KR20090058132A - 신규한 바실러스 섭틸리스 균주 및 이를 함유한 고추탄저병방제용 농약 제제 - Google Patents

신규한 바실러스 섭틸리스 균주 및 이를 함유한 고추탄저병방제용 농약 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토양으로부터 분리되고 고추탄저병의 원인균에 대하여 항균활성을 가지는 바실러스 섭틸리스 균주, 상기 바실러스 섭틸리스 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 고추탄저병 방제용 농약 제제 및 이를 이용하여 고추탄저병을 방제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 균주는 고추탄저병의 원인균에 대한 항균활성이 우수하면서도 고추에 유해한 영향을 미치지 않고 과실의 생육을 촉진시킬 수 있다.
바실러스 섭틸리스, 고추탄저병

Description

신규한 바실러스 섭틸리스 균주 및 이를 함유한 고추탄저병 방제용 농약 제제 {Novel Bacillus Subtilis and Biopesticide for Extermination of Anthracnose Containing the Same}
본 발명은 신규한 바실러스 섭틸리스 균주 및 이를 함유한 고추탄저병 방제용 농약 제제에 관한 것으로, 보다 자세하게는 토양으로부터 분리되고 고추탄저병의 원인균에 대하여 항균활성을 가지는 바실러스 섭틸리스 균주, 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 고추탄저병 방제용 농약 제제 및 이를 이용하여 고추탄저병을 방제하는 방법에 관한 것이다.
지난 100년간 급격한 세계인구 증가로 인하여 지구상의 전 인류는 식량 확보라는 어려운 문제에 직면하게 되었고, 이를 해결하기 위한 방법으로 병충해 및 잡초 방제기술개발, 품종개량, 토양 비옥도 증진 등을 이용하여 꾸준히 식량의 증산을 이루어왔다. 이 중에서도 화학 농약을 이용한 병충해 및 잡초 방제방법은 농업생산력 증대에 없어서는 안 될 중요한 요인으로 인식되어 왔으며, 이로 인해 전 세계적으로 화학 농약의 사용량은 꾸준히 증가하고 있는 추세이다.
그러나, 계속적인 화학 농약의 사용은 부족한 식량난의 해결에 큰 기여를 하였지만, 그 동안 무차별한 남용으로 인해 농약 중독, 지하수 오염, 토양 오염, 인축에 대한 독성, 농산물 중의 잔류, 각종 병해충 및 잡초에 대한 저항성 개체 출현 등과 같은 부작용을 초래하였다. 한편, 1992년 UN 환경개발회의의 리오 선언 이후 지구 환경 보호를 위한 노력이 진행되었고, WTO가 설립되면서 환경과 무역을 연계시킨 국제 무역 다자간 협상, 즉 그린라운드가 본격적으로 진행되면서 인류에게 식량을 제공하는 농업도 환경친화적 농업으로 전환이 필요하였기에 그 일환으로 작물보호 분야에서 화학 농약 사용량의 제한 및 잔류 허용량 등을 강화하고 있는 실정이다.
이러한 화학 농약 사용의 문제점을 해결하기 위해 미생물 자체 또는 그 기능을 직접 및 간접적으로 이용하는 생물 농약이 최근에 주목을 받고 있다.
"생물 농약"이란 농작물의 해충 및 병원미생물, 잡초를 방제하기 위하여 자연환경에서 분리 채집된 미생물 및 천연 물질, 천적 등을 제품화한 것으로 정의하고 있다. 이러한 생물 농약은 화학 농약에 비하여 약효의 발현 및 지속기간이 길며, 농약의 개발기간 및 개발비용이 화학 농약에 비해 저렴하고, 인축에 대한 독성 및 환경파괴 등과 같은 부작용이 없다는 장점이 있다.
이에, 본 발명자들은 우리나라의 주요 농가에서 주로 재배하고 있는 고추를 대상으로 상기 생물 농약의 장점을 이용한 고추탄저병 방제기술을 연구하여 왔다.
고추는 우리나라에 들어온지 약 300년이 지나는 동안 한국인의 식생활에 뿌리 깊이 토착화되어 전통적 식생활에 빼놓을 수 없는 중요한 식용작물이다. 고추 는 생산면적에서도 전체 채소 재배면적 중 가장 많이 재배되고 있는 양념 채소 작물로서 농가소득에 기여도가 높은 작물이며, 고추 재배면적은 전체 채소 재배면적의 22.5%를 차지하고, 고추의 국민 1인당 소비량은 매년 7.1%씩 증가하는 추세이다.
그러나, 고추를 연작함에 따라 토양 내에 충분한 전염원이 조성되고, 여름철 장마에 쉽게 감염되어 고추병해의 피해가 늘어가고 있다. 그 중에서도 고추탄저병은 고추의 최대 병해중의 하나로 잎, 줄기, 과실 등에 주로 발병하며 매년 고추의 10% 이상이 수확시기에 감염되어 고추 생산량 감소의 직접적인 저해원인으로 작용한다.
콜레토트리쿰 속은 불완전균류에 속하는 식물 병원성 진균으로 탄저병을 일으키는 대표적인 다범성 병원균으로 국내에서는 콜레토트리쿰 속에 속하는 5종이 분리 동정된 바 있다.
이 중 콜레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes)는 진균계의 불완전균에 속하며, 포자층에서 분생포자와 강모를 형성하고, 감염부위에서 균핵을 형성한다. 분생포자는 긴 방추형이며, 강모는 흑색이고 바늘모양이다. 이 균의 생육온도 범위는 3∼33℃이고, 생육적온은 26∼28℃이다. 주로 고추 유묘의 잎과 줄기, 어린과실에 병원성이 강하며 분생포자의 형성 뿐 아니라 균핵을 형성하여 토양에 5년 이상 생존하므로 이 병이 발생했던 묘상에 계속 고추묘를 육묘하는 것은 매우 위험하다.
또한, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioi -des)는 고추탄저병균 중 제일 강력한 병원균으로 보고되었으며, 청과 및 적과 모두 발병시킨다. 병원균의 생육온도는 4~35℃로 최적온도는 28~32℃이며 고온 다습할 때와 강우시에 발생이 많다. 발병시 과실에 발생된 무늬 위로 홍색의 포자로 된 점질물이 흘러나온다. 병원균의 포자는 점질물에 싸여 있어 바람에 의한 비산보다는 비바람과 같은 물리적인 힘에 의하여 전파된다. 안개와 이슬도 병원균의 포자형성을 촉진시켜 병든 과실에서 흘러내린 물방울로도 전파되며, 종자전염의 대표적인 균으로 병든 과실의 종자 내외부에 흡착하여 전염된다.
이러한 고추탄저병의 방제방법으로는 일반적으로 이미다졸계 및 트리아졸계 등과 같은 화학 물질을 이용하여 방제를 시도하고 있지만, 쉽게 방제가 되지 않으며 환경오염물질로서 화학 농약의 사용으로 인한 부작용이 심각하다. 따라서, 최근 생물 농약의 관심이 증가됨에 따라 고추재배에서 고추탄저병의 방제를 위한 새로운 방제방법의 개발이 필요한 실정이다. 이에 따라 당업계에는 다양한 고추탄저병 방제용 생물 농약이 개시되어 있다.
대한민국공개특허 제 2002-0090254호는 식물 병원성 진균에 대해 광범위한 항진균 활성 스펙트럼을 가지는 신규의 미생물 바실러스 폴리믹사 (Bacillus polymyxa) EBM99와 이를 함유하는 입고병 및 고추탄저병 등에 대한 식물 병원성 진균 방제용 미생물 농약을 개시하고 있다.
또한, 대한민국등록특허 제 10-0574348호는 그리세오풀빈 (griseofulvin)을 생산하는 자일라리아 (Xylaria) 속 AH001 균주를 포함하는 식물병 방제용 제제, 상 기 미생물 제제를 이용하여 고추탄저병을 포함한 식물병을 생물학적으로 방제하는 방법, 상기 그리세오풀빈을 생산하는 신규한 자일라리아 속 AH001 균주, 상기 균주로부터 그리세오풀빈을 생산하는 방법을 개시하고 있다.
또한, 대한민국등록특허 제 10-0597317호는 고추탄저병 방제에 유용한 항균성 물질을 생산하는 방선균속 신규균주, 상기 균주를 함유하는 고추탄저병 방제용 미생물농약제제 및 상기 미생물농약제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 고추탄저병의 방제방법을 개시하고 있다.
본 발명자들은 고추탄저병을 방제할 수 있는 또 다른 생물 농약을 개발하기 위하여 토양으로부터 분리한 바실러스 섭틸리스 균주가 고추탄저병 원인균에 대한 항균활성이 우수하면서도 고추에 유해한 영향을 미치지 않고 과실의 생육을 촉진시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 한 관점으로서, 토양으로부터 분리되고 고추탄저병의 원인균에 대하여 항균활성을 가지는 바실러스 섭틸리스 균주를 제공한다.
다른 관점으로서, 상기 바실러스 섭틸리스 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 고추탄저병 방제용 농약 제제를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 상기 고추탄저병 방제용 농약 제제를 이용하여 고추탄저병을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 토양, 바람직하게는 고추 재배가 끝난 토양으로부터 고추탄저병의 원인균, 특히 콜레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes)와 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioi - des)에 대한 항균활성을 가지는 균주를 분리하였다.
이렇게 분리된 미생물의 동정을 위하여 먼저 API 키트 (API 50 CHB)를 이용하여 각종 탄소원에 대한 반응 여부를 확인하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
또한, 상기 미생물은 15 내지 45℃의 온도, 5 내지 10의 pH, 8% 이하의 염화나트륨 농도에서 성장하는 것으로 동정되었다.
아울러, 상기 미생물은 16s rDNA (ribosomal DNA) 염기서열 분석을 이용하는 분자 유전학적 방법을 수행한 결과, 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 로 동정되었다.
상기 분석에 의해 동정된 바실러스 섭틸리스는 "바실러스 섭틸리스 GA-2005"라고 명명하여 2007년 9월 10일자로 부다페스트조약에 의한 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM; 서울시 서대문구 홍제 1동 361-221 유림빌딩 2층)에 기탁하고, 기탁번호 KCCM-10882P를 부여받았다.
바실러스 섭틸리스 GA-2005의 API 키트 동정 결과
API CHB API CHB
0 대조군 - 25 에슐린 +
1 글리세롤 + 26 살리신 +
2 얼티트리톨(Ertythritol) - 27 셀로비오스 +
3 D-아라비노스 - 28 말토스 +
4 L-아라비노스 + 29 락토오스 +
5 리보스 + 30 멜리비오스 +
6 D-크실로오스 + 31 사카로오스 -
7 L-크실로오스 - 32 트레할로스 +
8 아도니톨(Adonitol) - 33 이눌린 -
9 β-메틸-크실로시드 - 34 멜레치토스 -
10 갈락토오스 + 35 D-라피노스 +
11 D-글루코오스 + 36 아미돈 -
12 D-프룩토오스 + 37 글리코겐 -
13 D-만노오스 + 38 크실리톨 -
14 L-소르보스 - 39 β-젠티오비오스 -
15 람노스 - 40 D-투라노오스 -
16 듈시톨(Dulcitol) - 41 D-릭소오스 -
17 이노시톨 + 42 D-타가토오스 -
18 만니톨 + 43 D-퓨코오스 -
19 소르비톨 + 44 L-퓨코오스 -
20 α-메틸-D-만노시드 - 45 D-아라비톨 -
21 α-메틸-D-글루코시드 + 46 L-아라비톨 -
22 N-아세틸 글루코사민 - 47 글루코네이트 -
23 아미그달린 + 48 2-케토-글루코네이트 -
24 알부틴 - 49 5-케토-글루코네이트 -
일반적으로 바실러스 속 균주는 진균에 대하여 강력한 항진균 활성을 가지는 것으로 보고되어 있다. 바실러스 속 균주는 자연계에 널리 분포하는 그람양성 세균으로 토양으로부터 용이하게 분리할 수 있으며, 막대 모양의 간균으로 편모가 있어 활발히 활동하고, 균체의 중앙에 원형 또는 난원형의 아포를 형성한다. 또한 여러 가지 분해효소를 이용하여 토양내의 염류집적 현상을 해소할 뿐 아니라 세포외로 분비되는 여러 가지 독소를 이용하여 항진균 활성을 가지는 장점이 있다. 바실러스 속 균주의 대부분이 인체에는 비병원성이며, 내생포자의 형성으로 장기간 보존이 용이하기에 생물 농약 분야에서 상당히 유용하다.
한편, 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스는 통상적인 바실러스 속 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들면 TSA 배지 (Tryptic Soy Agar), PDA 배지 (Potato Dextrose Agar), 영양한천배지 (Nutrient Agar) 등을 사용할 수 있다. 미생물 배양은 통상의 바실러스 속 배양 조건상에서 가능하며, 예를 들어, 배양 온도는 30℃ 내지 40℃에서, 바람직하게는 35℃ 내지 37℃의 온도에서, 배양 시간은 20시간 내지 28시간, 바람직하게는 22시간 내지 26시간 정도면 배양할 수 있다.
추가로 배양물 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 (centrifugation) 또는 여과 (filtration) 과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉장 (-4℃)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 상기 농축된 균체가 본 발명에 따라 고추탄저병을 방제하는데 이용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 균주는 고추탄저병의 원인균, 특히 콜레토트리쿰 코코데스와 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스에 대한 항균활성을 보이므로 상기 균주 또는 이의 배양물은 고추탄저병 방제에 이용될 수 있다.
본 발명의 고추탄저병 방제용 농약 제제는 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 균주 또는 상기 균주의 배양물로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 고추탄저병 방제용 농약 제제가 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 균주의 배양물로 이루어진 경우에 상기 균주는 103 cfu/ml 내지 109 cfu/ml의 양으로, 보다 바람직하게는 104 cfu/ml 내지 108 cfu/ml의 양으로, 가장 바람직하게는 105 cfu/ml 내지 107 cfu/ml의 양으로 함유될 수 있다.
본 발명의 고추탄저병 방제용 제제는 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 균주 또는 상기 균주의 배양물을 약제학적으로 허용된 담체와 혼합하여 다양한 생물 농약 제제의 형태, 즉 액제, 수화제, 분제, 입제, 유제 등으로 제조된 것이 보다 바람직하다. 그 제조방법은 당업계에 공지된 일반적인 제조방법에 따르며, 담체로는 물, 화이트 카르본, 카올린 등을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 고추탄저병 방제용 농약 제제는 성장 중인 고추의 표면 또는 보다 바람직하게는 고추가 생장하고 있는 토양에 처리함으로써 고추탄저병 원인균에 의한 고추 성장의 억제 및 이로 인한 고사를 방제할 수 있다.
본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 균주는 고추탄저병의 원인균, 특히 콜레토트리쿰 코코데스와 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스에 대한 항균활성이 우수하면서도 고추에 유해한 영향을 미치지 않고 과실의 생육을 촉진시킬 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 토양으로부터 미생물의 분리 및 선별
경기도 화성시 야산 및 밭의 토양 지하 2 내지 3cm 지점에서 토양을 채취하였다. 상기 토양시료는 0.85% 생리식염수에 십진 희석법으로 희석하였다. 한편, 일반적으로 곰팡이를 배양할 때 사용하는 배지인 PDA 배지 (Potato Dextrose Agar)를 멸균한 후 약 45℃까지 식히고 고추탄저병의 주요병원균인 콜레토트리쿰 코코데스와 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 배양물을 각각 상기의 배지에 첨가하여 페트리디쉬에 도말하고 굳혔다. 고추탄저병원균이 첨가되어 굳힌 배지에 상기의 희석한 토양시료 100 ㎕를 도말하고, 25℃에서 7일간 배양한 후 가장 큰 항균활성을 나타내는 균주를 분리하였다. 1차 분리된 균주는 총 4균주였다.
상기 분리된 균주들을 다시 PDA 배지에서 대칭배양법으로 고추탄저병의 주요병원균인 콜레토트리쿰 코코데스와 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스에 대한 항균력을 측정하였다. 최종적으로 선별된 균주를 '분리균 GA-2005'로 명명하였다. 상기 측정된 결과를 도 1a 와 1b에 나타내었다.
실시예 2 : 분리된 균주의 동정 및 특성분석
상기 실시예 1에서 분리한 분리균 GA-2005의 생리학적 특성은 API kit(API 50 CHB)를 이용하여 당 이용성 (표 1)을 통하여 확인하였고, 더욱 정확한 동정을 위해 상기 균주의 게놈 DNA 중 미생물의 동정에 유효한 것으로 알려진 16S rDNA의 염기서열을 자동염기서열결정기로 결정하여 분리균 GA-2005의 유전학적 위치를 동정하였으며, 이를 도 2에 나타내었다.
분석 결과, 상기 분리균 GA-2005는 바실러스 섭틸리스로 동정되었다. 이에, 상기 미생물을 "바실러스 섭틸리스 GA-2005"라고 명명하여 2007년 9월 10일자로 부다페스트조약에 의한 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하고, 기탁번호 KCCM-10882P를 부여받았다.
실시예 3 : 포장실험에서 바실러스 섭틸리스 GA-2005 처리에 의한 고추탄저병 방제 효과 및 고추의 수확량에 미치는 영향
고추를 대상으로 포장실험을 실시하여 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 GA-2005의 고추탄저병 방제 효과 및 고추의 생장에 미치는 영향을 측정하였다.
고추 종자를 모두 묘포에 파종하여 물을 주기적으로 공급하고 온도를 20℃ 내지 35℃로 유지하여 11주간 재배하였다. 한편, 고추 유묘가 이식될 토양에 바실러스 섭틸리스 GA-2005 배양물을 뿌려 경운하고 이랑을 만들어 포장하여 준비하고, 상기의 고추묘를 이식하였다. 대조군의 경우에는 본 발명의 미생물 균주가 함유되지 않은 토양에 이식하였다. 식물의 성장 및 고추탄저병 발생에 대해 경작지 정식 후 주기적으로 관찰 기록하였다.
고추의 수확량을 표 2에 나타내었고, 고추탄저병 발생율 및 포장실험 사진을 표 3 및 도 3에 나타내었다.
포장실험에서 바실러스 섭틸리스 GA-2005 처리에 의한 고추의 수확량
7월 5일 (생산량/평) 7월 12일 (생산량/평) 8월 2일 (생산량/평) 9월 5일 (생산량/평) 생산량 / 평
대조군 0.22 ㎏ 0.53 ㎏ 0.81 ㎏ 0.41 ㎏ 1.97 ㎏
실험군 0.38 ㎏ 1.00 ㎏ 1.13 ㎏ 0.88 ㎏ 3.39 ㎏
표 1에 나타낸 바와 같이 포장실험에서 고추의 수확량은 실험군의 수확량이 대조군에 비해 대략 두 배정도 많았다. 즉, 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 균주는 고추에 유해한 영향을 미치지 않고 과실의 생육을 촉진시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
포장실험에서 바실러스 섭틸리스 GA-2005 처리에 의한 고추탄저병의 방제효과
묘목수(개) 감염된 묘목(개) 발생율(%)
대조군 3,360 840 25.0
실험군 1,200 35 2.9
표 2에 나타낸 바와 같이, 포장실험에서 바실러스 섭틸리스 GA-2005 처리에 의한 고추탄저병의 방제효과는 대조군에 비해 실험군이 약 10배 정도 높았으며, 이러한 결과를 도 3에 사진으로 나타내었다. 즉, 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 균주는 콜레토트리쿰 코코데스와 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스에 대하여 탁월한 항균활성을 보인다는 것을 확인하였다.
도 1a와 1b는 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스가 고추탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스와 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스에 대하여 16S rDNA의 염기서열 분석을 통하여 유전학적 위치를 동정한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스가 고추탄저병을 방제할 수 있다는 것을 포장 실험을 통하여 보여주는 사진이다.

Claims (6)

  1. 토양으로부터 분리되고 고추탄저병의 원인균에 대하여 항균활성을 가지는 바실러스 섭틸리스 균주.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 고추탄저병의 원인균은 콜레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes)와 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioi-des)인 것을 특징으로 하는 바실러스 섭틸리스 균주.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 균주는 기탁번호 KCCM-10882P인 것을 특징으로 하는 바실러스 섭틸리스 균주.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 바실러스 섭틸리스 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 고추탄저병 방제용 농약 제제.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 고추탄저병 방제용 농약 제제가 바실러스 섭틸리스 균주의 배양물로 이 루어진 경우에 상기 바실러스 섭틸리스 균주는 103 cfu/ml 내지 109 cfu/ml로 함유되는 것을 특징으로 하는 고추탄저병 방제용 농약 제제.
  6. 제 4항에 따른 고추탄저병 방제용 농약 제제를 이용하여 고추탄저병을 방제하는 방법.
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