KR100838103B1 - 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 씨씨178 및 이를 이용한 잿빛곰팡이병 방제 - Google Patents

신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 씨씨178 및 이를 이용한 잿빛곰팡이병 방제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 여러 가지 식물병원균을 방제할 수 있는 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178(KACC 91292P)을 분리 및 선발, 이를 이용하여 식물병원균을 방제하는 방법을 제공한다. 상기 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178은 채소재배 중 잿빛곰팡이병을 비롯하여 여러 가지 병해에 대한 발생 억제 효과가 높다. 또한 상기 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178은 병원균의 생장을 억제한다. 따라서 본 발명은 식물병원균에 대한 생물농약으로 기능 할 수 있으며, 잔류농약으로 인한 문제점을 방지할 수 있고 환경에 대한 해가 없는 농업 생태계 보전과 병해종합관리를 위한 획기적인 생물학적 방제방법을 제공할 수 있다.
길항균, 잿빛곰팡이병, 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178, 생물적 방제, 유용 미생물, 휘발성물질 생성

Description

신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 씨씨178 및 이를 이용한 잿빛곰팡이병 방제{Bacillus amyloliquefaciens CC178 AND BIOLOGICAL CONTROL OF GRAY MOLD BY USING THE SAME}
도 1은 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178의 16S rRNA gene sequence를 이용한 계통분류학적 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178의 16S rRNA gene sequence 분석으로 동정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178의 휘발성물질 생성에 의한 잿빛곰팡이병균의 생육을 억제하는 활성을 나타낸 것이다.
본 발명은 식물병원균의 생물학적 방제분야에 대한 것으로, 더욱 자세하게는 신규 미생물을 이용하여 신선 과채류 재배 중에 발생하는 잿빛곰팡이병을 방제하는 방법에 관한 것이다. 최근에 식물 병의 생물학적 방제에 대한 관심이 증대되고 있다. 생물학적 방제는 소비자의 안전한 농산물 요구 증대에 부응하여 환경에 유해한 화학적 농약을 사용하는 대신에 미생물 또는 식물추출물을 이용하여 환경, 다른 식 물 및 인축에는 영향을 미치지 아니하면서 대상 병을 선택적으로 방제하는 것이다.
특허출원 10-2002-0028954호 바실러스 아미로리퀴파시엔스 LX9(기탁번호 KCTC 18100P)는 고추역병에 한정하였으며, 균주의 생장조건이 최적 pH 7과 적정온도 25℃로 본 발명 균주와는 상이하였다. 특허출원 10-2001-0008919호 바씰러스 아밀로리퀴화씨엔스 씨엠비01(기탁번호 KCTC 0378BP)은 세제용 효소의 생산균주 개발에 대한 특허이며, 특허출원 10-2000-0081428호 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104(기탁번호 KCTC 18060P)는 균생장 조건이 최적 pH 7과 적정온도 33℃로 본 발명 균주와 상이하였다. 특허출원 10-2003-0092300호 바실러스 아밀로리쿼페이션스 KTGB0202(기탁번호 KCTC 10564BP)는 균생장의 생육 적온이 27-30℃로 본 발명 균주와 상이할 뿐만 아니라 항진균 스펙트럼의 범위가 좁은 문제점이 있으며, 특허출원 10-1998-0062437호 바실러스 아밀로리퀴페션스 KL1114(기탁번호 KCTC 8913P)는 영양원이용에서 탄소원으로 락토스와 마니톨, 질소원으로 트립톤을 잘 이용한다는 점에서 본 발명균과 차이점이 있다. 특허출원 10-2001-0048066호 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112(기탁번호: KCCM 10235)는 세균의 형태적 특성에서 내생포자의 위치가 중앙에 있으며, 생장온도범위가 17-45℃로 본 발명의 균주와 차이가 있다.
국외 연구로서 Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens FZB24는 잘록병과 시들음병에 한정되어서 본 발명균주와 차이가 있다(The Manual of Biocontrol Agents, 2004).
따라서 식물에는 해가 없으면서 특히 잿빛곰팡이병 이외에도 다른 식물병원균에도 효율적으로 작용할 수 있는 균주의 개발 및 이를 대량 배양하는 방법의 개 발이 절실히 요구된다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주는 채소류에 발생하는 잿빛곰팡이병균을 비롯한 여러 가지 병원균에 대하여 발병 억제 효과가 우수하여 병원균의 생장 및 증식을 억제하는 매우 유용한 미생물이다. 발명한 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주를 이용할 경우 인축에는 해가 되지 않고, 작물의 병해를 효율적으로 억제할 수 있는 방제방법 개발이 가능할 것으로 판단된다.
상기한 바와 같이, 채소 잿빛곰팡이병의 생물학적 방제법을 개발하기 위하여, 본 발명은 잿빛곰팡이병을 효과적으로 방제할 수 있는 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주를 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주를 이용한 과채류 잿빛곰팡이병의 방제용 조성물과 이를 이용한 생물적 방제방법을 제공하고자 함에 있다.
본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 및 이를 이용한 잿빛곰팡이병의 방제제와 방제 방법에 관한 것을 제공하고자 한다.
식물체에서 엽권 세균을 분리하고 생물검정을 통하여 병 진전억제효과가 우수한 세균인 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주를 선발하였으며, 형태적, 생화학적 특성 및 DNA profiles 비교 등을 통하여 균을 동정한 결과, 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 (Bacillus amyloliquefaciens CC178)로 동정되었다.
본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 배양조건을 제공한다. 산업적 사용을 위해서는 상기 균주를 단시간 내에 대량으로 배양할 수 있는 방법이 필수적이다. 발명한 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주는 배양배지로서 LB배지 상에서 잘 자라며, 10~45℃ 범위에서 생육이 가능하며 20~23℃에서 잘 자란다. 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 생육 pH 범위는 4.0~8.0이며 pH 5.0에서 가장 잘 자란다.
본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주를 이용하여 제제한 식물병원균 방제제 및 이를 이용한 식물병원균의 방제방법을 제공한다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주를 이용하여 방제할 수 있는 처리 대상균으로 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea ), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides ), 스크레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum ), 스클로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum ), 스클레로티움(Sclerotium sp.), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani ), 디디멜라 브로니애(Didymella bryonia ), 알터나리아 솔라니(Alternaria solani ), 코리네스포라 캐시콜라(Corynespora cassiicola ), 푸사리움 옥시시포룸(Fusarium oxysporum ), 파이토프쏘라 캡시시(Phytophthora capsici)가 해당된다. 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주는 상기 균의 생육을 저지하여 방제할 수 있다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주는 온실실험에서 잿빛곰팡이병의 발생을 7일간 억제하는 효과를 나타냈으며, 오이 시설재배포장에서 잿빛곰팡이병 발생을 74.2% 억제하는 효과를 보였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 구체적으로 설명하고자 하는 것으로, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시 예 1. 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 균주의 분리
춘천시 신북면 오이재배포장의 오이 잎으로부터 미생물을 분리하기 위하여, 오이잎을 마쇄하여 80℃에서 7분간 열처리하고, 10% TSA(Tryptic Soy Agar; 증류수 1ℓ, 트립톤 17g, 소이톤 3g, 글루코오스 2.5g, 염화나트륨 5g, 인산칼륨 2.5g, 한천 15g)배지에 도말 한 후 28℃에서 24시간 배양한 다음 단일 콜로니를 분리하고 2% 글리세롤에 넣어 -70℃에 저장하여 사용하였다.
실시 예 2. 본 발명 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 균주의 동정
분리균의 동정은 형태는 크기, 모양과 포자위치를 조사하였고, 생리조사는 온도반응, pH 및 여러 가지 생화학적 실험을 하였다. 분자생물학적 동정은 분리한 세균에서 DNA를 분리하여 16S rRNA gene의 염기서열을 분석하여 계통분류학적 위치를 밝혔으며, Bacillus속균의 종간 특징을 분류하기 위하여 DNA-DNA hybridization을 하여 Bacillus amyloliquefaciens로 동정하였다.
(1)16S rRNA 염기서열 분석
세균의 동정을 위해서는 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 이용하였다. 즉 DNA extraction kit(Toyobo, Japan)로 분리 균주의 DNA를 추출한 후 universal primer인 fD1(5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)과 rP2(5‘-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)를 이용하여 16S rDNA gene을 증폭하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물은 DNA sequencing kit (BigDye terminator Cycle Sequencing Ready Reacions v3.1; Applied Biosystem)를 사용하여 반응시킨 후, 3100 Genetic Analyser(Applied Biosystems)로 염기서열을 분석하여 도 2와 같은 결과를 얻었다. 염기서열은 NCBI server의 BLAST 프로그램을 통해 속(genus)까지 동정하였다. 분리균주와 표준균주간의 유연관계를 분석하기 위하여 CLUSTAL W program (Thompson et al., 1994)을 이용하여 염기서열을 정렬하였다. 정렬된 데이터셋은 MEGA version 3.1 (Kumar et al., 2004)프로그램을 이용하여 진화계통수를 작성하였다. branch의 안정성(bootstrap value)은 1,000회의 resampling을 통하여 조사하였다. 계통분류학적 분석결과 도 1에서 나타낸 바와 같이 바실러스 CC178균주는 B. mojavensis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens와 근연종으로 나타났으나, 종 동정을 위해서 필터 혼성화방법(filter hybridization)을 사용하였다. probe는 DIG-High prime system(Roche)으로 표지(labelling)하였고, 혼성화된 DNA는 DIG luminescent detection kit(Roche)로 현상하였다. 두 균주 간 DNA-DNA 상동성은 densitometer(Bio-Rad)로 정량한 후, 표 1과 같이 상동성 값에 기초하여 바실러스 아밀로리퀴페션스(Bacillus amyloliquefaciens) 71.6% 같은 종으로 동정하였으며, 이 균주의 생화학적 특성을 Reva 등(2001)의 분류 검색표에 따라 바실러스 아밀로리퀴페션스 (Bacillus amyloliquefaciens)로 동정하였다. 따라서 본 발명에 의한 균주는 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 로 명명하였다.
Bacillus type strain과 CC178의 DNA-DNA hybridization values(%)
Bacillus amyloliquefaciens (KACC 12067T) Bacillus atrophaeus (KACC 12090T) Bacillus mojavensis (KACC 12096T) Bacillus subtilis (KACC 10854T) Bacillus vallismortis (KACC 12149T) CC178
71.6 27.6 11.6 43.9 15.6 100%
(2) 형태 및 생화학적 특성 분석
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178의 형태 및 생화학적 특성
항 목 특 성
포자낭 부풀음 -
포자모양 ellipsoidal
포자위치 Subterminal
세포크기 >3 ㎛ -
28℃에서 생장 +
50℃에서 생장 +
pH 6.0에서 생장 +
5% (w/v) NaCl에서 생장 +
혐기적 생장(Anaerobic growth) -
녹말분해 +
카제인(casein) 분해 +
젤라틴(Gelatin) 용해 +
시트레이트(Citrate) 이용 +
질산화 감소 +
옥시다제(Oxidase) 활성 -
Voges-Proskauer 반응 +
탄소원 이용
글루코스(Glucose) +
아라비노스(Arabinose) +
만노스(Mannose) +
만니톨(Mannitol) +
아세틸글루코사민(N-Acetyl-Glucosamine) +
말토스(Maltose) +
글루코네이트(Gluconate) +
카프레이트(Caprate) -
아디페이트(Adipate) -
말레이트(Malate) +
페닐아세테이트(Phenyl-Acetate) -
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178의 형태 및 생화학적 특성은 상기 표2와 같다. 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 균주는 TSA배지에서 자라며 타원형의 포자를 형성한다. 세포의 크기는 3㎛보다 크다. 옥시다제시험(Oxidase test)에서는 음성반응을 보였고, Voges-Proskauer 반응은 양성을 나타내었다. 녹말(Starch), 카세인(Casein), 젤라틴(Gelatin)을 가수분해하였다. 그리고 5% 염화나트륨(NaCl)에서도 생육하는 특성이 있다. 탄소원으로 카프레이트(Caprate), 아디페이트(Adipate), 페닐아세테이트(Phenyl-Acetate)를 제외한 글루코스(Glucose), 아라비노스(Arabinose), 만노스(Mannose), 만니톨(Mannitol), 엔 아세틸글루코사민(N-Acetyl-Glucosamine), 말토스(Maltose), 글루코네이트(Gluconate), 말레이트(Malate) 등의 당을 이용하였다.
실시예 3. 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 균주의 선발과 배양
실내에서 PDA(Potato Dextrose Agar)배지를 분주한 페트리디쉬에 잿빛곰팡이병균의 균총과 실시예 1에서 분리한 분리균을 대치 배양하여 20℃에서 7일 정도 배양한 후 잿빛곰팡이병균을 억제하는 거리를 측정하여 1차 선발을 하였다. 1차 선발한 균주에 대하여 포트에 1엽기의 오이를 재배하여 분리 미생물을 TSB(Tryptic soy broth)배양액에 넣고 24시간 배양한 후 식물체에 분무처리하였다. 24시간이 지나고 병원균을 접종하여 접종상에 넣고 다시 24시간 후에 꺼내어 7일간 온실의 그늘에 놓은 다음 발병상태를 조사하여 잿빛곰팡이병 발생억제효과가 우수한 균주(CC178)를 최종선발하였다.
상기 선발된 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 대량배양조건을 확립하기 위하여 온도, 배지 pH에 따른 바실러스 아밀로리퀴페션스의 생육정도를 조사하였다.
먼저 바실러스 아밀로리퀴페션스의 생육온도를 알아보기 위해 온도구배장치(Bio-photo recorder, Advantec Toyo Kaisa, LTD) TN-2612를 이용하여 조사한 결과 발명한 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주는 표3에서와 같이 10～45℃ 범위에서 생육이 가능하며 20～23℃에서 가장 잘 자란다는 것을 알 수 있었다.
온도별 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 생장
온도(℃) 10 17 20 23 25 28 30 35 38 41 45 50
OD값 0.03 0.21 0.51 0.39 0.30 0.28 0.27 0.26 0.24 0.37 0.23 0
또한, 온도구배장치(Bio-photo recorder, Advantec Toyo Kaisa, LTD) TN-2612를 이용하여 배지종류에 따른 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178의 생육정도를 알아보았다. 이때 사용한 배지는 LB배지(Luria-Bertani 배지: tryptone 10g, yeast extract 5g, sodium chloride 10g, 증류수 1ℓ), TSB배지(Tryptic soy broth 배지: pancreatic digest of casein 17g, enzymatic digest of soybean meal 3g, dextrose 2.5g, sodium chloride 5g, dipotassium phosphate 2.5g, 증류수 1ℓ), NB배지(Nutrient broth : yeast extract 3g, peptone 5g, 증류수 1ℓ), PSB배지(Potato Semisynthetic broth: potato 30g, peptone 5g, sugar 20g, Ca(NO3)2 ·4H20 0.5g, K2HPO4 · 12H20 0.5g, 증류수 1ℓ) 그리고 KB배지(King's B broth : proteose peptone 20g, K2HPO4 2.5g, glycerol 15㎖, MgSO4 ·7H20 1.5g, 증류수 1ℓ) 였다. 하기 표4와 같이 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178는 LB배지에서 잘 자란다는 것을 확인 하였다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 배양배지별 생육
배지 OD값
LB 1.287
TSB 0.294
NB 0.431
PSB 0.761
KB 0.590
마지막으로 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178의 생육 적정 pH 범위를 조사한 결과, 표5와 같이 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178는 pH 4.0~8.0 범위에서 생육이 가능하며 그중 pH 5.0에서 가장 잘 자란다는 것을 알 수 있었다.
pH별 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 생장
pH 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
OD값 0.030 1.309 1.152 1.174 0.869
실시예 3. 식물병원균에 대한 균사생육 억제 효과
식물병원균 중에 잿빛곰팡이병을 일으키는 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 등 주요 식물병원균 11종에 대하여 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178의 길항력에 의한 균사생육 억제 효과 여부를 조사하기 위하여 실내에서 PDA배지를 분주한 페트리디쉬에 배양한 식물병원균의 5 mm 균총과 CC178균주를 20-25℃에서 7일-14일간 대치 배양한 후 식물병원균의 생육을 억제하는 거리를 측정하였다. 그 결과, 표 6에서와 같이 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 균주를 이용하여 방제할 수 있는 식물 병원균은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea ), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides ), 스크레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum ), 스클로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum ), 스클레로티움(Sclerotium sp.), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani ), 디디멜라 브로니애(Didymella bryonia ), 알터나리아 솔라니(Alternaria solani ), 코리네스포라 캐시콜라(Corynespora cassiicola ), 푸사리움 옥시시포룸( Fusarium oxysporum ) 그리고 파이토프쏘라 캡시시(Phytophthora capsici)임을 알 수 있었다.
식물병원균에 대한 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 길항력에 의한 균사생육 억제 효과
균사생육저지정도 병원균
+ 푸사리움 옥시시포룸( Fusarium oxysporum), 파이토프쏘라 캡시시( Phytophthora capsici)
++ 디디멜라 브로니애(Didymella bryonia), 알터나리아 솔라니(Alternaria solani), 코리네스포라 캐시콜라(Corynespora cassiicola), 스클로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani , Sclerotinia sclerotiorum), 스클레로티움(Sclerotium sp.)
+++ 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides)
+: 5mm 이하, ++: 5.1～10mm, +++: 10.1mm 이상
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 휘발성물질(volatile) 및 시더러포아(siderophore) 생산을 조사한 결과, 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주는 식물병원균의 생육을 억제하는 항생물질 생성뿐만 아니라, volatile(휘발성물질)과 시더러포아 활성을 나타내어 식물병원균 잿빛곰팡이병균의 생육을 억제하였다. 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 식물병원균 생육억제 활성은 표 7과 도 3에 나타내었다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 식물병원균 생육억제 활성
식물병원균의 생육 억제 활성
휘발성 물질 시더러포아
+ +
+ : 생성
실시예 4. 온실에서 오이 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과
포트에 1엽기의 오이에서 선발한 CC178균주를 TSB(Tryptic Soy Broth)배지에 24시간 배양하여 식물체에 분무처리하였다. 그리고 분무처리 당일, 3일, 5일, 7일과 10일 후, 잿빛곰팡이병균을 포자현탁액(1×106/ml)으로 접종하고 접종상에 넣어 24시간 후에 꺼냈다. 이것을 다시 7일간 온실 음지에 놓은 다음 발병 정도를 조사한 결과, 표 8과 같이 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주는 오이 잿빛곰팡이병의 발생을 7일간 억제하는 매우 우수한 방제 효과를 나타내었다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주 처리 후 경과일수별 오이 잿빛곰팡이병 발생억제 효과(온실)
처 리 처리일수별 발병도
0일 3일 5일 7일 10일
CC178 0 0 0 0 0.3
무처리 4.3 3.0 4.3 5.0 4.0
4종류의 다른 배지에서 배양된 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178를 상기 오이유묘 생물검정법과 같은 방법으로 접종하여 오이 잿빛곰팡이병의 발병면적율을 조사한 결과 하기 표 9와 같이, KB배지에서 0.8%, TSB는 4.2%, LB배지는 6.2%, NB배지는 30.2%로 KB배지가 억제효과가 좋았다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 배지별 배양액 처리 후 오이 잿빛곰팡이병 발생억제 효과(온실)
구 분 배지종류 무처리
KB TSB LB NB
병반면적율(%) 0.8 a 4.2 a 6.2 a 30.2 b 30.8 b
방제가(%) 97.4 86.4 79.9 1.9 -
* 여기서, a, b는 오이잿빛곰팡이병의 발병면적율을 통계적으로 나타낸 것으로 통계분석법 중 DMRT(덩컨의 다중검정법, Duncan's Multiple Range Test)에 의한 결과이다. a로 분류되는 KB, TSB와 LB배지는 병반면적율의 절대수치는 차이가 나지만 통계적 유의성은 없다는 것을 의미한다.
실시예 5. 포장에서 오이 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과
오이 시설재배포장의 잿빛곰팡이병 발생 초기 오이에 TSB배지에서 배양된 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주를 108cfu/㎖농도로 7일 간격 3회 경엽 처리한 결과, 표 10과 같이 최종처리 7일 후 잿빛곰팡이병에 대하여 74.2%의 우수한 방제효과를 나타냈다. 따라서 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주는 잿빛곰팡이병에 대한 방제제로서 효과적임을 알 수 있다.
포장에서 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 오이 잿빛곰팡이병 발생억제 효과
처 리 이병과율(%) 방제가(%)
CC178 6.9 74.2
무처리 26.7 -
실시예 6. 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 균주의 배양형태별 잿빛곰팡이병 균사생육 억제효과
CC178균주의 잿빛곰팡이병균에 대한 균생육 억제 특성을 조사하기 위하여 TSB배지에서 배양한 CC178균주 배양액을 5,000rpm으로 20분간 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하고, 다시 상등액은 필터로 여과하여 균체를 완전히 제거시켰다. 또한 일부 상등액은 농축기를 이용하여 1/10로 농축하였고, 일부 균체와 상등액은 멸균하였다. PDA배지가 분주된 직경 88mm 페트리디쉬에 중앙에 직경 5 ㎜ 잿빛곰팡이병균의 균총을 치상하고 일정한 간격으로 3개소에 준비된 CC178의 균체, 멸균한 균체, 상등액, 멸균한 상등액, 1/10배로 농축한 상등액, 베노밀수화제 1,500배액과, 무처리는 TSB배지를 3㎕씩 접종하여 3 반복으로 처리하였다. 처리한 페트리디쉬는 20℃ 항온기에서 10일간 배양한 다음, 균사생육을 조사한 결과, 하기 표 11과 같이 균체, 상등액, 멸균 상등액, 1/10로 농축한 상등액과 멸균한 농축 상등액에서 잿빛곰팡이병균의 균사생육을 억제시킨 반면에 멸균한 균체에서는 전혀 균사의 생육을 억제하지 못하였다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 배양형태별 잿빛곰팡이병의 균사 생장 억제
처 리 균사 생장 억제(mm)
균체 25.5
멸균 균체 0
상등액 20.9
멸균 상등액 13.0
농축한 상등액(1/10) 24.6
멸균한 농축상등액(1/10) 20.1
베노밀수화제(1,500) 32.5
TSB 배지 0
실시예 7. 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 의 영양원 이용
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 균주를 대상으로 영양원인 탄소원과 질소원의 이용 여부를 밝혀, 제품을 만들 때 대량액체배양을 위한 기초자료로 사용 할 수 있으며, 또 이러한 영양원 이용 특징은 다른 바실러스 아밀로리퀴페션스 균주와 본 발명 균주를 구별하는 방법으로도 이용할 수 있다.
본 실시 예에서는 기본 배지로 LB 배지를 사용하였고, 탄소원과 질소원을 이용한 생장효과는 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 균주를 48시간 배양한 후 620nm의 흡광도를 측정하여 알아보았다.
표 12에서와 같이, 탄소원의 종류에 따른 생장에서 소르비톨(sorbitol)이 가장 효과적이었으며 다음으로 크실로오스(xylose), 갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose) 순으로 생장이 좋았다. 질소원으로는 젤리틴(gelatin)이 가장 좋았으며 다음으로 corn steep liquor, asparagine, 효모 추출물(yeast extract) 순으로 생장이 좋았다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 균주의 영양원별 균생장
질소원 OD값 탄소원 OD값
아스파라긴(Asparagine) 1.835 소르비톨(Sorbitol) 1.827
프롤린(Proline) 1.450 크실로오스(Xylose) 1.711
Casein enzymatic hydrolysate 0.962 갈락토오스(Galactose) 1.243
알라닌(Alanine) 0.875 락토오스(Lactose) 1.087
젤라틴(Gelatin) 2.450 프룩토오스(Fructose) 0.982
Corn steep liquer 2.041 수크로오스(Sucrose) 1.159
염화암모늄(NH4)Cl 0.630 글리세롤(glycerol) 0.882
황산암모늄(NH4)2SO4 0.603 글루코스(Glucose) 1.161
효모 추출물(Yeast extract) 1.308 말토오스(Maltose) 0.817
질산칼륨(KNO3) 0.608 가용성 녹말(Soluble starch) 1.028
글리신(Glycine) 0.233 옥수수녹말(Cornstarch) 0.034
발린(Valine) 0.100 덱스트린(Dextrin) 0.013
실시예 8. CC178 균주의 영양원별 잿빛곰팡이병균의 생장 억제 효과
(1)탄소원
CC178균주의 최소영양배지(K2HPO4 0.7%, KH2PO4 0.2%, glucose 0.5%, (NH4)2SO4 0.1% MgSO4?7H2O 0.01%)에 glucose를 제외시키고 탄소원을 첨가하여 배양한 후에 잿빛곰팡이병균과 대치 배양하여 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 탄소원별 잿빛곰팡이병의 균사 생장 억제 정도를 알아보았다. 그 결과, 표 13과 같이 glucose을 첨가한 배양액이 62.0%, fructose가 24.1%, lactose는 24.0%로 다른 탄소원 보다 높은 균사생장억제율을 보였다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 탄소원별 잿빛곰팡이병의 균사 생장 억제
탄소원 균사생장(mm) 균사생장억제율(%)
갈락토오스(Galactose) 80 -
구연산나트륨 (Sodium citrate) 74 6.3
글루코오스(Glucose) 30 62.0
락토오스(Lactose) 60 24.0
크실로오스(Xylose) 76 3.8
프룩토오스(Fructose) 60 24.1
아라비노오스(Arabinose) 63 20.3
사카로오스(Saccharose) 66 16.5
말토오스(Maltose) 66 16.5
글리세롤(Glycerol) 70 11.4
Control 79 -
(2)질소원
CC178균주의 최소영양배지에 질소원을 제외시키고, 질소원별로 첨가하여 배양한 후에 잿빛곰팡이병균과 대치 배양하여 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 질소원별 잿빛곰팡이병의 균사 생장 억제 정도를 알아보았다. 그 결과, 하기 표 14와 같이 Trypton을 첨가한 배양액이 82.3%, (NH4)2HPO4이 80.6%로 다른 질소원보다 잿빛곰팡이병균의 균사생장억제율이 높다는 것을 알 수 있었다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 질소원별 잿빛곰팡이병의 균사 생장 억제
질소원 균사생장(mm) 균사생장억제율(%)
소고기 추출물(Beef Extract) 52 16.1
효모 추출물(Yeast extract) 50 19.4
인산수소암모늄((NH4)2HPO4) 12 80.6
인산암모늄(NH4H2PO4 ) 67 -
트립톤(Trypton) 11 82.3
질산나트륨(NaNO3) 65 -
프로테오스-펩톤 (Proteose-Peptone) 57 8.1
질산칼륨(KNO3) 65 -
Bacto Peptone 68 -
요소(Urea) 71 -
Control 62 -
(3)무기염
CC178균주의 최소영양배지에 무기염을 첨가하여 배양한 후에 잿빛곰팡이병균과 대치 배양하여 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 무기염별 잿빛곰팡이병의 균사 생장 억제 정도를 알아보았다. 그 결과, 표 15와 같이 KCl와 NaH2HPO4을 첨가한 배양액에서만 각각 10.5%로 잿빛곰팡이병균의 균사생장을 억제함을 알 수 있었다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주의 무기염별 잿빛곰팡이병의 균사 생장 억제
무기염 균사생장(mm) 균사생장억제율(%)
염화칼륨(KCl) 34 10.5
인산수소이나트륨(NaH2HPO4) 34 10.5
인산수소이칼륨(K2HPO4) 51 -
염화칼슘(CaCl2) 80 -
황산아연(ZnSO4) 80 -
염화니켈(LiCl2) 65 -
염화나트륨(NaCl) 38 0
염화바륨(BaCl2) 67 -
탄산칼슘(CaCO3) 65 -
염화마그네슘(MgCl2) 65 -
Control 38 -
이상 상기 구성 및 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178균주(KACC 91292P)는 오이 잿빛곰팡이병의 발생을 억제하는 능력이 우수하여 채소의 잿빛곰팡이병 방제를 위하여 적용될 수 있고 농업생태계 및 인축에 대하여 안전하므로 생물농약으로 개발이 가능하여, 농업 생태계 보전과 병해종합방제를 위한 획기적인 생물학적 방제방법을 제공할 수 있는 매우 유용한 발명이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 식물병원균을 방제하는 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178(KACC 91292P)균주.
  2. 제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페션스 CC178 균주의 균체, 배양액, 또는 그 균체와 배양액을 유효성분으로 하는 식물병원균 방제제.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 식물 병원균은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 스크레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 스클로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 스클레로티움(Sclerotium sp.), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 디디멜라 브로니애(Didymella bryonia), 알터나리아 솔라니(Alternaria solani), 코리네스포라 캐시콜라(Corynespora cassiicola), 푸사리움 옥시시포룸(Fusarium oxysporum), 파이토프쏘라 캡시시(Phytophthora capsici) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식물병원균 방제제.
  4. 제1항의 균주 또는 제2항의 식물병원균 방제제를 식물에 처리하여 식물병원균을 방제하는 방법.
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