰팡이병 및 뿌리 썩음병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 미생물 제제.
제4항에 있어서, 상기 미생물 제제는 토양 부숙 효과를 나타내는 것인 미생물 제제.
제4항의 미생물 제제를 식물 또는 상기 식물의 생육 환경에 유입시키는 단계를 포함하는, 식물병의 방제 방법.