KR100995286B1 - 바실러스 벨레첸시스 균주와 이에 따른 배지 및 미생물 제제 - Google Patents

바실러스 벨레첸시스 균주와 이에 따른 배지 및 미생물 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 벨레첸시스(Bacillus velezensis) 균주와 이에 따른 배지 및 미생물 제제에 대한 것으로, 특히 고추 병원성 균(Ralstonia solanacearum)에 대하여 항균활성을 가지는 새로운 바실러스 벨레첸시스 KACC 91513P 균주에 대한 것이며, 이러한 균주는 고추 풋마름병(청고) 방제에 우수한 효과가 있다. 또한, 본 발명은 상기한 균주를 배양하기에 최적으로 적합한 성분 및 조성을 가지는 배지를 제공하며, 상기한 균주를 포함하는 고추 풋마름병 방제용 미생물 제제를 제공하는 것이다.
바실러스 벨레첸시스, 고추 풋마름병. 항균활성

Description

바실러스 벨레첸시스 균주와 이에 따른 배지 및 미생물 제제{Bacillus velezensis strain, growth medium for the same and microbial agent containing the same}
본 발명은 항진균 활성세균인 바실러스 벨레첸시스(Bacillus velezensis) 균주와 이에 따른 배지 및 미생물 제제에 대한 것으로, 특히 고추 병원성 균(Ralstonia solanacearum)에 대하여 항균활성을 가지는 새로운 바실러스 벨레첸시스 균주와, 상기 균주를 배양하기에 최적으로 적합한 성분 및 조성을 가지는 배지 및 상기 균주를 포함하는 미생물 제제에 대한 것이다.
바실러스(Bacillus)는 현재 151종 2아종(2008년 6월 기준)이 존재하고, 그 중에서도 B. velezensis 균주는 남부 스페인의 Velez 강에서 채취된 약염수로부터 분리된 균으로서 surfectant를 생산하는 특성을 가지고, 길쭉한 내생포자를 paracentral or subterminal에 형성하며, non-swollen sporangia를 가진다. 또한, Peritrichous flagella에 의한 운동성을 가지며, 액체배지에서 자랄 때 표면에 얇 은 막을 형성하는 특징이 있다. 그리고, NaCl 농도 12% 까지 잘 자라며, 온도 15~45에서 잘 자란다고 알려져 있다(Ruiz-Garcia, C., Bejar, V., Martinez- Checa, F., Llamas, I. & Quesada, E. (2005). Bacillus velezensis sp. nov., asurfactant- producing bacterium isolated from the river Velezin Malaga, southern Spain. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55, 191-195.).
바실러스 벨레첸시스(B. velezensis) 균주에 관한 기존의 연구로서, 박 등은 보리 흰가루병, 오이 흰가루병, 딸기 흰가루병, 딸기 탄저병, 잿빛곰팡이병, 시들음병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병과 같은 식물병에 대해 방제효과가 우수하였다고 하였고(박정헌, 문교형, 2008. 바실러스 벨레첸시스 NS05균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제, 대한민국, 등록특허 제10-0817428호), 유 등은 딸기 시들음병인 후사리움 옥시스포름 프라가리에(Fusarium oxysporum f. sp. fragariae)를 효과적으로 방제할 수 있으며, 딸기의 생육촉진 및 수확량 증대효과를 볼 수 있다고 하였다(유성준, 곽두원, 2007. 신규한 바실러스속 미생물균주를 이용한 딸기 시들음병방제용 미생물제제 및 그 제조방법, 대한민국 등록특허 제10-0781300호).
한편, 고추 풋마름병(청고)은 초기에는 식물체의 지상부가 푸른 상태로 시들고, 발병이 좋은 환경이 되면 전체적으로 급속히 시드는 병이다. 초기증상이 나타난 후 2~3일이 지나면 완전히 시든다. 줄기 내부는 갈색으로 변하며, 줄기를 잘라 물에 담가 보면 하얀 우윳빛의 세균액이 분출된다. 병원체는 Ralstonia solanacearum 균으로 그램음성의 간상세균으로 호기성이며, 수개의 편모를 가지고 있어서 운동성이 있다. 세포의 크기는 0.5~0.7 X 1.5~2.0 이다. King's B 배지에서 형광을 띠지 않는다. 생육적온은 34이다. 병원균은 토양 내에서 수년간 생존할 수 있으며, 병든 식물체의 잔재 속에서 월동한다. 주로 식물의 지하부에 생겨난 상처를 통해 침입하지만, 간혹 지상부 조직에 생긴 상처를 통해 침입한다. 병원균은 농기구, 곤충 및 인축에 의해 전반된다. 그리고, 고온 다습한 조건에서 급격히 발생한다고 알려져 있다(조원대, 김완규, 지형진, 최홍수, 이승돈, 김충회, 유재기, 고현관, 이승환, 최준열, 이관석, 2000. 채소 병해충 진단과 방제, p 52~53).
고추 풋마름병(청고)을 일으키는 R. solanacearum 균주는 미국의 A. Kelman이 1954년도에 개발한 Tetrazolium chloride agar 배지(Peptone 10 g, casein hydrolysate 1 g, glucose 0.5 g, agar 20 g을 살균증류수 1 l에 넣고 고압멸균한 후, 0.5% 2,3,5-triphenyltetrazolium Cl (TZC) 용액 10 을 혼합)에서 중앙이 pink색인 흰색 콜로니를 형성하는 특징을 가진다(이영근, 2005. 식물세균병학 사전, p 49).
현재 전국적으로 고추, 토마토 등의 작물에 풋마름병(청고)에 의한 피해가 심각한 상태에 놓여있다. 이러한 풋마름병(청고)은 농작물생육에 큰 피해를 주어 농업 생산성에 가장 커다란 걸림돌이 되는 병해문제 중 하나이다. 그러나, 상기한 기존의 특허를 포함하여 현재까지 국내외적으로 풋마름병(청고)을 뚜렷하게 방제할 수 있는 구체적이고도 성공적인 환경친화형 기술은 전무한 실정이다. 즉, 상기한 2개의 등록특허(등록특허 제10-0817428호, 등록특허 제10-0781300호)는 바실러스 벨레첸시스(B. velezensis) 균주가 보리 흰가루병 등에 항균활성을 가지고 있다는 것일 뿐, 고추 풋마름병에 대해서는 전혀 기재된 바가 없고, 상기 보리 흰가루병을 일으키는 식물 병원성균과 고추 풋마름병을 일으키는 식물 병원성균은 종과 속이 전혀 다른 식물 병원균이기 때문이다. 따라서, 고추 풋마름병(청고)을 예방 및 방제하기 위한 환경친화형 미생물제제의 개발은 절실한 과제라 사료된다.
이에 본 발명자들은 국내 토착미생물을 이용하여 풋마름병(청고)을 생물학적인 방법으로 방제하는 방법을 연구 개발하던 중, 고추 풋마름병(청고)을 일으키는 R. solanacearum 균주에 대하여 항균활성이 탁월한 바실러스 벨레첸시스(B. velezensis) BYA-3 균주를 분리하였고, 이 균주를 이용하여 고추 풋마름병(청고) 방제용 미생물제제로서의 개발 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 따라, 본 발명은 고추 또는 토마토 등과 같은 식물에 발생하는 병원성 균에 대하여 우수한 항균활성을 가지는 새로운 바실러스 벨레첸시스 균주를 제공하는 것이 목적이다.
또한, 본 발명은 상기한 균주를 배양하기에 최적으로 적합한 성분 및 조성을 가지는 배지를 제공하며, 상기한 균주를 포함하는 미생물 제제 또는 미생물 농약을 제공하기 위한 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 식물 병원성 균에 대하여 항균활성을 가지는 바실러스 벨레첸시스(Bacillus velezensis) KACC 91513P 균주이다.
본 발명의 다른 실시형태는, 상기한 균주를 배양하기에 최적으로 적합한 성분 및 조성을 가지는 배지일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 상기한 균주를 포함하는 미생물 제제 또는 미생물 농약이며, 더욱 바람직하게는 고추 풋마름병 방제용인 것이 적합하다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
상기한 본 발명에 의하면, 고추 또는 토마토 등과 같은 식물에 발생하는 병원성 균에 대하여 우수한 항균활성을 가지는 새로운 바실러스 벨레첸시스 균주를 제공할 수 있다. 또한, 상기 균주를 포함하는 미생물 제제 또는 미생물 농약을 제공하는 것도 가능하다.
이를 통하여, 본 발명은 고추 또는 토마토 등과 같은 식물에 발생하는 풋마름병(청고)의 발생을 효과적으로 방제할 수 있다.
그리고, 본 발명에 따른 상기 균주는 현재 널리 상용되고 있는 제초제, 살균제, 살충제 등 화학농약에 대한 저항성을 가지고 있기 때문에, 이들 농약과 혼합하여 사용하는 것도 가능하다.
이와 함께, 본 발명은 상기한 균주를 배양하기에 최적으로 적합한 성분 및 조성을 가지는 배지를 제공할 수 있다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 식물 병원성 균에 대하여 항균활성을 가지는 바실러스 벨레첸시스(Bacillus velezensis) KACC 91513P 균주이다.
즉, 본 발명은 고추나 토마토 등과 같은 식물에 작물병을 일으키는 병원성 균에 대한 항균 활성을 가지는 균주에 대한 것이다. 여기서, 상기 식물 병원성 균은 고추 풋마름병(청고)을 일으키는 Ralstonia solanacearum 균일 수 있고, 이에 따르면 본 발명은 고추 풋마름병 방제용 바실러스 벨레첸시스 KACC 91513P 균주일 수 있다.
본 발명자들은 국내 토착미생물을 이용하여 고추 풋마름병(청고)을 방제할 수 있는 미생물제제를 연구 개발하던 중, 고추 풋마름병(청고) 방제효과가 탁월한 바실러스 벨레첸시스(B. velezensis) BYA-3 균주를 분리하였고, 이를 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주로 명명하였으며, 이를 2009년 11월 17일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 수탁번호 KACC 91513P를 부여받았다. 이에 따라, 본 발명은 수탁번호 KACC 91513P 로 기탁된 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 균주는 전국 각지에서 수집된 많은 토양시료 중에서 특별히 전북 완주군 고산면의 밭흙으로부터 분리하였으며, 본 발명에 따른 균주와 동일하거나 비슷한 특성을 가지는 균주는 이외에 다른 지역의 토양에서도 얻을 수 있을 것이다.
그리고, 본 발명자들은 상기 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주가 현재 사용되고 있는 농약에 대해서도 저항성을 가진다는 것을 확인하였다. 그래서, 본 발명에 따른 상기 균주는 현재 널리 상용되고 있는 제초제, 살균제, 살충제 등 화학농약에 대한 저항성을 가지고 있기 때문에, 이들 농약과 혼합하여 사용하는 것도 가능하다.
이와 함께, 본 발명은 상기한 균주를 배양하기에 최적으로 적합한 성분 및 조성을 가지는 배지일 수 있다.
즉, 본 발명의 다른 실시형태는, 상기한 균주를 배양하기 위한 것으로, 물(H2O) 1 리터(l) 당, 글루코스(Glucose) 2~3 중량부 및 효모추출물(Yeast extract) 2~4 중량부를 포함하고, 펩톤(Peptone)은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨 레첸시스 BYA-3 KACC 91513P 균주 배양용 배지일 수 있다. 상기 글루코스 및 효모추출물이 상기한 범위를 벗어나서 포함되거나, 펩톤이 포함되는 경우에는, 후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와같이 균주의 생장 정도가 미흡하였다.
또한, 본 발명에 따른 균주 배양용 배지는, 상기 균주를 배양하기 위한 것으로, 물(H2O) 1 리터(l) 당, 글루코스(Glucose) 8~12 중량부, 효모추출물(Yeast extract) 0.1~2 중량부 및 펩톤(Peptone) 1~3 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 KACC 91513P 균주 배양용 배지도 가능하다. 상기 글루코스, 효모추출물 및 펩톤이 상기한 범위를 벗어나서 포함되는 경우에는, 후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와같이 균주의 생장 정도가 미흡하였다.
나아가, 본 발명의 또 다른 실시형태는, 상기한 균주를 포함하는 미생물 제제 또는 미생물 농약인 것이 가능하다.
상기한 바와 같이 본 발명에 따른 균주는 항균활성을 가지는바, 이것을 식물 병원성 균에 대한 방제용으로 활용 가능하다. 특히, 고추 풋마름병(청고) 방제용으로 사용하는 것이 적합하다. 사용형태는 특별히 제한되는 일이 없이 어떠한 형태의 미생물 제제이거나 미생물 농약일 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 고추 풋마름병(청고) 방제용 미생물의 탐색 및 분리
먼저, 고추 풋마름병(청고)을 일으키는 Ralstonia solanacearum 균에 대하여 항균활성이 높은 균주를 선발하고자 하였다.
실험에 사용된 Ralstonia solanacearum 균은 농업유전자원센터에서 분양받은 Ralstonia solanacearum KACC 10695 균을 이용하였다. R. solanacearum KACC 10695에 항균활성이 있는 균을 분리하기 위해서, 전국 각지로부터 수십 종류의 토양시료를 수집하였고, 이와는 별도로 R. solanacearum KACC 10695 균주를 도말하여 조제한 고형배지를 준비하였다. 이어서, 상기 수집한 각각의 토양시료 1 g을 멸균증류수에 현탁 한 후, 평판희석법을 이용하여 상기 준비한 고형배지의 페트리디쉬에 도말, 접종한 다음, 30℃ 항온기에서 2~3일 배양하여 R. solanacearum KACC 10695 균주에 항균활성이 있는 균주를 선발하였다.
도 1은 본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주의 Ralstonia solanacearum KACC 10695 균주에 대한 항균활성의 일례를 보여주는낸 사진이고, 여기에 나타난 BYA-3 균주는 전북 완주군 고산면의 밭흙으로부터 분리한 것이다.
실시예 2: 균주의 동정
상기 실시예 1에 의해 분리된 BYA-3 균주를 동정하기 위하여, 생리적, 생화학적인 검사를 수행하였다(BERGEY's Manual of Systemic Bacteriology).
그 결과, 뉴트리언트 아가 배지상에서 노란색이 비치는 우유빛의 콜로니(Creamy white)를 가지며 피막을 형성했고, 형태학적 특성으로는 호기성 간균이었다. 최소배지 M9(Na2HPO4·7H2O 12.8g, KH2PO4 3g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g, 2mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 0.2%의 글루코스, 0.5%의 카사미노산(casamino acid)/H2O 1ℓ)배지에서 생장하였다. 다른 생리생화학적 특성은 하기 [표 1]에 정리하였다.
[표 1 : 본 발명에 따른 BYA-3 균주의 생리적, 생화학적 특성]
조사항목 특성
형태(Cell type) 간균
운동성(Motility) 양성
그람염색(Gram stain) 양성
락토오스(Lactose) 양성
글라이코겐(Glycogen) 양성
젤라틴 액화력(Gelatin liquefaction) 양성
트윈 20(Tween 20) 음성
트윈 80(Tween 80) 음성
산화효소(Oxydase) 양성
전분가수분해(Starch hydrolysis) 양성
다른 한편으로, 더욱 정확한 균주의 동정을 위하여 16S rDNA 서열에 의한 균주의 계통학적 분류를 실시하였다.
이를 위하여 상기 BYA-3 균주를 대상으로 뉴트리언트 액체배지에서 72시간동안 진탕배양한 후 이들 균체로부터 DNA를 추출하였으며, 이를 PCR (primers: 27F, 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 및 1492R, 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'/ 30 cycles: 95 2 min, 94 30 sec, 55 30 sec, 72 42 min, 72 5 min, then 16 8)로 증폭시켜 정제하고 Genetic Analyzer 310A (Applied Biosystems)을 사용하여 염기서열을 분석하였다(Jukes, T. H. & Cantor, C. R., 1969. Evolution of protein molecules. In Mammalian protein metabolism, pp. 21-132. Edited by H. N. Munro. NewYork: Academic Press.).
그 결과 BYA-3 균주의 16S rDNA 서열에 의한 염기서열은 [도 2]와 같이 나타났으며, 16S rDNA 서열에 의한 유효세균과 그 관련세균의 분류학적 위치를 나타내는 계통수(philogenetic tree)는 [도 3]과 같이 나타났다(Saitou, N. & Nei, M., 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol., 4, 406-425.). 즉, Bacillus 는 현재 151종 2아종(2008년 6월 기준)이 존재하는데, 이들 중 B. velezensis 표준균주와 16S rDNA 염기서열이 99.88% 일치하는 매우 높은 유사도를 보였다. 이외에 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus vallismortis, Bacillus subtilis, Bacillus atrophaeus 등의 표준균주와도 99% 이상의 높은 유사도를 보였다(Roberts, M. S., Nakamura, L. K. & Cohan, F. M., 1996. Bacillus vallismortis sp. nov., acloserelative of Bacillus subtilis, isolated from soil in Death Valley, California. Int. J. Syst. Bacteriol., 46, 470-475.). 상기 BYA-3 균주는 16S rDNA 염기서열 약 858bp가 분석되었는데, 보고된 B. velezensis 표준균주와 단 하나의 염기만이 틀리며, 99% 이상의 유사도를 보이는 다른 균주와도 5개 정도만이 상이할 뿐이었다. 따라서, 본 발명에 따른 BYA-3 균주는 상기 99% 이상의 유사도를 보이는 균주 중의 한 종으로 예측 가능했다.
한편, 858bp의 염기서열을 사용한 계통수 분석에 의하면, [도 4]에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 BYA-3 균주는 B. velezensis 표준균주와 같은 가지를 형성하며, 상기 B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. vallismortis 표준균주와 동일집단을 형성하는 것으로 나타났다. 통상적으로 16S rRNA 유전자의 염기서열 97%를 기준으로 종을 판단 하는 추세에 따르면 BYA-3 균주는 유사도 분석표 상의 많은 종 들 중의 한 종으로 볼 수 있으나, 계통수 심화분석에서(1000 bootstrap) B. velezensis와 동일가지를 형성하는 정도가 60% 이상으로 나타나 B. velezensis 로 판정할 수 있었다(Goodfellow, M., Manfio, G. P. & Chun, J., 1997. Towards a practical species concept for cultivable bacteria. In The Units of Biodiversity-Speciesin Practice, pp. 25-59. Edited by M. F. Claridge, H. A. Dawah & M. R. Wilson. London: Chapmanand Hall., Stackebrandt, E. & Goebel, B. M., 1994. A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Bacteriol., 44, 846-849.). 따라서, 본 발명에 따른 상기 BYA-3 균주를 바실러스 벨레첸시스(B. velezensis) BYA-3 균주라고 최종 명명하였다.
실시예 3: 바실러스 벨레첸시스 BYA-3의 상용농약에 대한 저항성 및 생존능력 시험
본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주의 상용농약에 대한 저항성 및 생장능력을 조사하였다.
구체적으로, 경작지에서 높은 빈도로 사용되는 농약을 조사하여 제초제 4종, 살균제 4종, 살충제 6종 등 14 종의 농약을 선정하고, 시판되고 있는 농약을 구입하여 사용하였다. 이들 농약의 제품명, 유효성분 및 용도를 [표 2]에 나타내었으며, 농약에 대한 저항성 분석은 경작지에서 사용되는 추천농도 및 추천농도의 10배량의 농약이 첨가된 멸균증류수 20㎖ 에, 상기 실시예 1에 따른 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주 1.0×106 cfu/㎖ 농도 1 ㎖을 접종하고, 24시간 동안 진탕하였다. 이후 위의 시료 100 ㎕ 를 취하여 GYA([실시예 4] 참조, Glucose 2.5 g, Yeast extract 3g, Agar 18g /H2O 1ℓ) 배지에 도말한 후, 30 에서 1일간 배양하여 균주의 성장 여부를 측정하였다.
[표 2 : 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주의 농약에 대한 저항성 검사]
농약 제품명 유효성분 종류 대상 병해충
성분명 함유량
(%)
그라목손인티온 Paraquat dichloride 23.1 제초제 비선택성
글라신 Glyphosate 41.0
밧사그람 엠60 Bentazone
MCPA		 31.0
4.6		 화본과를 제외한 잡초
하이로드 Glyphosate-ammonium 41.0 비선택성
다찌에이스 Hymexazol
Metalaxyl-M		 30.0
2.0		 살균제 벼잘록병, 모썩음병
동방바리문 Validamycin-A 5.0 잎집무늬마름병, 갈색잎마름병
프로왕 Carpropamid
Edifenphos		 5.0
20.0		 잎도열병, 깨씨무늬병, 목도열병, 세균성벼알마름병, 이삭누룩병
포청천 Flutolanil
Propamocarb hydrochloride		 5.0
35.0		 고추 잘록병
런너 Methoxyfenozide 21.0 살충제 혹명나방, 이화명나방, 파밤나방, 배추좀나방, 담배나방, 멸강나방, 자나방류, 감꼭지나방, 복숭아명나방, 뒷날개흰나방
박멸탄 Etofenprox 4.0 벼물바구미, 이화명나방, 애멸구
빅카드 Clothianidin 8.0 주머니깍지벌레, 노린재류, 감광총채벌레, 이세리아깍지벌레, 밤바구미, 초록애매미충, 열점박이잎벌레, 찔레수염진딧물, 담배가루이, 솔수염하늘소, 꽃노랑총채벌레
앨버드 Metaflumizone 20.0 배추좀나방, 담배나방
에이팜 Emamectin benzoate 2.15 오이총채벌레, 아메리카잎굴파리, 차먼지응애, 파밤나방, 배추좀나방, 꽃노랑총채벌레, 파굴파리, 담배가루이, 배추좀나방, 파밤나방, 완두굴파리, 열점박이잎벌레, 무궁화잎밤나방, 소나무재선충
응애단 Fenazaquin 10.0 귤응애, 점박이응애, 응애류
그 결과, 하기 [표 3]에 나타난 바와 같이, 바실러스 벨레첸시스 BYA-3은, 제초제인 그라목손인티온(Paraquat dichloride), 글라신(Glyphosate), 밧사그람엠 60(Bentazone, MCPA), 하이로드(Glyphosate-ammonium), 살균제인 다찌에이스(Hymexazol, Metalaxyl-M), 동방바리문(Validamycin-A), 프로왕(Carpropamid, Edifenphos), 포청천(Flutolanil, Propamocarb hydrochloride), 살충제인 런너(Methoxyfenozide), 박멸탄(Etofenprox), 빅카드(Clothianidin), 앨버드(Metaflumizone), 에이팜(Emamectin benzoate) 및 응애단(Fenazaquin)에 뛰어난 저항성을 나타내었다. 즉, 상기한 농약들이 추천농도 및 추천농도의 10배량이 첨가된 멸균증류수에서도 균체의 감소가 없었고, 일부에서는 오히려 증가하였다.
[표 3 : 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주의 화학농약에 대한 생존력 시험 결과]
종류 제품명 유효성분 24시간 후 생균수(cfu/㎖)
유효 성분명 함유량(%) 기준량 10배량
제초제 그라목손인티온 Paraquat dichloride 23.1 2.2X106 2.1X106
글라신 Glyphosate 41.0 1.4X106 1.5X106
밧사그람엠60 Bentazone
MCPA		 31.0
4.6		 3.6X106 2.6X106
하이로드 Glyphosate-ammonium 41.0 7.4X105 1.0X106
살균제 다찌에이스 Hymexazol
Metalaxyl-M		 30.0
2.0		 3.1X106 1.9X106
동방바리문 Validamycin-A 5.0 2.8X106 2.0X106
프로왕 Carpropamid
Edifenphos		 5.0
20.0		 2.8X106 1.9X106
포청천 Flutolanil
Propamocarb hydrochloride		 5.0
35.0		 3.1X106 3.2X106
살충제 런너 Methoxyfenozide 21.0 3.5X106 3.3X106
박멸탄 Etofenprox 4.0 2.7X106 2.5X106
빅카드 Clothianidin 8.0 2.3X106 5.4X106
앨버드 Metaflumizone 20.0 3.1X106 4.0X106
에이팜 Emamectin benzoate 2.15 1.7X106 3.2X106
응애단 Fenazaquin 10.0 2.4X106 4.3X106
실시예 4: 미생물 배양용 배지 조성 및 액상형 미생물제제의 제조
본 실시예는 상기한 BYA-3 균주를 배양하기에 최적으로 적합한 성분 및 조성을 가지는 배지를 제조하기 위한 것이다.
균주를 배양하거나 배양을 위한 배지는 미생물제제의 제품생산 단가에 직접적인 영향을 미친다. 특히, 배지 원료로서 peptone 및 yeast extract 은 원재 구입단가가 비싸기 때문에, 균주를 배양하기에 최적으로 적합한 성분 및 조성을 가지는 배지를 제조하는 것은 중요하다.
이에 따라, 본 실험에서는 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주를 최소의 영양원으로 배양하여 생산단가를 줄이고자 하였다. 이를 위하여 본 발명자들은 Glucose(Samchun Pure Chemical Co. Ltd, Korea), Yeast extract(DSM Limited Company, Netherlands), 및 Peptone(Duchefa Biochemie, Netherlands)이 아래 [표 4]의 조성으로 혼합되어 제조된 배지를 각각 20 ㎖ 씩 만들었으며, 여기에 본 발명에 따라 미리 배양된 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주 100 ㎕씩을 접종한 후, 30℃의 진탕배양기에서 48시간 동안 배양하면서 관찰하였다.
[표 4 : 최적 미생물 배양용 배지선정을 위한 배지의 조성]
구분 배지조성
(H 2 O 1 ℓ당 첨가량) 		구분 배지조성
(H 2 O 1ℓ 당 첨가량) 		구분 배지조성
(H 2 O 1 ℓ당 첨가량)
A Glucose 2.5 g
Yeast extract 3.0 g
Peptone 5.0 g		 A-1 A의 1/2로 희석 A-2 A의 1/4로 희석
B Glucose 2.5 g
Yeast extract 3.0 g		 B-1 B의 1/2로 희석 B-2 B의 1/4로 희석
C Glucose 2.5 g
Peptone 5.0 g		 C-1 C의 1/2로 희석 C-2 C의 1/4로 희석
D Yeast extract 3.0 g
Peptone 5.0 g		 D-1 D의 1/2로 희석 D-2 D의 1/4로 희석
E Yeast extract 3.0 g E-1 E의 1/2로 희석 E-2 E의 1/4로 희석
F Peptone 5.0 g F-1 F의 1/2로 희석 F-2 F의 1/4로 희석
G Glucose 10.0 g
Yeast extract 1.0 g
Peptone 2.0 g		 I Glucose 10.0 g
Peptone 2.0 g		 K Yeast extract 1.0 g
H Glucose 10.0 g
Yeast extract 1.0 g		 J Yeast extract 1.0 g
Peptone 2.0 g		 L Peptone 2.0 g
그 결과는 하기 [표 5]에 나타내었다. 즉, [표 4]의 배지 중 B, G 조성이 전체적으로 가장 우수하게 성장하였다[표 5]. 아래 [표 5]의 결과를 조합할 때, 각 균주들은 Yeast extract 가 생장에 가장 중요한 요소이고, 그 다음으로 Glucose 였으며, Peptone은 바실러스 벨레첸시스(B. velezensis) BYA-3 균주의 생장에 큰 도움이 되지 못하는 것으로 판단된다.
이에 따라, 본 발명의 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주는 Glucose 2.5 g, Yeast extract 3g /H2O 1ℓ의 조성으로 배양하는 것이 가장 경제적이면서 효과적인 것을 확인할 수 있다. 이러한 조성의 배지를 GY 배지(Glucose Yeast media)라고 명명하였다.
[표 5 : 각 배지 조성별 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주의 생장정도]
구분 균주 생장정도/비고 구분 균주 생장정도/비고 구분 균주 생장정도/비고
A ++ A-1 ++ A-2 +
B +++ B-1 ++ B-2 +
C + C-1 - C-2 -
D + D-1 + D-2 -
E + E-1 + E-2 +
F - F-1 - F-2 -
G +++ I - K +
H ++ J + L -
-; 균주생장이 눈으로 확인불가, +; 약간 자람, ++; 중간, +++; 매우 잘 자람
그래서, 본 발명에 따른 균주의 배양은 상기 GY 액체배지를 기본으로 사용하였다. 균주는 GY 고체배지에서 형성된 콜로니(colony)를 취하여 GY 액체배지 100㎖ 에 접종하고 48시간 종균배양을 하였다. 본 배양을 위해서는 액체배지 1.5 ℓ를 함유하는 3ℓ 삼각플라스크에 상기에서 얻은 종균 배양액을 접종하여 배양하였다. 배양조건은 30℃에서 150 rpm으로 48시간 동안 진탕 배양하였다. 배양된 균은 원심분리기를 이용하여 배양액을 제거한 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 미생물수가 109~1010 cfu/㎖가 되도록 멸균증류수로 현탁하여 4℃에서 보관하며 이를 미생물제제원액으로 사용하였다. 이 미생물제제원액을 500㎖ 에 균수가 106~108 cfu/㎖가 되도록 희석하고 여기에 영양제, 미량요소, 그리고 기타 첨가제를 혼합하여 미생물제제를 제조하였다.
실시예 5: 제조된 미생물제제의 활성시험
상기 실시예 4를 통해 얻은 미생물 제제를 고추 풋마름병(청고)이 자주 발생하는 전라북도 완주군 고산면에 소재한 연동 시설하우스 토양 2,640m2(800평) 중 660m2(200평)에서 재배하였다. 2009년 04월 01일 꽈리고추를 정식하고 9월 30일까지 고추를 재배하면서, 상기 미생물제제를 1,000배 희석하여 2009년 04월 14일 1차 처리하였고, 이후 약 30일 간격으로 총 3회 관주 처리하여 그 결과를 관찰하였다. 미생물제제 처리에 따른 토양분석 결과는 [표 6]에 나타낸 바와 같다.
[표 6 : 미생물제제 처리에 따른 토양분석]
날짜 검사항목 pH EC CEC 유기물 총질소 유효인산 K Ca Mg
(dS/m) (cmol/kg) (%) (mg/kg) (cmol/kg)
5월14일
(1차처리 30일 후)		 대조구 1 7.22 0.36 16.72 5.55 0.16 1115 2.02 9.82 3.14
대조구 2 6.66 0.50 14.63 5.51 0.18 1094 1.48 8.63 2.92
대조구 3 6.87 0.43 15.07 5.07 0.17 803 1.38 8.55 2.89
5월 14일
(1차처리 30일 후)		 처리구 1 6.34 1.22 16.90 6.54 0.17 1888 2.01 9.68 4.18
처리구 2 6.80 0.32 20.70 6.79 0.19 1905 1.57 7.61 2.42
처리구 3 6.76 0.36 17.60 7.29 0.17 2105 1.62 7.82 2.62
6월 20일
(2차처리 30일 후)		 대조구 1 7.19 0.10 12.70 5.02 0.09 1241 0.72 7.58 2.13
대조구 2 7.07 0.14 13.30 5.49 0.15 1519 1.01 9.25 2.61
대조구 3 6.64 0.13 9.40 4.64 0.11 1423 1.03 6.76 2.04
6월 20일
(2차처리 30일 후)		 처리구 1 6.68 0.20 9.80 4.80 0.13 1448 0.59 7.43 2.10
처리구 2 6.94 0.17 11.60 4.86 0.15 1676 0.86 8.83 2.62
처리구 3 6.81 0.20 13.30 5.14 0.13 1883 1.20 7.53 2.46
8월 4일
(3차처리 40일 후)		 대조구 1 6.87 0.16 12.30 5.38 0.12 1517 1.22 8.67 2.41
대조구 2 6.91 0.17 11.40 6.90 0.13 1335 0.94 8.31 2.16
대조구 3 6.90 0.17 11.85 6.14 0.13 1426 1.07 8.50 2.27
8월 4일
(3차처리 40일 후)		 처리구 1 6.69 0.24 14.10 5.56 0.13 1323 1.01 6.84 2.30
처리구 2 6.96 0.15 15.00 5.89 0.15 1716 0.96 10.34 3.12
처리구 3 6.82 0.19 14.46 5.75 0.14 1521 1.00 8.60 2.72
또한, 도 5는 본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주를 포함하는 미생물제제의 처리구 및 무처리한 대조구에 의해 재배된 꽈리고추의 생육상황 일례를 나타내는 사진이고, 도 6은 본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주를 포함하는 미생물제제의 무처리구(대조구)에 나타난 고추 풋마름병(청고)의 증상 일례를 나타내는 사진이다.
즉, 도 5에 나타난 바와 같이, 전 생육기간 중 처리구의 고추생육이 대조구에 비하여 우수한 생육을 보였고, 8월 4일 조사에서 대조구에 고추의 풋마름병(청고)이 발병되어 24 포기가 고사하였으며, 9월 8일 조사에서 대조구에서 풋마름병(청고)으로 93 포기가 고사하였으나, 미생물제제의 처리구는 풋마름병(청고)의 발생이 없이 정상적인 생육이 이루어짐을 확인할 수 있었다[도 6].
한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스(Bacillus velezensis) BYA-3 균주의 Ralstonia solanacearum KACC 10695 균주에 대한 항균활성의 일례를 보여주는 사진이고,
도 2는 본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주의 부분 염기서열 일례를 나타내는 모식도이고,
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주의 16S rDNA 서열에 의한 분류학적 위치 일례를 나타내는 계통수 모식도이고,
도 4는 본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주의 16S rDNA 서열에 의한 Similarity 분석 결과 일례를 나타내는 모식도이고,
도 5는 본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주를 포함하는 미생물제제의 처리구 및 무처리한 대조구에 의해 재배된 꽈리고추의 생육상황 일례를 나타내는 사진이고,
도 6은 본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스 BYA-3 균주를 포함하는 미생물제제의 무처리구(대조구)에 나타난 고추 풋마름병(청고)의 증상 일례를 나타내는 사진이다.
<110> ByProm Company <120> Bacillus velezensis strain, growth medium for the same and microbial agent containing the same <130> 0001 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 858 <212> DNA <213> Bacillus velezensis <220> <221> gene <222> Complement((1)..(858)) <223> 16s rDNA <400> 1 tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60 acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120 atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180 ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240 ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300 ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360 gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420 gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540 tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600 aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660 tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720 gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780 agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840 gagtacggtc gcaagact 858

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. Ralstonia solanacearum 에 의하여 발병하는 고추 풋마름병 방제용 바실러스 벨레첸시스(Bacillus velezensis) KACC 91513P 균주를 포함하는 미생물 제제.
  7. 제6항에 있어서, 고추 풋마름병 방제용인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
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