KR20030090469A

KR20030090469A - 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ) ＬＸ 9 (ＫＣＴＣ18100Ｐ) 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20030090469A
Application number: KR1020020028954A
Authority: KR
Inventors: 김상달; 이은탁; 김영길; 임성규
Original assignee: 주식회사 백광소재; 김상달
Priority date: 2002-05-24
Filing date: 2002-05-24
Publication date: 2003-11-28
Also published as: KR100472376B1

Abstract

본 발명은 고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)에 대해 길항작용을 하는 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P), 그 제조방법 및 이를 함유하는 미생물제제에 관한 것으로 고추역병균에 대해 방제효과가 우수한 미생물농약의 제조에 사용될 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

바실러스 아미로리퀴파시엔스(Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ) ＬＸ 9 (ＫＣＴＣ 18100Ｐ) 및 그 제조방법{Bacillus amyloliquefaciens LX 9 and method for production of it thereof}

본 발명은 항진균 활성을 가지는 미생물, 그 제조방법 및 이를 함유한 미생물제제에 관한 발명이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)에 대해 길항작용을 하는 길항균주 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9 (KCTC 18100P), 그 제조방법 및 이를 함유하는 미생물제제에 관한 발명이다.

식물병원성 진균의 하나인 고추역병은 비교적 기온이 낮고 습한 하절기에 많이 발생하고 유묘기부터 전 생육기에 발생되며, 주로 뿌리와 땅 주변의 줄기부위에 발생되고 잎, 열매, 가지 등의 지상부에 발생되기도 한다. 병원균은 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)로서 토양 중에서 난포자의 형태로 월동하고 적당한 습도와 온도를 만나면 유주자낭을 형성하고 여기서 생긴 유주자에 의하여 전염된다. 이는 고추생산에 가장 큰 제한요인이 되고 있는 병해로서, 병원균이 토양속에 장기간 생존하면서 병을 일으키기 때문에 연작장해의 주원인이 되고 있다. 1986년도 고추주산단지의 실태조사결과 그 피해가 10% 이상 보고된 고장이 전체의63%에 이르고 있고 60%이상의 피해를 보는 농가만도 33%에 달하고 있다. 또한 이로 인해 그 수량의 감소가 50~100%에 달한다. 이와 같이 역병이 문제되고 있는 근본 원인은 방제가 어렵다는 데에 있다. 지금까지의 역병 방제는 주로 농약사용에 의존하고 있지만, 문제는 이러한 농약살포가 역병처럼 토양전염성인 병해에는 별 효과가 없다는 것이다. 저항성 품종의 재배에 의한 역병방제도 생각할 수 있으나, 현 농가 재배품종의 역병에 대한 저항성은 아주 없거나 낮은 단계에 그치고 있다.

약제살포에 의한 방제가 어려운 토양전염성 병해들을 방제하기 위한 수단으로 최근 토양미생물을 이용한 생물학적 방제방법이 많이 연구되고 있는데 이들 고추역병원균을 포함하는 식물병원성 진균에 대한 길항미생물을 이용한 생태학적 생물방제 방법에는 크게 3가지로 구분할 수 있다. 첫째, 길항미생물이 분비하는 외막가수분해효소인 키틴아제(chitinase), 베타-1,3-글루칸아제(β-1,3-glucanase)에 의해 식물병원균의 세포벽을 분해시키는 용균작용과 둘째, 철이온(Fe3+) 성분 결합물질인 사이더로포아(siderophore)에 의해 식물병원균의 생육을 억제하는 경쟁적 길항작용과 셋째, 항진균성 항생물질에 의해 직접 식물병원균의 생육을 억제하는 항생작용이 있다. 이와 같은 방법은 환경오염, 약해, 잔류독성의 문제를 야기시키지 않는다는 장점 외에 그 방제효과가 오래 지속된다는 면에서 매우 바람직한 방제방법으로 생각되고 있다.

이에 본 발명은 경작지 토양으로부터 고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)에 대해 강력한 길항작용이 있는 신규의 균주를 분리하고 그 배양방법을 확립하며 그리고 이를 함유하는 미생물 농약을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 토양으로부터 병원성 진균에 항진균 활성을 가지는 신규의 미생물을 선별하여 동정하고 이의 최적 배양조건을 확립한 후, 이들이 생산하는 항진균 활성물질의 특성을 조사하고, 이를 함유하는 미생물제제를 제조함으로써 달성되었다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위를 이들 실시예에 만 한정하지는 않는다.

도 1은 발육저지대법에 의한 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)LX 9 (KCTC 18100P)의 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)에 대한 성장 저해를 나타내는 사진도이다.

도 2는 야생상태인 고추에 대한 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)LX 9(KCTC 18100P)의 항진균 활성을 나타내는 사진도이다.

도 3은 배양시간에 따른 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)LX 9(KCTC 18100P)의 항진균 활성과 세포의 성장과의 관계를 나타내는 그래프이다.

도 4는 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)LX 9(KCTC 18100P)에 의한 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici) 유주자 생육 저해환을 나타내는 사진도이다.

본 발명은 고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)의 생육을 억제하는 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9( KCTC 18100P)를 제공한다.

또한 본 발명은 탄소원, 질소원, 무기염이 함유된 배지에서 온도를 25∼35℃, 시간을 10∼23시간, pH를 8∼10로 하여 배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P)의 제조방법을 제공한다.

바람직하게는 상기 탄소원은 프룩토스(fructose), 락토스(lactose) 또는 자일로스(xylose)이고, 질소원은 프로티오스 펩톤(proteose peptone), 트립톤(tryptone) 또는 펩톤(peptone)이고 무기염은 KCl, MgCl₂, K₂HPO₄, NaCl 또는 BaCl₂인 것이 좋다.

또한 본 발명은 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P) 또는 그 배양물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는고추역병균, 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici) 생육 억제용 미생물 제제를 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

첫째, 토착길항균주의 분리 및 선발에 대해 상세히 설명한다.

지역토양 내 우점능, 토착능, 복귀능이 강한 길항균주를 선발하기 위해 경북지역의 자연농법 저병해 경작지 토양을 분리원으로 하여 멸균 생리식염수에 현탁 및 희석하고, 이를 영양 한천배지에 접종하여, 30℃에서 1일간 배양시켜 분리한다.

항생물질을 생산하는 바실러스(Bacillus)속의 균주를 분리, 배양하기 위하여 상기 희석액을 80℃ 수조에서 30분간 열처리한 후 영양 한천배지에 접종하여 생존하는 균주를 분리한다.

고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)를 방제할 수 있는 길항균주의 분리·선발을 위하여 포테이토 덱스트로스 아가(Potato dextrose agar; PDA)에서 대치배양(paring culture)을 실시하여 큰 억제거리를 형성하는 균주들을 약 50여종을 분리하고, 이들 중 바실러스(Bacillus)속으로 추정되는 균주를 약 20여종 분리한다.

그 후 고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)와 대치배양을 시키고 발육균체량을 측정하면 고추역병균에 길항하는 생물방제균주 바실러스(Bacillus)sp. LX 9를 분리 할 수 있다.

분리된 토착길항균주의 분류학적 동정을 위해 바이오로그(Biolog)사의 동정시스템(MicroLogTM 3)와 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 색인을 이용하여 최종 동정한다. Gram 염색 결과 양성으로 나타나며 몇몇 생화학적 성상 실험을 바탕으로 한 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 조사와 바이오로그(Biolog)사의 동정시스템(MicroLogTM 3)을 이용하여 최종 동정하면 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)에 가장 가까운 동정 결과를 나타내고 따라서 본 연구에 사용된 바실러스(Bacillus) sp. LX 9을 최종적으로 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 그 근연종으로 최종 동정할 수 있다. 상기의 분리균주를 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁하였으며 기탁번호는 KCTC 18100P이다.

선발된 길항미생물을 대상으로 식물병원균을 시험균주로 하여 발육저지대 측정법(pairing plate culture; Lee, E. T., 1999, Antifungal Mechanisms and Genetic Development of Antagonistic Bacterium on the Phytopathogenic Fungi. Ph. D. Thesis. Yeungnam University. ), 발육균체량 측정법(cell mass test;Lee, E. T. and S. D. Kim, 2000, Selection and Antifungal Activity of AntagonisticBacterium Pseudomonassp. 2112 against Red-Pepper RottingPhytophthora capsici.Korean Journal of Appled Microbiology and Biotechnology. Vol. 28, No. 6, 334-340.)등의 생체외(in vitro)실험을 통하여 길항미생물의 방제력을 검증한 결과, 병원성진균의 성장이 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 선발된 길항세균 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)이 실제토양에서 고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)에 방제력을 발휘하는지 여부를 검증하기 위하여 고추(Capsicum annum)를 대상 기주식물로 하여 그 방제력을 조사한 결과, 화분(pot)실험에서도 강력하고도 훌륭한 방제력을 가짐을 확인할 수 있었다.

한편, Amicon 사의 Centriprep-10을 이용하여 분자량 10,000달톤 기준으로 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P) 배양상등액을 고분자와 저분자로 나누어 각각의 방제력을 발육균체량 측정법으로 확인한 결과 고분자와 저분자 공히 90%이상의 길항력을 보임을 알 수 있었다. 따라서 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)이 생산하는 억제물질이 공히 항생물질과 같은 저분자 물질, 효소단백과 같은 고분자 물질이라고 판단할 수 있었다.

상기 배양상등액을 80℃에서 20분간 열처리한 후 잔존 항생력을 확인한 결과, 열처리 전의 활성에 비해 90%이상의 길항력을 유지함을 알 수 있었고 Centriprep-10을 이용하여 저분자와 고분자로 분획하고 이들을 각각 80℃에서 20분간 열처리한 후 잔존 항생력을 확인한 결과 저분자와 고분자에 공히 활성을 보인다는 것을 알 수 있었다. 따라서 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)가 생산하는 고분자 및 저분자 물질이 각각 공히 고추역병균을 길항하는 것으로 사료되며, 또한 이들 길항물질이 열에 상당히 안정한 항생물질과 유사하다고 추정할 수 있었다.

한편, 길항세균이 생성하는 항진균성 항생물질의 pH 및 온도에 따른 안정성을 검토한 결과 상기 항진균성 항생물질은 pH 3에서 pH 10까지 넓은 범위에서 그길항력을 60%이상 유지하는 매우 안정된 물질이라는 것을 확인할 수 있었으며, 열에 상당히 안정한 물질임을 알 수 있었다.

둘째, 상기의 균주를 이용한 최적의 배양조건의 확립에 대해 상세히 설명한다.

배양시간에 따른 길항세균 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)의 균 성장도와 길항물질의 생산을 조사한 결과, 균성장은 10시간 후에 최고의 세포수를 보이며, 길항력은 21시간에 이르러 최고의 길항력을 보인다는 사실을 알 수 있었다. 균성장속도와 길항력을 조합하여 고려할 때 배양 시간은 10~23시간이 좋으며 더욱 바람직하게는 15시간 배양을 시키는 것이 좋다. 10시간에서는 균의 생장속도가 최대를 나타내며, 21시간에서는 저해물질의 생산이 최대가 된다.

배양 pH에 따른 길항세균 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)의 균 성장도와 길항물질 생산성을 조사한 결과 균성장은 pH 7이 가장 좋으며, 길항력은 pH 9가 가장 좋은 것을 알 수 있었다. 균성장과 길항력을 조합하여 고려할 때 pH는 7~9가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 배지 pH를 8.0에 맞추어 사용하는 것이 좋다.

배양온도에 따른 길항세균 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)의 균 성장도와 길항물질 생산성에 미치는 영향을 검토한 결과 균성장은 25℃가 가장 좋으며, 길항력은 30℃가 가장 좋다는 것을 알 수 있었다. 한편 이들 두 결과를 상호조합하면 배양온도는 25~30℃가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 28℃가 좋다.

배지의 조성이 균주의 생산에 끼치는 영향을 살피고자 탄소원과 질소원, 무기염의 조성을 변화시켜 이들의 관계를 조사한 결과, 프룩토스(fructose), 락토스(lactose) 또는 자일로스(xylose)가 항진균 활성과 길항세균의 성장을 고려할 때 바람직한 탄소원으로 판단되었다. 더욱 바람직하게는 프룩토스(fructose)가 좋다. 한편 질소원으로는 프로티오스 펩톤(proteose peptone), 트립톤(tryptone) 그리고 펩톤(peptone)이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 트립톤(tryptone)이 좋다. 그러나 무기 질소원들은 전반적으로 길항세균의 성장과 길항력이 유기질소원들에 비해 다소 떨어지는 것으로 확인되었다. 또한 항진균성 항생물질의 생산에 미치는 무기염에 있어서는 항진균 활성에 있어 KCl, MgCl₂, K₂HPO₄, NaCl, BaCl₂등이 좋은 방제력을 나타내며, 길항세균의 성장은 방제력은 떨어지나 칼슘(Ca) 이온이 다소 촉진하는 것으로 추정되었다.

실시예 1: 토착길항균주의 분리 및 선발

지역토양내 우점능, 토착능, 복귀능이 강한 길항균주를 선발하기 위해 경북지역의 자연농법 저병해 경작지 토양을 분리원으로 하여 멸균 생리식염수에 현탁, 희석하고, 이를 영양 한천배지에 접종하여, 30℃에서 1일간 배양시켜 분리하였다.

항생물질을 생산하는 바실러스(Bacillus)속의 균주를 분리, 배양하기 위하여 80℃ 수조(1.5 L)에서 30분간 상기 희석액을 열처리한 후 영양 한천배지에 접종하여 생존하는 균주를 분리하였다.

고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)를 방제할 수 있는 길항균주의 분리 ·선발을 위하여 포테이토 덱스트로스 아가(Potato dextrose agar; PDA)에서 대치배양(paring culture)을 실시하여 큰 억제거리를 형성하는 균주들을 분리하였다. 그 결과 약 50여종을 분리할 수 있었고, 이들 중 바실러스(Bacillus)속으로 추정되는 균주를 약 20여종 분리할 수 있었다. 그 후 고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)와 대치배양을 시키고 이어 발육균체량을 측정하여 고추역병균에 길항하는 생물방제균주 바실러스(Bacillus)sp. LX 9를 분리 할 수 있었다.

분리된 토착길항균주를 바이오로그(Biolog)사의 동정시스템(MicroLogTM 3)와 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 색인을 이용하여 동정하였다. 그 결과 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)에 가장 가까운 동정 결과를 나타내었으며 본 연구에 사용된Bacillussp. LX 9을 최종적으로 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 그 근연종으로 최종 동정하였다. 최종적으로 상기의 분리균주를 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁하였으며 기탁번호는 KCTC 18100P이다.

실험예 1: 길항미생물의 발육저지대 측정법에 의한 방제력 검증

PDA에서 고추역병균 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)와 선발균 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)과의 발육저지 거리를 측정하기 위하여 식물병원성 진균을 5 mm 크기의 disc로 접종하였다. 28 ℃에서 24시간 배양한 후 3cm 떨어진 곳에 길항세균을 백금이로 획선하여 28℃에서 계속 배양하였다. 그 결과 병원성진균의 성장이 억제되었다.(도 1).

실험예 2: 길항미생물의 발육균체량 측정법에 의해 방제력의 검증

45 mL의 PDB에 고추역병균 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)의 포자를 접종하였다. 여기에 길항세균을 보통영양배지(broth) 배지에서 28℃, 48시간 미리 배양하여 10,000×g에서 15분간 원심분리하여 균체를 제거하고 추가적으로 세균여과필터로 잔존 세균을 제거한 배양여액 5 mL을 첨가하여 28℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 이를 미리 건조시켜 중량을 측정한 Whatman No 2 여과지를 통해 배양된 병원성진균을 여과하여 80℃에서 건조시켰다. 여과지에 부가적으로 증가된 중량을 측정하여 억제력을 검증하였다. 그 결과에 배양상등액에 의해 90% 이상의 억제를 보였다(표 1).

파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)를 저해하는 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P)의 항진균 특성

	억제비율(%)
대조구의 억제효과	100
고분자량 물질(>10K)에 의한 억제효과	93
저분랴량 물질(<10K)에 의한 억제효과	96
가열(80℃, 20min)된 고분자물질(>10K)에 의한 억제효과	75
가열(80℃, 20min)된 저분자물질(<10K)에 의한 억제효과	88
대조구	0

실험예 3: 선발된 길항세균 바실러스( Bacillus ) sp. LX 9(KCTC 18100P)에 의한 in vivo pot 방제력의 검증

고추(Capsicum annum)를 대상 기주식물로 하여 그 방제력 검증을 실시하였으며, 상토로 밭흙 : 퇴비 : 모래를 2 : 1 : 1로 섞어 사용하였다. 28℃, 60% 습도를 유지한 항온항습실에서 3엽기의 고추묘를 직경 15㎝ 화분(pot)에 이식하여 3일간 정착시킨 후, 미리 V8 쥬스 한천배지에서 배양·형성시킨 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)의 유주자를 회수하여 480개/mL상당의 유주자를 함유하는 유주자 배양액 5 mL을 관주 접종한 후, 1일간 습실처리(28℃, 습도70%)하고여기에 선발된 방제균이 약 3.8×108/mL 균수를 가지는 방제균의 배양액 5 mL을 처리하여 하루동안 더 습실배양 하였다. 이를 28℃, 60% 항온항습실에서 키우면서 주기적으로 발병을 확인하였으며, 대조구인 방제균 무처리구와 비교하여 고추역병의 발병억제력을 확인하였다. 도 2에서 볼 수 있는바와 같이 화분(pot) 실험에서도 강력하고도 훌륭한 방제력을 보였다.

실험예 4: 항생물질의 확인

바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)이 생산하는 억제물질이 항생물질과 같은 저분자 물질인지, 효소단백과 같은 고분자 물질인지를 알아보기 위하여 Amicon 사의 Centriprep-10을 이용하여 분자량 10,000기준으로 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P) 배양상등액을 고분자와 저분자로 나누어 각각의 방제력을 발육균체량 측정법으로 확인하였다. 고분자와 저분자 공히 90%이상의 길항력을 보였다. 또한 배양상등액을 80℃에서 20분간 열처리한 후 잔존 항생력을 확인한 결과 열처리 전의 활성에 비해 5% 정도의 활성저해 만이 발생하고 90%이상의 길항력을 유지하였다(상기 표 1). 또한 Centriprep-10을 이용하여 저분자와 고분자로 분획하고 이들을 각각 80℃에서 20분간 열처리한 후 잔존 항생력을 확인한 결과 저분자와 고분자 공히 활성을 보였다.

실시예 2: 배양시간에 따른 항진균성 항생물질의 대량생산 조건 조사

길항세균 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)을 보통영양배지(broth)5 mL에 1 loop 접종하여 30℃에서 12시간 전배양하였다. 그 후 이를 1 L의 보통영양배지(broth)에 접종하여 30℃에서 계속 배양하였다. 이 때, 1시간 단위로 배양액을 20 mL 씩 회수하여 균성장도와 배양상등액에 의한 고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)의 방제력을 확인하였다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이 균성장은 10시간 후에 최고의 세포수를 보였으며, 길항력은 21시간에 이르러 최고의 길항력을 보였다.

실시예 3: 배양 pH에 따른 항진균성 항생물질의 대량생산 조건 조사

길항세균 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)을 보통영양배지(broth) 5 mL에 1 loop 접종하여 30℃로 12시간 전배양하였다. 그 후, 이를 pH 4에서 pH 10까지 각각 조정한 보통영양배지(broth) 50 mL에 접종하였다. 30℃에서 24시간 더 배양한 후 균성장도와 길항력을 검토하였다. 그 결과 표 2에서 볼 수 있는 것과 같이 균성장은 pH 7이 가장 좋았으며, 길항력은 pH 9가 가장 좋은 것으로 나타났다.

세포 성장에 대한 pH의 영향 및 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P) 의 항진균성

pH	세포성장 (Cell/ml)	최종 pH	저해비율(%)
4	3.0×10²	4.11	11.0
5	5.1×10⁶	7.10	53.2
6	5.93×10⁶	7.454	67.9
7	6.83×10⁶	7.554	86.2
8	5.31×10⁷	7.469	92.7
9	2.31×10⁴	7.495	100
10	1.83×10²	9.370	87.3

실시예 4: 배양온도에 따른 항진균성 항생물질의 대량생산 조건 조사

길항세균 바실러스(Bacillus) sp. LX 9(KCTC 18100P)를 보통영양배지(broth) 5 mL에 1 loop 접종하여 30℃에서 12시간 전배양하였다. 그 후 이를 다시 보통영양배지(broth) 50 mL에 동일량을 접종한 후 20℃에서 50℃까지 5℃ 단위로 24시간 배양한 후 균성장도와 길항력을 검토하였다. 그 결과 균성장은 25℃가 가장 좋았으며, 길항력은 30℃가 가장 좋은 것으로 나타났다(표 3).

세포 성장에 대한 온도의 영향 및 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9 (KCTC 18100P)의 항진균성

온도(Å℃ ℃℃)	세포성장 (Cell/ml)	최종 pH	저해비율(%)
20	7.1×10⁷	7.23	62.9
25	9.2×10⁷	7.35	89.9
30	6.0×10⁷	7.69	100
35	4.8×10⁷	7.60	88.2
40	3.2×10⁷	7.67	71.3
45	3.0×10⁷	7.72	56.2
50	1.3×10³	7.70	10.1

실시예 5: 항진균성 항생물질 생산에 미치는 탄소원의 영향

K₂HPO₄0.7%(w/v), KH₂PO₄0.2%(w/v), 구연산 나트륨(sodium citrate) 0.05%(w/v), (NH₄)2SO4 0.1%(w/v), MgSO₄·7H₂O 0.01%(w/v)(pH 8.5)의 조성으로 이루어진 최소영양배지 50 mL에 탄소원으로 글루코스(glucose)를 비롯한 9종의 탄소원을 1.0% (w/v)씩 첨가하여 28℃에서 24시간 균을 배양한 후, 그 원침배양상등액을 이용하여 균체량 측정법에 따라 항진균 활성을 조사하였다. 그 결과 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이 항진균 활성과 길항세균의 성장에 있어 프룩토오스(Fructose)가 가장 좋은 효과를 보였다.

바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P) 로부터 유래하는 항생물질의 생산을 위한 탄소원의 영향

탄소원	세포성장 (Cell/ml)	최종 pH	저해비율(%)
무첨가(None)	3.1×10⁴	6.99	54.3
프룩토오스(Fructose)	6.6×10⁶	6.92	100
락토오스(Lactose)	5.7×10⁶	6.95	82.5
자일로오스(Xylose)	2.9×10⁶	7.00	80.2
글루코오스(Glucose)	1.5×10⁶	6.84	93.6
라미라린(Ramirarin)	1.3×10⁶	6.92	91.2
말토오스(Maltose)	1.9×10⁵	7.00	73.4
사카로오스(Saccarose)	3.1×10⁴	6.87	69.9
글라이세롤(Glycerol)	7.9×10³	6.80	52.2
갈락토오스(Galactose)	5.8×10³	7.00	56.3

실시예 6: 항진균성 항생물질 생산에 미치는 질소원의 영향

상기 최소영양배지에 앞의 결과에서 선택된 탄소원을 최적 농도로 넣어준 후 12종의 무기 및 유기 질소원을 0.5%(w/v)씩 첨가하여 탄소원의 경우와 동일한 방법으로 항생물질 생산에 대한 질소원의 영향을 조사하였다.

상기 최소영양배지에 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)를 제외시키고 앞의 결과에서 선택된 프룩토오스(Fructose)를 1.0%(w/v) 넣어준 후 12종의 무기 및유기 질소원을 0.5%씩 첨가하여 28℃에서 24시간 균을 배양하였다. 그 후, 원침배양상등액을 회수하여 균체량 측정법에 따라 항진균 활성을 조사하였다. 그 결과 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이 항진균 활성에 있어 프로티오스 펩톤(proteose peptone), 트립톤(tryptone) 그리고 펩톤(peptone)이 가장 좋은 효과를 보였으며, 길항세균의 성장은 트립톤(tryptone)이 다소 좋은 것으로 나타났다. 그러나 무기 질소원들은 전반적으로 길항세균의 성장과 길항력이 유기질소원들에 비해 다소 떨어지는 것으로 확인되었다.

바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9 (KCTC 18100P)로부터 유래하는 항생물질의 생산을 위한 질소원의 영향

질소원	세포성장 (Cell/ml)	최종 pH	저해비율(%)
무첨가(None)	1.2×10⁵	7.30	26.9
(NH₄)₂S₂O₈	1.4×10⁷	6.92	95.9
트립톤(Tryptone)	6.9×10⁷	7.21	98.3
KNO₃	2.1×10⁵	7.27	62.1
프로티오스펩톤(Proteose peptone)	2.0×10⁷	7.19	100
박토 펩톤(Bacto peptone)	1.1×10⁷	7.30	98.7
(NH₄)₂HPO₄	1.6×10⁶	7.29	84.5
NH₂H₂PO₄	1.8×10⁷	7.01	94.9
NaNO₃	8.9×10³	7.28	87.1
요소(Urea)	2.1×10⁶	7.29	70.2
맥아 추출물(Malt extract)	1.5×10⁵	7.25	83.2
소고기 추출물(Beef extract)	5.6×10⁷	7.20	85.5
(NH₄)₃SO₄	3.1×10⁶	7.12	89.0

실시예 7: 항진균성 항생물질 생산에 미치는 무기염의 영향

무기염을 제외한 상기 최소영양배지에 앞서 결정된 탄소원과 질소원을 최적의 농도로 첨가한 후 12종의 무기염(salt)을 5 mM 농도로 넣어주어 항진균성 항생물질 생산에 미치는 영향을 조사했다. 무기염을 제외한 상기 최소영양배지에 탄소원으로 프룩토스(fructose)를 질소원으로 트립톤(tryptone)을 각각 1.0%와 0.5% 첨가하고 13종의 무기염(salt)을 각각 5 mM 농도로 넣어주어 28℃에서 24시간 균을 배양하였다. 그 후 원침배양상등액을 회수하여 균체량 측정법에 따라 항진균 활성을 조사하였다. 그 결과 항진균 활성에 있어 KCl, MgCl₂, K₂HPO₄, NaCl, BaCl₂등이 좋은 방제력을 나타냈으며, 길항세균의 성장은 칼슘(Ca) 이온이 다소 촉진하는 것으로 추정되었다.

바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9 (KCTC 18100P)로부터 유래하는 항생물질의 생산을 위한 무기염의 영향

무기염	세포성장 (Cell/ml)	최종 pH	저해비율(%)
무첨가(None)	2.1×10⁴	6.98	80.9
FeCl₃	2.0×10⁴	3.01	76.3
BaCl₂	3.4×10⁶	7.20	95.9
RbCl₂	3.6×10⁶	6.78	66.7
NaHPO₄	8.4×10⁵	7.02	75.3
CaCO₃	1.9×10⁷	7.68	50.2
ZnSO₄	3.5×10²	6.05	53.1
MgCl₂	4.2×10⁶	7.51	95.0
KCl	3.0×10⁶	7.10	100
LiCL	3.5×10⁶	6.99	90.1
K₂HPO₄	3.4×10⁶	7.20	96.2
NaCl	5.2×10⁶	6.96	97.8
CaCl₂	2.7×10⁷	7.39	51.3
Pb(CH₃COO)₂	2.9×10³	5.09	47.5

실험예 5: 항진균성 항생물질의 pH에 대한 안정성 검토

세균 배양액 1 L를 상기 정제과정의 용매전이 추출까지 실시한 후 3차수에 녹여 1N HCl과 NaOH로 pH를 1∼13까지 조정한 후 4℃에서 17시간 동안 전처리하였다. 다시 pH를 7로 조정한 후, 파이토프토라 카프시시(P. capsici)의 포자를 접종한 45 mL의 PDB 배지에 5 mL씩 첨가하여 30℃에서 2일간 진탕배양 하였다. 이를 미리 건조시켜 중량을 측정한 Whatman No 2 여과지로 배양된 병원성진균을 여과하여 80℃에서 건조시켜 증가된 중량을 측정하였다. 이상과 같은 생육균체량 측정법으로 길항활성의 변화를 측정한 결과 이 물질은 pH 3에서 pH 10까지 넓은 범위에서 그 길항력을 60%이상 유지하는 매우 안정된 물질이라는 것을 확인할 수 있었다(표 7).

바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P) 로부터 생산되는 항진균 항생물질의 pH 안정성

pH	저해비율(%)
1	32.9
2	44.2
3	70.8
4	79.8
5	81.2
6	86.1
7	88.3
8	93.5
9	81.7
10	62.9
11	9.7
12	5.1

실험예 6: 항진균성 항생물질의 온도에 대한 안정성의 조사

40℃∼121℃까지의 온도범위에서 30분 간(단 121℃의 경우는 20분) 처리한 후 항진균성 활성감소를 생육균체량 측정법으로 조사했다. 그 결과 표 8과 같이 121℃에서 20분 열처리한 후에도 처리하지 않은 것에 비해 60% 정도의 길항력을 유지했다. 이에 열에 대해서 상당히 안정적이라 판단할 수 있었다.

바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9 (KCTC 18100P)로부터 생산되는 항진균 항생물질의 열 안정성

온도(℃ )	저해비율(%)
비가열(No Heat)	100
40	100
60	96.2
80	86.9
100	71.7
121	61.3

실시예 8: 미생물 제제의 제조

탄소원으로 1.0%(w/v)의 프룩토스, 질소원으로 0.5%(w/v)의 트립톤, 무기염으로 5mM의 KCl이 함유된 배지 50 mL에서 pH를 8.0으로 하여 30℃의 온도에서 21시간 배양한 배양물을 용도에 따라 액제 또는 입제의 미생물 제조로 제조하였다. 액제 및 입제의 미생물제제의 조성은 다음 표 9와 같다.

바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9 (KCTC 18100P)을 이용한 액제(총량 1 L) 및 입제 미생물제제(총량 1 kg)의 조성

성분	액제	입제
바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9 (KCTC 18100P)	2×10⁹cfu/ml	2×10⁹cfu/g
Glycerol	1w/v%
NaCl	1w/v%
Tween 80	1w/v%
Potassium sorbate	0.2w/v%
Zeolite		100wt%
NaNO₃		0.01wt%
Glucose		1.0wt%

이상 상기 구성 및 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 고추역병의 병원균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)의 생물학적 방제에 있어서, 그 생육을 억제하는 뛰어난 효과가 있는 물질을 생산하는 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9 (KCTC 18100P), 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 제공하므로 미생물농약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

고추역병균인 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)의 생육을 억제하는 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P).
탄소원, 질소원, 무기염이 함유된 배지에서 온도를 25∼35℃, 시간을 10∼23시간, pH를 8∼10로 하여 배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P)의 제조방법.
제 2항에 있어서, 상기 탄소원은 프루토스(fructose), 락토스(lactose) 또는 자일로스(xylose)이고 , 질소원은 프로티오스 펩톤(proteose peptone), 트립톤(tryptone) 또는 펩톤(peptone)이고 , 무기염은 KCl, MgCl₂, K₂HPO₄, NaCl 또는 BaCl₂인 것을 특징으로 하는 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P)의 제조방법.
바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LX 9(KCTC 18100P) 또는 그 배양물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 고추역병균, 파이토프토라 카프시시(Phytophthora capsici) 생육 억제용 미생물 제제.