KR101837695B1 - 식물 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성을 갖는 신규 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 y1 - Google Patents

식물 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성을 갖는 신규 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 y1 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amiloliquefaciens) Y1(KCTC 13071BP) 균주 및 상기 균주의 배양액 또는 상기 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 상기 균주는 과산화수소를 포함하는 배양배지 하의 비멸균 환경에서 배양할 수 있어 산업적 이용이 용이하다. 또한, 상기 균주 및 상기 균주의 배양액은 식물 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성뿐 아니라, 식물체의 생육 증진 효과를 갖는다.

Description

식물 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성을 갖는 신규 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1{Novel Bacillus amyloliquepaciens Y1 having Control Activity against Plant Pathogenic Fungi}
본 발명은 식물 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성을 갖는 신규 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주, 상기 균주의 비멸균 배양 방법 및 배양용 조성물에 관한 것이다.
친환경농산물 생산은 2001년도 이후 연평균 약 30% 정도 성장하여, 전체 농업 대비 10% 정도의 비중을 차지한다. 친환경농산물 시장 규모는 지속적으로 성장하여 2020년에는 7.5조원 규모에 이를 것으로 전망되고 있다. 또한, 전세계 유기시장 규모는 2000년 175억 달러에서 2010년 591억달러로 세 배 이상 증가하였다('12, FiBL-IFOAM).
전세계 생물적 방제 시장은 2010년 현재 1,560 M US$로 전체 작물보호제 시장의 약 5%를 점유하고 있다(Global Strategic Business Report-Biopesticides, 2011). 전체 생물적 방제 시장에서, 곤충 병원성 세균인 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis; Bt)가 가장 높은 시장 점유율(40%)을 가지고 있으며, 다음으로 곤충 병원성 곰팡이 및 바이러스가 뒤를 따르고 있다. 국내 유기농을 포함한 친환경 농산물 생산 농가수와 재배 면적은 증가하고 있고, 이와 비례하여 생물농약과 친환경유기농자재 중 작물병해충 방제 소재의 시장도 급속도록 증가하고 있다.
친환경 농산물 재배 시 병해충 방제용 자재로는 생물농약 보다는 친환경유기농자재를 대부분 사용하고 있다. 그 이유는 1) 생물농약 등록 시 비용이 친환경유기농자재에 비하여 매우 많이 필요하며, 2) 친환경유기농자재의 경우 정부 및 지자체에서 지원이 있기 때문이다. 2011년 친환경유기농자재의 시장은 약6천억 원으로서 단순 비율로 산정할 때 병해충관리분야의 친환경유기농자재의 시장은 약 2천억 원으로 추정된다. 그러나, 친환경농업의 가장 핵심 부분인 병해충 방제 방법에 사용될 소재와 제제가 미비하고, 효능이 검증되지 않은 자재가 난립하여 국가적인 문제로 대두되고 있다.
친환경농업의 병해충 방제에 있어서, 소단위 미생물 제품의 희석 살포에 따른 비료효능 및 병해 방제능이 미미하므로, 농민 자가 미생물배양 기술을 개발하여 보급할 필요가 있다. 국내 미생물제제 개발기술의 경우 미생물 발굴 및 약효검정 기술, 작용기작과 활성물질 규명 등은 선진국 수준에 도달하였으나 농민이 미생물을 현장에서 배양하여 사용할 수 있는 기술은 미비하여 이에 대한 기술개발이 필요하다.
현재 국내의 경우 여러 검증되지 않는 방법으로 농민 스스로 미생물을 배양하여 액비 등 미생물제를 만들어 사용하고 있다. 이는 병원균에 오염 및 효능을 입증 할 수 없으므로 비멸균상태에서 외부 잡균 및 병원균의 오염을 최소하며 효능 또한 검증된 미생물 배양법 개발이 필요한 실정이다.
현재 국내외 미생물제제의 개발에 있어서 농민이 직접 미생물제제를 배양할 수 있는 제품이 거의 전무한 상태이며, 미생물 배양액을 적절한 비율로 희석을 하여도 방제효과가 유지될 수 있는 배합기술이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 고추 역병 및 고추 탄저의 생물학적 방제 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amiloliquefaciens) Y1(KCTC 13071BP) 균주를 동정하고, 이의 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성을 확인하여, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 병원성 곰팡이 방제용 조성물을 개발하였으며, 이를 배양하여 고추 역병 방제 조성물의 비멸균 배양법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1(KCTC 13071BP) 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 비료 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물의 비멸균 배양 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 식물 병원성 곰팡이 방제 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 배양용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 식물 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amiloliquefaciens) Y1(KCTC 13071BP) 균주를 제공한다.
본 발명자들은 고추 역병 및 고추 탄저병의 생물학적 방제 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amiloliquefaciens) Y1(KCTC 13071BP) 균주를 동정하고, 이의 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성을 확인하여, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 병원성 곰팡이 방제용 조성물을 개발하였으며, 이를 배양하여 병해충 방제 조성물의 비멸균 배양법을 확립하였다.
본 발명의 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1는 식물 병원성 곰팡이에 대하여 방제활성을 갖는다.
본 발명의 명세서에서 용어 “식물 병원성 곰팡이”는 식물에 침입하여 식물의 잎, 줄기, 뿌리 또는 과실을 손실 및 손상을 일으키는 병원성 곰팡이를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 병원성 곰팡이는 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani), 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 보트리티스 시네리(Botrytis cinerea), 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici) 또는 푸사림 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)이다.
상기 라이족토니아 소라니는 무의 잎마름병(Rhizoctonia root rot); 옥수수, 생강의 잎집무늬마름병(sheath blight); 참외, 수박, 꽃양배추, 파, 양파, 갓, 아욱, 쑥갓의 잘록병(damping-off); 고추냉이, 당근의 관부썩음병(crown rot); 상추의 밑둥썩음병(bottom rot); 및 우엉의 뿌리썩음병(root rot)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스는 고추, 감귤, 딸기의 탄저병(anthracnose, white tip)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 보트리티스 시네리는 고추, 파, 양파, 토마토, 사과, 호박, 수박, 가지, 아스파라거스, 상추, 배, 오이, 감귤, 콩, 딸기의 잿빛곰팡이병(gray mold)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 파이토프소라 캡사이시는 고추, 참외, 호박, 오이, 수박의 역병(phytophthora rot); 토마토의 뿌리역병(phytophthora root rot)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 푸사림 옥시스포럼은 수박, 오이, 참외, 호박, 고구마의 덩굴쪼김병(fusarium wilt); 토마토, 가지, 꽃양배추, 파, 양파, 상추, 무, 시금치, 딸기, 부추의 시들음병(fusarium wilt); 논벼, 보리의 붉은곰팡이병(scab, ear blight); 마늘, 당근, 생강의 마른썩음병(dry rot); 논벼의 키다리병(bakanae disease); 시금치의 잘록병(damping-off, foot rot); 아스파라거스의 줄기썩음병(stem rot); 생강의 근경썩음병(rhizome rot); 고구마의 밑썩음병(fusarium rot)을 유발하는 것으로 알려져 있다[국가농작물병해충관리시스템(http://ncpms.rda.go.kr).
본 발명의 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1은 대두박(콩기름 짜고 남은 찌꺼기, soybean oil meal) 유래 균주로 고온 내성을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1은 40℃ 내지 60℃에서 고온 내성을 갖는다.
본 발명의 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1은 사이더포어 생산하고, 불용성인 인을 가용화할 수 있는 효소를 생산한다.
상기 사이더포어는 높은 결합력을 갖는 철 킬레이트 화합물로, 병원성 박테리아(균류 포함)의 생존에 필요한 철을 흡수하여 병원성 박테리아의 생장을 억제한다.
상기 인 가용화 활성은 토양 내 인의 가용성을 증진시켜 작물의 흡수를 용이하게 한다.
또한, 상기 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1은 키티나아제(chitinase), β-1,3-글루카나아제(β-1,3-glucanase), 프로테아제(protease) 및 카제인(casein) 분해효소를 생산한다.
상기 키티나아제 및 β-1,3-글루카나아제는 배양 배지 내 포함된 다당류(예컨대, 키틴, 설탕 등)를 올리고당으로 분해하고, 이러한 배양 배지를 식물 재배 시 비료와 혼합하여 이용하면 식물의 생육을 증진시킬 수 있다.
상기 프로테아제 및 카제인 분해효소는 단백질(예컨대, 젤라틴 등)을 아미노산으로 분해하고, 이러한 배양 배지를 식물 재배 시 비료와 혼합하여 시비하면 식물의 생육을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1(KCTC13071BP) 균주, 상기 균주의 배양액 또는 상기 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물을 제공한다.
상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주, 상기 균주의 배양액 또는 상기 배양액의 추출물은 라이족토니아 소라니, 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스, 보트리티스 시네리, 파이토프소라 캡사이시 및 푸사림 옥시스포럼에 대하여 항균활성을 갖는다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주 뿐만 아니라 이의 배양액 및 상기 배양액의 추출물에서도 항균활성을 나타내었다. 특히, 역병 원인 곰팡이인 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스 및 파이토프소라 캡사이시에 대해서 높은 항균 활성을 나타내었다.
본 발명의 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물에 이용되는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주의 배양액은 추출물 형태로 이용될 수 있다. 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주의 배양액에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는,본 발명의 추출물은 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 또는 이의 조합을 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주의 배양액에 처리하여 수득한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주의 배양액의 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.
본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 방제 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주, 상기 균주의 배양액 또는 상기 배양액을 추출물을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물이 식물방제용 농약 조성물로 제조되는 경우, 적당한 고체 담체, 액체 담체, 가스상 담체, 계면활성제, 분산제 및/또는 기타 제제용 보조제와 혼합하여, 유화제, 액제, 수화제, 분말제, 입자, 오일 용액, 에어로졸 또는 플로어블제(flowables) 등의 임의의 적합한 제형을 제조할 수 있다.
여기에 사용되는 고체 담체에는 탈크, 벤토나이트, 클레이, 카올린, 규조토, 질석, 화이트 카본 및 탄산칼슘 등이 포함된다. 액체 담체에는 메탄올, n-헥산올 및 에탄올 글리콜 등의 알코올류; 아세톤, 메틸 에틸 케톤 및 시클로헥사논 등의 케톤류; n-헥산, 케로신 및 등유 등의 지방족 탄화수소류; 톨루엔, 크실렌 및 메틸나프탈렌 등의 방향족 탄화수소류; 디에틸에테르, 디옥산 및 테트라히드로퓨란 등의 에테르류; 에틸아세테이트 등의 에스테르류; 아세토니트릴 및 이소부틸니트릴 등의 니트릴류; 디메틸포름아미드 및 디메틸아세트아미드 등의 산 아미드류; 두유 및 면실유 등의 식물유류디메틸술폭사이드; 및 물이 포함된다. 가스상 담체에는, LPG, 공기, 질소, 이산화탄소 및 디메틸에테르가 포함된다.
본 발명의 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물은 일반적으로 그대로 또는 희석 후에 사용된다.
본 발명의 병원성 곰팡이 방제용 조성물의 사용 방법으로는 식물 자체에 적용(줄기 및 잎에 적용), 토양으로의 적용(토양과 혼화 또는 덧거름), 현장용수로의 적용 및 종자로의 적용을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1(KCTC 13071BP) 균주, 상기 균주의 배양액 또는 상기 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 비료 조성물을 제공한다.
상기 기재한 바와 같이, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1은 사이더포어 생산하고, 불용성인 인을 가용화할 수 있는 효소를 생산하므로, 병원성 박테리아(균류 포함)의 생존에 필요한 철을 흡수하여 병원성 박테리아의 생장을 억제하고, 토양 내 인의 가용성을 증진시켜 작물의 흡수를 용이하게 한다.
또한, 상기 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1은 키티나아제(chitinase), β-1,3-글루카나아제(β-1,3-glucanase), 프로테아제(protease) 및 카제인(casein) 분해효소를 생산하므로, 배양 배지 내 포함된 다당류(예컨대, 키틴, 설타 등) 및 단백질을 각각 올리고당 및 아미노산으로 분해하고, 이러한 배양 배지를 식물 재배 시 비료와 혼합하여 시비하면 식물의 생육을 증진시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어, “시비”는 시비는 토양이나 작물에 비료성분을 공급하여 농작물의 생육을 촉진시키는 농작법을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시비는 엽면시비, 표층시비, 전층시비, 심층시비, 측조시비 또는 주입시비이다. 본 발명의 다른 구현예 따르면, 상기 시비는 엽면시비, 표층시비 또는 전층시비이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물의 비멸균 배양 방법을 제공한다.:
(a) 질소원, 인원, 칼슘원, 탄소원, 물 및 과산화수소를 포함하는 배양배지를 제조하는 단계;
(b) 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amiloliquefaciens) Y1(KCTC 13071BP) 균주를 접종하고 30℃ 내지 70℃에서 항온 배양하는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 결과물을 수득하는 단계.
본 발명은 기질 및 생육 특이성을 활용하여 미생물을 농가현장에서 직접 배양하여 얻은 배양액을 작물재배 관리용 자재로 활용하기 위한 기술로서 미생물 균체를 제품 병에 담아 작물에 희석하여 살포하는 지금까지의 연구와 현저한 차별성이 있다. 미생물의 기질 및 생육 특이성을 이용한 농민 자가 배양 기술로써 자가 배양시 오염을 최소화 할 수 있는 기술이다.
상기 방법을 단계별로 설명한다.
단계 (a): 배양배지의 제조
먼저, 질소원, 인원, 칼륨원, 탄소원, 물 및 과산화수소를 포함하는 배양배지를 제조한다.
본 발명의 비멸균 배양법의 주요한 특징 중 하나는 균주를 배양하기 위한 배양배지의 주요 성분으로 과산화수소를 포함하는 것이다. 상기 과산화수소는 비멸균 환경에서 타겟 균주 외 다른 균주가 생장 및 오염을 억제하는 역할을 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 배양배지는 0.1 내지 5.0 몰농도, 0.1 내지 4.5 몰농도, 0.1 내지 4.0 몰농도, 0.1 내지 3.5 몰농도, 0.1 내지 3.0 몰농도, 0.1 내지 2.5 몰농도, 0.1 내지 2.0 몰농도, 0.5 내지 2.0 몰농도 및 0.5 내지 2.0 몰농도 과산화수소를 포함한다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 배양배지는 1.2 몰농도 과산화수소를 포함한다.
상기 질소원은 펩톤, 소이톤, 카사미노산, 트립톤, 효모 추출물 및 맥아 추출물을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기 질소원, NH4Cl, (COONH4)2, NH4H2PO4, (NH4)2HPO4, NH4NO3, NaNO3 및 (NH4)2SO4로을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 무기 질소원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 인원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산이수소나트륨 및 인산수소이나트륨을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 칼륨원은 질산 칼륨(KNO2), 염화 칼륨(KCl), 황화 칼륨(K2S), 황산 칼륨(K2SO4) 및 탄산칼륨(K2CO3)을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 칼륨원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 탄소원은 수크로스, 프록토스, 갈락토오스, 솔루블 스타크, 이노시톨, 글리세롤, 자일로스, 덱스트로스, 락토오스, 덱스트린, 아도니톨, 만니톨, 만노스, 말토오스, 라피노스 및 에탄올로 이루어지는 군 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 질소원, 인원, 칼륨원, 탄소원 및 미량요소를 배양배지에 첨가하기 위해, 식물의 재배에 이용되는 비료[예컨대, 몽밴드(monband)]를 이용할 수 있다.
상기 배양배지는 미량요소를 첨가하기 위하여, BaCl₂, CaCl₂, Li2SO₄, MnSO, MgSO₄, ZnSO₄, FeSO₄, Na2MoO₄, KH2PO₄및 FeCl₃을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 주요한 특징 중 다른 하나는 상기 배양배지는 수돗물을 이용하여 제조한다.
당업계의 일반적인 기술상식에 따르면, 미생물의 배양배지를 제조하는데 이용되는 물은 멸균된 상태이나, 본 발명은 멸균되지 않은 수돗물을 이용하여 제조하는 특징을 갖는다.
단계 (b): 균주 접종
다음, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1(KCTC 13071BP) 균주를 접종하고 30℃ 내지 70℃에서 항온 배양한다.
본 발명의 주요한 특징 중 또다른 하나는 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 고온 배양이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 배양은 30℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 30℃ 내지 55℃, 30℃ 내지 50℃, 30℃ 내지 45℃ 또는 35℃ 내지 45℃에서 항온배양 한다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1을 고온 배양하여 비멸균 환경에서의 배지 오염을 방지할 수 있다.
상기 항온 배양은 1일 내지 20일 동안 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항온 배양은 1일 내지 18일, 1일 내지 16일, 1일 내지 14일, 1일 내지 12일, 1일 내지 10일, 3일 내지 10일 또는 5일 내지 10일 동안 실시한다.
상기 접종은 배양배지에 대하여 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 0.01 내지 1.0 부피%를 접종한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 접종은 0.01 내지 0.8 부피%, 0.01 내지 0.6 부피%, 0.01 내지 0.4 부피%, 0.01 내지 0.2 부피% 또는 0.05 내지 0.2 부피%를 접종한다.
단계 (c): 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물의 수득
다음, 단계 (b)의 결과물을 수득한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물은 상기 제조방법에 의해 제조되기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물을 미생물 농약으로 이용하는 경우, 종래의 합성농약으로 인한 토양 및 수질오염문제를 일으키지 않고, 식물의 자발적인 병충해 저항성을 유도하여 건강한 작물을 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물을 식물체에 살포하는 단계를 포함하는 식물 병원성 곰팡이 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 식물 병원성 곰팡이 방제 방법은 당업계에 공지된 농약 조성물의 희석용수를 이용하여 방제 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양의 조성물을 희석하여 식물체에 살포할 수 있다. 또한, 조성물의 살포에 있어서, 당업계에 공지된 분무법, 미스트법, 연무법, 훈증법, 관주법, 토양처리법, 침지법, 분의법, 도포법 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 질소원, 인원, 칼슘원, 탄소원, 물 및 과산화수소를 포함하는 비멸균 배양을 위한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 배양용 조성물은 상기 제조방법의 단계 (a)에 의해 제조된 배양배지와 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 배양용 조성물은 1제 및 2제의 pH 차이로 인한 과산화수소 첨가로 끓어오름을 방지하기 위해 수돗물, 인산원, 칼륨원 및 과산화수소를 포함하는 1제 및 질소원, 인원, 칼륨원, 미량원소원, 탄소원 및 과산화수소를 포함하는 2제를 각각 제조하고 이를 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 식물 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amiloliquefaciens) Y1(KCTC 13071BP) 균주 및 상기 균주의 배양액 또는 상기 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 곰팡이 방제용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 식물 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1(KCTC 13071BP) 균주는 과산화수소를 포함하는 배양배지 하의 비멸균 환경에서 배양할 수 있어 산업적 이용이 용이하다.
(c) 또한, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1(KCTC 13071BP) 균주 및 상기 균주의 배양액은 식물 병원성 곰팡이에 대한 방제 활성뿐 아니라, 식물체의 생육 증진 효과를 갖는다.
도 1은 대두박(soybean oil meal)에서 분리한 미생물 중 열처리(60℃에서 1시간) 후 생존 미생물을 도말한 결과를 보여준다.
도 2는 고추 역병 유발 병원성 곰팡이인 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스에 대한 항균 활성을 갖는 선별된 균주를 나타낸다. (가)는 Y1과의 대치배양을 나타내고 (나)는 60도 1시간처리 후의 무명의 생존 미생물 중의 하나와의 대치배양을 나타낸다.
도 3은 선별된 균의 16S rRNA 염기서열을 바탕으로 계통분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 CAS 블루 배지에서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 사이더포어(siderpore) 생산 여부를 확인한 결과를 나타낸다. (가)는 패니바실러스 엘기(양성대조군)이고, (나)는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1을 접종한 결과이다.
도 5는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 인 가용화 활성을 확인한 결과를 나타낸다. (가)는 패니바실러스 엘기; (나)는 슈도모나스 플루오르스센스 HN1205(Pseudomonas fluorescens HN1205); 및 (다)는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1을 접종한 결과를 나타낸다.
도 6은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 HCN(Hydrogen cyanide) 생산을 확인한 결과를 나타낸다. (가)는 대조군; (나)는 패니바실러스 엘기; (다)는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1; 및 (라)는 슈도모나스 플루오르스센스 HN1205(Pseudomonas fluorescens HN1205)를 접종한 결과를 나타낸다.
도 7은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1을 MFMM에 접종하여 배양한 성장 곡선을 나타낸다.
도 8은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1을 MFMM에 접종하여 배양시간에 따른 사이더포어 생산량을 나타낸다.
도 9는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1을 병원성 곰팡이와 대치배양하여 항균활성을 확인한 결과를 나타낸다. a는 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani); b는 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides); c는 보트리티스 시네리(Botrytis cinerea); d는 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici); e는 푸사림 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)와의 대치배양을 나타낸다.
도 10은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 배양 상등액의 항균활성을 측정하기 위한 모식도를 나타낸다.
도 11은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 10일 동안 배양한 상등액의 5종 병원성 곰팡이에 대한 농도별 항균활성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 12는 도 11의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 13은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 15일 동안 배양한 상등액의 5종 병원성 곰팡이에 대한 농도별 항균활성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 14는 도 13의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 15는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 배양 상등액을 4종 유기용매(헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 부탄올)로 조항균물질을 추출하여 3종 병원성 곰팡이에 대한 항균 활성을 분석하기 위한 모식도를 나타낸다.
도 16은 4종 유기용매를 이용한 조항균물질의 라이족토니아 소라니에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 17은 도 16의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 18은 2종 유기용매(클로로포름 및 에틸 아세테이트)를 이용한 조항균물질의 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 19는 도 18의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 20은 2종 유기용매(클로로포름 및 에틸 아세테이트)를 이용한 조항균물질의 파이토프소라 캡사이시에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 21은 도 20의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 22는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 8일 동안 배양한 상등액의 5종 병원성 곰팡이에 대한 농도별 항균활성을 나타낸다.
도 23은 도 22의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 24는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 8일 동안 배양한 상등액의 조항균물질(부탄올 추출물)에 대한 5종 병원성 곰팡이에 대한 항균활성을 나타낸다.
도 25는 도 24의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 26은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지에서의 생장 곡선(OD 600 ㎚)을 나타낸다.
도 27은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지에서의 생장 곡선(Colony Forming Units; CFU)을 나타낸다.
도 28은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지 배양의 pH를 나타낸다.
도 29는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지 배양의 전기전도도(Electric Conductivity; EC)를 나타낸다.
도 30은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지 배양의 생물계면활성제 값을 나타낸다.
도 31은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지 배양의 키티나아제 활성 을 나타낸다.
도 32는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지 배양의 β-1,3-글루카나아제 활성을 나타낸다.
도 33은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지 배양의 프로테아제 활성을 나타낸다.
도 34는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 카세인 분해 활성을 나타낸다.
도 35는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지 배양의 암모니아태질소, 질산태질소 및 질소전량(%)을 나타낸다.
도 36은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지 배양의 가용성 인산 및 인산전량(%)을 나타낸다.
도 37은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지 배양의 고토전량, 석회전량 및 칼리전량(%)을 나타낸다.
도 38은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지 배양의 유기물 함량(%)을 나타낸다.
도 39는 블루 및 브라운 배지(BB 배지)를 나타낸다.
도 40은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지의 비멸균 조건 배양에서 온도별 생장 곡선(Colony Forming Units; CFU)을 나타낸다.
도 41은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 비멸균배지에서 온도별 콜로니 정도를 나타낸다.
도 42는 도 41의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 43은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 BB 배지로 비멸균조건(오토클레이브 하지 않은 BB 배지 및 수돗물 사용)에서 배양한 결과를 나타낸다.
도 44는 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 지(상, 하)부 생체중량 및 건초중량을 나타낸다. W는 물; F는 배지; C는 배양액(BB 배지에서 배양된 Y1 균주); F1/2는 배지 25 ㎖; F1/1은 배지 50 ㎖; C1/2는 배양액 25 ㎖물 25㎖; C2/3은 배양액 33 ㎖ 물 17㎖; C1/1은 배양액 50 ㎖.
도 45는 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 클로로필(chlorophyll) 값을 나타낸다.
도 46은 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 생초장(plant height)을 나타낸다.
도 47은 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 지상하부 생초장, 생체중량, 건초중량 및 클로로필 값을 나타낸다.
도 48은 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 지상하부 생체중량, 건초중량 평균 값을 나타낸다.
도 49는 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 클로로필 평균 값을 나타낸다.
도 50은 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 생초장 및 개화수를 나타낸다.
도 51은 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 개화수를 나타낸다.
도 52는 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 토양 시료의 미생물을 콜로이드 키틴이 포함된 아가 배지에서 배양한 후 계수한 결과를 나타낸다.
도 53은 도 52의 결과를 이미지로 나타낸다.
도 54는 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 토양의 미생물을 열처리하고 콜로이드 키틴이 포함된 아가 배지에서 배양한 후 계수한 결과를 나타낸다.
도 55는 도 54의 결과를 이미지로 나타낸다.
도 56은 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 토양의 미생물을 키티나아제 활성을 나타낸다.
도 57은 배지 또는 배양액을 시비하여 재배한 고추식물체의 토양의 미생물을 디하이드로제나아제 활성을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 고온 기능성 미생물 특성 연구
1-1. 선발된 고온 기능성 미생물 분리 및 동정.
1) 고온ㆍ기능성 미생물 분리 및 동정
대두박(soybean oil meal)에서 분리한 미생물은 60℃에서 1시간 동안 열처리 후 생존한 미생물(도 1) 중 고추 역병을 발생시키는 병원성곰팡이(Colletotrichum gloeosporioides 및 Phytophthora capsici)에 대해 항균활성이 있는 균을 최종 선택하였다(도 2).
선택한 균은 16S rRNA의 염기서열(서열목록 제1서열)을 바탕으로 한 미생물의 동정 결과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 99% 이상 일치 하여 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1(NCBI 접근 번호: KP967704)로 명명하였다(도 3).
1-2. 분리된 미생물의 2차대사산물 생산 활성 조사
1) 플레이트 실험
a) 사이더포어(Siderophore) 생산
간접적으로 사이더포어 생산을 알아보기 위해서 고체배양실험의 경우, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주의 배양액 100 ㎕를 TSB 배지에 접종하여 3일 동안 40℃에서 배양하고, 배양된 Y1을 TSA 배지에 도말하였다. 도말 후 TSA 배지에서 단일콜로니를 컷팅(cutting)하여 CAS(Chrome azurol S) 블루배지(CAS 솔루션(50 ml 기준)을 Chrome azurol S 60.5 mg, iron(Ⅲ)solution-(1mM FeCl36H2O(2.7 mg) in 10 mM HCl(9.83 μ10 ml 및 HDTMA(hexadecyltrimethylammonium bromide) 72.9 mg을 혼합하여 멸균하여 제조하고, 간접적으로 확인이 되어 사이더포어의 정량적으로 알아보기 위해 액체배양실험의 경우, 기본 배지(900 ml기준)는 KH2PO4 0.3 g, NaCl 0.5 g, NH4Cl 1.0 g, PIPES(piperazine-N,N'-bis[2-ethanesulfonic acid]) 3.024 g, 글루코오스 2.0 g, 아가 20 g, TSB 3 g 가량을 혼합하고, pH 7로 맞춰 멸균하여 제조한다. 상기 CAS 솔루션과 기본 배지를 혼합한 배지에 각각 Y1균을 접종하였다. CAS 아가 배지(CAS 블루배지 및 기본 배지의 혼합 배지)에 30℃ 하에 4일 동안 배양한 후 Y1 균주 주위에 주황색으로 변색하는 것을 관찰하였다(도 4). 사이더포어 생산 측정 결과 대조구 패니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)의 경우 균주 주위의 주황색 존의 반경이 좁은 것으로 보아 사이더포어 생산량이 적다는 것을 확인하였다. 따라서, 실험구 Y1의 주황색 존의 크기가 대조구인 패니바실러스 엘기 균주보다 상대적으로 넓은 것으로 보아 사이더포어 생산량이 많은 것을 확인하였다. 또한 미생물 생균수가 가장 높은 2일차에 사이더포어 생산 또한 가장 높았다.
b) 인 가용화 생산 측정
바실러스 아밀로뷔파시엔스 Y1 균주를 TSB 배지에 100 ㎕ 접종하여 3일 동안 40℃에서 배양하였다.
배양된 Y1 균주를 인 가용성(phosphorus solubilization) 활성고체배지[1 L 기준, 글루코오스 10 g, MgSO42O 0.4 g, NaCl 1 g, CaCl22O 0.2 g, NH4NO3 1.5 g, KCl 0.2 g, 효모 추출물 0.5 g, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite; HY1~Ca10(OH)2(PO4)6 ) 4 g 및 아가 20 g; pH 7]에 스트리킹(streaking)하고 30℃에서 4일 동안 배양한 후, 인 가용성 활성고체배지의 Y1 주위에 클린존(clean zone)이 생성되는지 관찰하였다(도 5). 인 가용화 생산 측정 결과 대조구 패니바실러스 엘기와 슈도모나스 플루오르스센스 HN1205에서는 클린존 형성이 적어 인가용화 생산량이 적은 것을 확인하였다. 반대로, 실험구 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 경우 대조구보다 클린존 형성이 넓어 인 가용화 생산이 상대적으로 많은 것을 확인할 수 있었다.
c) HCN 생산 측정
플레이트에 TSA 배지를 깔고 응고되면 TSA 반원을 잘라내고, 3일 동안 40℃에서 배양된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주를 도말하였다. 그 후, 알칼리성 피크르산염(alkaline picrate) 용액(100 ㎖ 기준, 탄산나트륨 2.5 g 및 피크르산 0.5 g)을 적신 여과지를 TSA 배지 반대편 플레이트 천장에 붙이고 파라필름(parafilm)으로 밀봉하여 30℃에서 4일 동안 여과지의 색 변화(노랑->주황, 갈색)를 관찰하였다. 대조구인 CON, 패니바실러스 엘기 및 슈도모나스 플루오르스센스 HN1205, 실험구인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 중 CON, 패니바실러스 엘기 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1균주에서는 여과지의 색변화가 없었으므로 HCN 생산을 하지 않는 것을 확인 할 수 있었다. 대조구인 슈도모나스 플루오르스센스 HN1205는 여과지의 색이 갈색으로 변색하여 실험구 Y1의 HCN생산을 비교 확인하였다(도 6).
2) 배양액 실험
a) 사이더포어 측정
MFMM(Modified Fiss Minimal Medium) 1 L에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주 도말된 TSA 배지에서 단일콜로니 10 CFU(colony forming units) 접종하여 15일 동안 배양하고 배양액을 샘플링하여 기준일마다 세포 성장(도 7)과 사이더포어값(도 8)을 측정하였다. 세포 성장은 2일에 가장 높았고, 3일부터 급격히 감소하고 15일까지 서서히 감소되었다.
사이더포어 유니트(units)는 MFMM 배양액과 CAS 분석 용액을 1:1 비율로 첨가하고, 20분 동안 반응시킨 후 630 ㎚에서 측정하였다. 1일차부터 급격히 증가하고 3일 차부터 감소하여 일정하게 유지되었다.
1-3. 병해 방제 효과 조사
1) 고온성 미생물(B. amyloliquefaciens Y1) 항균활성 측정(BB 배지)
a) 병원성곰팡이 대치배양
PC(감자 덱스트로오즈 브로스+ 콜로이드 키틴+아가) 배지(표 1)에 5가지 병원성곰팡이 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani), 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 보트리티스 시네리(Botrytis cinerea), 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici), 푸사림 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)와 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주를 대치배양하여 억제율(표 2)을 조사하였다(도 9).
고온성미생물 Y1 균주가 5가지 병원성 곰팡이에 대해 항균활성을 가진다는 것을 확인하였고, 특히 고추 곰팡이병인 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스 및 파이토프소라 캡사이시에도 강한 항균활성을 나타내었다.
PC(Potato Dextrose broth +colloidal chitin +agar) 1 L 기준 조성표.
PDA 콜로이드 키틴 배지
PDB 12 g 콜로이드 키틴 100 ㎖
아가 10 g 효모 추출물 0.5 g
증류수 500 ㎖ 증류수 400 ㎖
- 아가 10 g
병원체 억제 길이
(cm)		 항균 활성
라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani) KACC 40111 1.6 ++
콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides) 1.5 ++
보트리티스 시네리(Botrytis cinerea) KACC 40854 2.2 +++
파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici) KACC 40483 1.1 ++
푸사림 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) KACC 40032 0.9 +
b) 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 배양액 농도별 항균활성 검정
BB 배지(물 100 ㎖에 표 3의 블루배지 1 ㎖ 및 브라운 배지 0.4 ㎖이 첨가된 배지)에 10, 15일 동안 40℃에서 배양한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 배양 상등액을 0, 0.2, 1, 10, 30 및 50% 농도별로 PDA 배지와 혼합한 후 5가지 병원성 곰팡이(라이족토니아 소라니, 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스, 보트리티스 시네리, 파이토프소라 캡사이시 및 푸사림 옥시스포럼)를 혼합된 배지 중앙에 접종(도 10)하여 고온성미생물 Y1의 1 및 2차 대사산물이 병원성 곰팡이에 대한 항균활성정도를 비교 확인해 보았다.
브라운 배지 블루 배지
수돗물 1 ㎖ 몽밴드
(20-20-20-2)		 4 g
KH2PO4 (0-52-34) 0.08 g 황산칼륨(K2SO4) 0.1 g
KCl(0-0-60) 0.02 g 염화칼슘(CaCl2) 0.1 g
키틴분말 0.5 g 설탕 4 g
젤라틴 0.025 g 효모 0.1 g
파워키틴 2.66 ㎖ H2O2 30% 0.246 ㎖
H2O2 30% 0.246 ㎖ - -
배양액 농도별 항균활성 실험 결과 본 연구팀에서는 10일 동안 배양한 상등액 농도별 항균활성(도 11 및 12)은 15일 동안 배양한 상등액 농도별 항균활성(도 13 및 14)에 비해 항균활성 능력이 낮았으며, 특히 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스 균주와 파이토프소라 캡사이시 균주에 항균활성 효과가 현저히 떨어졌다. 또 이 결과로 인해 미생물 배양액의 농도가 희석 되었을 때에 항균활성 능력이 현저히 떨어지는 것을 확인 할 수 있었고, 실제 필드(실험포장)에서 많은 작물들에 항균능력이 있는 적정농도의 미생물배양액을 관주, 엽면시비를 하기 위해선 미생물배양액의 양이 많아야 된다고 사료된다.
c) 균질 병원균에 대한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 조항균물질
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 배양 상등액에 4가지 유기용매(헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올) 및 탈이온수를 이용하여 조항균 활성 물질을 추출하고(도 15), 이 후 유기용매 추출물을 농축하여 3가지 병원성 곰팡이(라이족토니아 소라니, 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스 및 파이토프소라 캡사이시)에 대하여 항균활성(%)을 확인하였다.
(1) 라이족토니아 소라니
4가지 유기용매(헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올)와 물을 이용하여 추출한 조추출물 4 ㎎을 페이퍼디스크(paper disk)에 분주하고, 라이족토니아 소라니 곰팡이 균주를 페이퍼 디스크 가운데 접종하고 결과를 확인하였다(도 16 및 17).
(2) 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스
2가지 유기용매(클로로포름, 에틸 아세테이트)를 이용하여 추출한 조추출물 0, 1, 2 및 4 ㎎을 페이퍼 디스크의 양쪽 접종하고, 병원성 곰팡이 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스 균주를 가운데 접종 한 뒤 항균활성 결과를 확인하였다(도 18 및 19).
(3) 파이토프소라 캡사이시
2가지 유기용매(클로로포름, 에틸 아세테이트)를 이용하여 추출한 조추출물 0, 1, 2 및 4 ㎎을 페이퍼 디스크의 양쪽 접종하고, 병원성 곰팡이 파이토프소라 캡사이시 균주를 접종 한 뒤 항균활성 결과를 확인하였다(도 20 및 21).
병원성곰팡이 조항균 활성물질의 용매 조활성물질 용량
헥산 클로로포름 에틸아세테이트 부타올 아쿠아
라이족토니아 소라니 27.9 92.4 61.4 29.5 2.9 4 ㎎
콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스 - 19.0 30.4 - - 1 ㎎
- 19.2 40 - - 2 ㎎
- 45.2 46.2 - - 4 ㎎
파이토프소라 캡사이시 - 30.3 24.2 - - 1 ㎎
- 42.4 39.4 - - 2 ㎎
- 47.2 55.6 - - 4 ㎎
라이족토니아 솔라니에서 실험결과 클로로포름과 에틸아세테이트에서 높은 항균활성이 나타났고, 가장 높은 항균활성을 가진 클로로포름과 에틸아세이트층을 이용하여 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스와 파이토소라 캡사이시에 처리하였다. 그 결과 두 균주 모두 에틸아세이트 층에서 강한 항균활성이 나타났다.
2) 고온성미생물(B. amyloliquefaciens Y1) 항균활성 측정(LB 배지)
a) 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 배양액 농도별 항균활성 검정
LB 배지에 8일 동안 40℃에서 배양한 Y1 배양 상등액을 0, 10, 30 및 50% 농도별로 PDA 배지와 혼합한 후 5가지 병원성 곰팡이(라이족토니아 소라니, 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스, 보트리티스 시네리, 파이토프소라 캡사이시 및 푸사림 옥시스포럼)를 중앙에 접종하고 고온성미생물 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1의 1, 2차 대사산물이 병원성 곰팡이에 대한 항균활성정도를 비교 확인하였다(도 22 및 도 23). LB 및 TSB의 고급배지를 사용한 배양액이 본 연구실에서 개발한 BB 배지보다 배양 기간이 짧고 항균활성이 더 강한 것으로 보였으나 배지의 가격이 약 90배 정도 더 비싸 효과대비 경제적 측면으로 보았을 때 BB 배지가 더 실용적이라고 사료된다.
b) 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 조항균물질
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 배양 상등액에 유기용매(부탄올)를 이용하여 조항균물질을 추출하고, 이 후 유기용매 추출물을 농축하여 5가지 병원성 곰팡이(라이족토니아 소라니, 콜레토트리춤 글로에오스포리오이데스, 보트리티스 시네리, 파이토프소라 캡사이시 및 푸사림 옥시스포럼)에 대하여 항균활성을 확인하였다(도 24 내지 25).
1-4. 배양액 양분 변화 조사
본 연구팀이 대두박으로부터 분리한 미생물(바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1)의 여러 가지 양분변화 및 효소생성을 조사하였다. 이 미생물은 특정 기질을 사용한 한천배지에 접종 했을 때 키티나아제(chitinase), β-1,3-글루카나아제(β-1,3-glucanase) 및 프로테아제(protease)를 생산하였고, 그 외 카제인(casein) 분해효소 등을 생산하는 것을 확인하였다.
또 (무기태, 유기태)질소, 유기물함량, 인산, 칼리, 마그네슘, 칼슘 의 변화를 측정하였다.
모든 Y1 배양액은 BB 배지 1 L에 지름 0.8 ㎝의 Y1 콜로니 10개를 접종하고, 140 RPM, 40℃, 13일 동안 배양하였다.
1) 세포 성장
세포 성장은 OD 600 nm와 CFU를 이용한 두 가지 실험방법으로 수행되었다.
a) OD 600 nm
Y1 배양액 세포 성장(OD 600 nm) 곡선 조사 결과 1-2일 사이에 가장 급격히 증가하였고 6일째부터 변화폭이 유지되었다(도 26).
b) CFU
Y1 배양액 세포 성장(CFU) 곡선 조사 결과 3일째에 가장 높았고 급격히 증가하다 4일째부터 서서히 감소하였다(도 27).
2) pH
Y1 배양액의 pH 측정값은 1일 째에 급격히 증가하고, pH 8.2에서 유지되었다(도 28).
3) EC
Y1 배양액의 EC 측정값은 2 내지 4.5 μ㎝ 사이에서 큰 변화 없이 유지되었다(도 29).
4) Biosurfactant(생물계면활성제)
Y1 배양액의 생물계면활성제 값은 1일 째 이후로 급격히 감소하다가 3-4일째 정체기를 갖고 또 한번 급격히 감소하다 생물계면활성제 값이 변화폭이 줄어들며 일정하게 유지되었다(도 30).
5) 키티나아제 활성
Y1 배양액의 키티나아제 활성을 조사한 결과 효소활성은 3일째 까지 증가하다 4일째 이후부터 감소하고 7일째부터 활성이 유지되었다(도 31).
6) β-1,3-글루카나아제 활성
Y1 배양액의 β-1,3-글루카나아제 활성의 변화를 측정한 결과 1일째 매우 급격히 대폭 증가하다가 2일째 급격히 감소하고 이후로 서서히 감소하였다(도 32).
7) 프로테아제 활성
Y1 배양액의 프로테아제 활성의 변화 측정 결과 5일째에 최고의 활성을 나타내고 점진적으로 감소하다가 9-12일째 까지 한차례 더 증가하다 감소하였다(도 33).
8) 카세인 분해효소 활성
탈지우유, 플레이트 카운트 아가(Plate count agar; PCA), 트리클로로초산(trichloroacetic acid; TCA)을 첨가한 아가 배지에 3일 동안 배양한 Y1 배양물을 루프로 스트리킹하고 또 다른 방법으로 배양액을 50 ㎕ 접종하였고, 30℃ 배양기에서 10시간 배양하였다. 배지의 클론존 형성이 짧은 시간 내에 넓게 형성한 것으로 보아 카세인 분해효소를 많이 생성한다는 것을 간접적으로 확인하였다(도 34).
9) 무기태 질소, 유기물함량, 인산, 칼리, 마그네슘 및 칼슘 변화 측정
a) 무기태 질소
무기태 질소인 질산태질소 및 암모니아태질소를 측정하여 확인하였다. 암모니아태 질소는 2일까지 증가하다 유기되었고 질산태질소는 그와 반대로 2일까지 감소하다 유지되었다(도 35).
b) 인산전량 및 가용성인산
인산 전량 및 가용성인산을 측정함으로 인해 불용성인산도 확인하였고, 가용성인산이 4일차와 9일차에서 소폭 증가하였다(도 36).
c)고토, 석회, 칼리 전량.
고토, 석회 및 칼리 전량을 확인하였다(도 37).
d) 유기물 함량.
유기물 함량을 배양일 마다 확인하였다. 유기물은 2일 째 까지 급속히 감소하였고, 2일 째부터 일정하게 유지되었다. 유기물이 줄어들었다는 것을 확인하여 배양액 속의 유기물인 게껍질을 미생물이 분해하였다고 간접적으로 알 수 있다(도 38).
2. 소규모 비멸균조건 대량배양 연구
2-1. 기질 및 온도 특성을 이용한 미생물 특이적 배양
1) 기질 및 온도 특성을 이용한 미생물 특이적 배양
본 연구팀은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 균주가 키티나아제, β-1,3-글루카나아제 및 프로테아제 효소를 생산하는 것을 확인하고, 특이기질로 게껍질분말 및 젤라틴 분말을 사용하여 배지(도 39, 표 3)를 조성하였으며 Y1 균주를 분리할 때 60℃에서 생존한 고온성 미생물인 것을 확인하였고, 배양할 시 오염을 줄이고자 온도조건을 40-60℃로 조절하여 배양실험을 하였다.
a) 비멸균 배지 최적 온도 배양 조건 조사
블루 배지 1 ㎖ 및 브라운 배지 0.4 ㎖가 포함된 수돗물 100 ㎖에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 단일콜로니 1 CFU를 접종하고, 3일 동안 각 온도별로 항온배양기에서 배양 한 후 세포 성장을 확인한 결과이다.
40℃에서 1-2일에 점진적으로 증가하다가　3일 째 가장 높은 CFU가 측정되었으며, 50℃와 60℃에서는 1-3일 동안 점차적으로 CFU가 감소하였다(도 40). 그 결과 Y1의 기본배양조건을 40℃로 선택하였다.
b) 비멸균 배지에 특이적 기질 및 미생물을 접종한 후 오염 없는 최적 배양조건 조사
블루 배지 1 ㎖ 및 브라운 배지 0.4 ㎖가 포함 된 BB 배지 100 ㎖에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1 100 ㎕를 접종하고 1시간 동안 각 온도별로 열처리 후 3일 동안 40℃(30℃는 예외) 항온배양기에서 배양하였다. 세포 성장을 확인한 결과, 30℃에서 배양한 배양액에 CFU 수가 가장 높았으나 배양 과정 중 오염되는 경우가 있어 관리가 어려운 필드에서 배양 할 경우 항상 오염 될 것으로 간주되어진다. 오염이 일어나지 않으면서 CFU 수가 기준치에 적합한 40℃-60℃를 최적온도로 선정하였다. 1시간 열처리 하였을 때 배양기간이 길어질 경우 50℃ 및 60℃ 온도에서는 Y1 균주의 CFU 수가 줄어들었다. 따라서 최적온도는 40℃로 선정하였다(도 41 내지 42).
c) 비멸균 조건 배양(CFU 접종)
블루 배지 1 ㎖ 및 브라운 배지 0.4 ㎖가 포함 된 BB 배지 100 ㎖에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 단일콜로니 1 유니트를 접종하고, 3일 동안 40℃ 항온배양기에서 배양한 후 세포 성장을 확인한 결과이다(도 43). BB 배지 및 증류수 대신 수돗물을 사용하였으며 BB 배지 및 수돗물 모두 오토클레이브(autoclave)를 사용하지 않고 배양하였고 Y1 균주 외에 오염균은 없었다.
2-2. 미생물 배지 배양조건하에서 고추 육묘 상태에서 최적 생육 조건 확립
1) 고온성 미생물을 최적 배양조건에서 배양한 후에 배지 성분 또는 비료성분량을 조절하여 고추 육묘의 최적 생육조건을 확립
고추 식물의 성장에 Y1의 영향을 조사하기 위해, 온실 포트 실험을 전남 대학교에서 실시 하였다. 고추 씨앗(고추 아눔 L., Chungok)을 토양을 가득채워진 3 cm 플라스틱 셀 플러그 트레이에 파종 하였다. 고추 모종을 4주 간 키운 후 96 개의 포트로 옮겼다. 실험은 처리구에 따라 4반복으로 하였고 6개의 처리구로 실험하였다. 고추 모종의 샘플링은 조성물로 처리 된 10, 20, 30, 40, 50 DAT에서 앞서 정의되었다. 위치가 임의의 위치의 효과를 피하기 위해 매주 변경 화분 무작위로 분산시켰다. 40, 50, 60, 80 일 후, 식물과 토양 관측, 수확하였다. 총 엽록소는 SPAD 502 엽록소 측정기를 사용하여 측정하였다. 식물시료는 생체중와 건체중을 측정하였고 줄기와 뿌리로 분할하여 무게를 측정하였다. 건체중의 경우 줄기와 뿌리를 오븐 건조 질량을 계산하는 데 48 시간 동안 60 ℃에서 건조 하였다. 꽃은 80 DAT에서 처리 당 4반복으로 측정하였다. 각 DAT의 토양 시료는 생물학적, 생화학 적 분석을 위해 4℃에서 보관 하였다.
Y1의 식물생장촉진능력은 비료 배지와 다양한 농도의 미생물 접종을 사용한 생체 조건에서의 포트 실험을 통해 결정되었다. 고추 식물의 줄기 생체중은 모든 Y1 처리구에서 배양시간의 길이와 함께 증가 되었다. Y1을 처리한 식물은 W 보다 52%(C1/2) 와 68%(C1/1) 뿌리와 줄기의 생체중이 더 많았다. 그리고 80 DAT에서 F1/1과 비교했을 때 14%(C1/1) 와 18%(C2/3) 더 많았다(Table 2). 미생물 배양액의 적용이 바뀐 토양의 물리적인 그리고 화학적인 특성은 줄기의 생체중이 50, 60 와 80 DAT에서 크게 향상된 것 같이 식물생장에 긍정적인 효과를 가지는 것이 발견되었다. Table 3는 Y1 접종이 80 DAT에서 식물당 총 꽃의 수가 비료처리구와 대조구 보다 더 높았다는 것읕 통해 고추 식물 생장을 촉진시켰다는 것을 보인다. 처리구는 토양위에서와 지하에서 식물생장에 영향을 미친다. Table 2는 Y1이 줄기 무게 (생체중, 건체중), 뿌리 무게 (생체중, 건체중), 줄기 길이 그리고 잎의 엽록소 같이 넓은 식물생장촉진 효과를 가지는 것을 보였다. 또한 모든 미생물 처리구에서 더 높이 발견되었다(도 44 내지 46).
모든 미생물 처리구에서 결과값이 높았으며 특히 미생물 2/3 처리구가 가장 높은 결과값을 나타내었다.
3. 포트에서 미생물 처리를 통한 작물 특성 조사
3-1. 고추 식물체 생육 조사
1) 포트에 고추씨를 정식하여 40~80일 동안 지상부 생초장, 생체중량, 건초중량 및 지하부 생체 및 건초중량 측정
a) 물, 배지(1/2, 1/1), 미생물배양액(1/2, 2/3, 1/1)을 처리 한 고추식물체를 40, 50, 60, 80일에 각각 주를 샘플링 하여 지상하부 생초장, 생체중량, 건초중량 및 클로로필(Chlorophyll)을 측정하였다(도 47 내지 49 및 표 5).
배양일 처리 FSW(g) DSW(g) FRW (g) DRW (g) CC( μcm-2) Plant height (cm)
40 W 9.33 0.99 3.47 0.34 37.0 31.33
F1/2 19.33 1.70. 1.80 0.13 40.63 40
F1/1 20.6 3.21 1.47 0.14 40.43 43.6
C1/2 19.33 1.77 1.18 0.12 41.8 43
C2/3 18 1.55 1.58 0.14 41.2 42
C/1 17.33 1.62 1.03 0.11 40.96 39
50 W 15.33 1.8 2.99 0.34 37.7 44.67
F1/2 24 2.42 2.29 0.24 43.47 49.3
F1/1 27.5 2.57 1.87 0.19 42.2 50.33
C1/2 28 2.80 2.3 0.25 41.92 52.67
C2/3 28 2.77 2.10 0.21 40.22 56.67±2.62
C/1 26 2.48 1.52 0.16 41.7 53.33
60 W 18 1.2 2.37 0.41 36.27 35
F1/2 32.67 4.01 2.8 0.4 45.83 59.33
F1/1 30.6 3.34 2 0.19 46.17 55.33
C1/2 36 4.25 3.67 0.48 47.67 58.67
C2/3 38.6 4.33 1.65 0.23 47.03 60.67
C/1 36 4.05 2.06 0.27 46.07 61.33
80 W 15 1.87 4.75 0.34 37.85 56
F1/2 38.33 5.66 7.98 0.97 43.63 68.33
F1/1 46 6.76 6.7 0.90 46.16 69.33
C1/2 56.33 8.47 9.9 1.09 48.36 70.66
C2/3 59 8.36 8.9 0.96 49.66 73
C1/1 59.33 8.34 6.03 0.66 49.6 69.66
Y1 미생물 배양액은 7일 동안 40℃에서 배양 한 후 5차례(10, 20, 30, 40 및 50 day) 관주하였다.
그 결과, 미생물배양액 처리구가 배지 처리구보다 생초장, 생체중량, 건초중량 및 클로로필, 모든 부분에서 값이 높게 나왔다.
또 고추식물체 전체적인 작황을 고려하였을 때엔 미생물 배양액 1/2나 2/3 처리구가 가장 결과가 좋았으나 수확량(개화수)으로 보았을 때엔 1/1 처리구가 가장 좋았다.
b) 지상하부 생체중량, 건초중량 평균 값은 배양액 처리구 1/2, 2/3에서 가장 높았다.
c) 40, 50, 60, 80일 클로로필 평균 측정값은 배양액 처리구 1/2에서 가장 높았고 1/1, 2/3 순으로 값이 높았다.
3-2. 생산량 조사.
1) 고추식물체의 개화수 계수.
80일 동안 고추 식물체를 재배하고 식물체의 개화수를 측정하였다. 봉오리 1개당 생산량 1로 표기하였다. 개화수 결과 미생물 처리구 1/1에서 가장 많이 개화되었다(도 50 및 51).
3-3. 토양화학성 변화 측정.
1) 고추 정식 전, 후 pH, EC, OM, 총 질소 및 유효인산 측정.
고추식물체 토양을 정식 전과 80일 재배 후에 샘플링하여 측정하였다.
전기 전도도 (EC)를 1:5로(토양: 물) 측정 하였다. 수분 함량은 중량법으로, 수분 추정을 사용하여 측정 하였다(표 6).
샘플 pH (1:5) EC (dS/m) MC (%) CEC (Cmol+/Kg) OM (%) TN
( mg/kg)		 P
(mg/kg)		 K (Cmol+/kg) Ca (Cmol+/kg) Mg (Cmol+/kg)
BT 5.13 0.57 7.28 8.80 0.5 5 424 0.09 6.73 5.05
W 6.20 0.21 29 9.24 1.38 36.53 93.83 0.05 13.54 2.87
F1/2 6.06 0.60 29 9.24 1.30 16.54 125.46 0.04 11.70 2.44
F 1/1 5.98 1.06 21 9.02 1.13 20.15 160.17 0.02 10.06 2.64
C1/2 5.21 1.27 18.5 8.58 1.07 26.92 188.36 0.04 10.26 2.49
C2/3 5.27 1.77 19 8.36 1.02 21.05 177.36 0.04 10.69 2.71
C1/1 5.13 2.27 16 8.8 1.57 43.38 206.92 0.05 9.50 3.34
EC= Electrical Conductivity, MC= Moisture Content, CEC= Cation exchange capacity OM= Organic Matter, TN= Total Nitrogen, BT= Before Transplantation, W= Water, F1/2= Fertilizer (25 ml), F1/1= Fertilizer (50 ml), C1/2= Culture (25 ml), C2/3= Culture (33 ml), C1/1= Culture (50 ml)
3-4. 토양 미생물 군집 확인
1) 0.5% 콜로이드 키틴이 포함된 CL(키틴+ LB)(표 7) 아가 배지에 투명환 생성 세균을 계수(도 52 및 53)하고 60℃에 1시간 처리 한 뒤 평판희석법에 의해 CL agar배지에 투명환 생성 세균을 계수하였다(도 54 내지 55).
CL(키틴+ LB) 아가 배지 조성 1 L
콜로이드 키틴 100 ㎖ LB 12 g
효모 추출물 0.5 g 증류수 500 ㎖
증류수 400 ㎖ Agar 10 g
아가 10 g - -
각 토양 10 g을 40, 50, 60 및 80일에 샘플링 하고 멸균수 100 ㎖과 혼합하여 100 ㎕를 CL 아가배지에 도말하고 투명환 생성 세균을 계수하였다. 미생물 처리구에서 키틴분해 미생물 수가 많았고, 60℃에 열 처리구도 배지 처리구에 비해 키틴분해 미생물 수가 많은 것을 확인하였다.
3-5. 토양미생물 활력도 조사.
1) 키티나아제 활성 측정.
토양시료에 콜로이드 키틴 기질을 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양했다. 그리고 샤레(schales) 시약 1 ㎖을 첨가하고 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다(도 56). 토양 속 키티나아제 분해 미생물이 미생물 처리구에서 가장 높게 나타난 것을 확인하였다.
2) 디하이드로제나아제(dehydrogenase) 활성 측정.
토양시료에 트리페닐테트라졸리엄클로라이드(Triphenyltetrazoliumchloride; TCC)를 첨가하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그리고 485 ㎚에서 흡광도를 측정하여 1,3,5-트리페닐포르마잔(1,3,5-triphenylformazan) 생산량을 측정하였다(도 57). Y1 균주가 많은 디하이드로제나아제를 생산하여 고추식물체가 생장하는데 영향을 미쳤다고 사료된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC13071BP 20160801
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel Bacillus amyloliquepaciens Y1 having Control Activity against Plant Pathogenic Fungi <130> PN160061 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1484 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 ccccagcgcg catactgcag tcgagcggac gatgggagct tgctccctga tgttagcggc 60 ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg 120 gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt ggcttcggct 180 accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240 cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300 gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 360 acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag 420 tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 480 tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540 ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca 600 ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa 660 atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg 720 ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780 acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag 840 cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900 acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960 catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc 1020 atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080 ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg 1140 aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1200 acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt 1260 ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1320 gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 1380 agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg ccgaaggtgg 1440 gacagatgat tggggtgatc aannnngnnn nnnntcaaaa aaaa 1484

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  9. 다음의 단계를 포함하는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amiloliquefaciens) Y1(KCTC 13071BP) 균주의 비멸균 배양 방법:
    (a) 질소원, 인원, 칼륨원, 탄소원, 물 및 과산화수소를 포함하는 배양배지를 제조하는 단계;
    (b) 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amiloliquefaciens) Y1(KCTC 13071BP) 균주를 접종하고 30℃ 내지 70℃에서 항온 배양하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 결과물을 수득하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 접종은 배양배지에 대하여 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Y1(KCTC 13071BP)을 0.01 내지 1.0 질량%를 접종하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 항온 배양은 1일 내지 20일 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
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  14. 질소원, 인원, 칼슘원, 탄소원, 물 및 과산화수소를 포함하는 비멸균 배양을 위한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amiloliquefaciens) Y1(KCTC 13071BP) 배양용 조성물.
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CN110878274A (zh) * 2019-12-30 2020-03-13 中化农业生态科技(湖北)有限公司 一种解淀粉芽孢杆菌培养工艺方法
CN112322542A (zh) * 2020-11-17 2021-02-05 青岛普罗百世生物科技有限公司 一种解淀粉芽孢杆菌及其对土壤养分含量和酶活性的影响

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KR100838103B1 (ko) * 2007-06-29 2008-06-16 대한민국 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 씨씨178 및 이를 이용한 잿빛곰팡이병 방제

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