CN115029261B - 一种生防复合微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种生防复合微生物菌剂及其制备方法和应用，所述复合微生物菌剂包括短短芽孢杆菌FJAT‑0809‑GLX，短短芽孢杆菌FJAT‑10623和贝莱斯芽孢杆菌FJAT‑55034，所述短短芽孢杆菌FJAT‑0809‑GLX与短短芽孢杆菌FJAT‑10623、贝莱斯芽孢杆菌FJAT‑55034混合菌株的用量百分比为90％～70％:10％～30％，其中短短芽孢杆菌FJAT‑10623和贝莱斯芽孢杆菌FJAT‑55034的用量为1:1。本发明的复合微生物菌剂对葡萄灰霉病菌、龙眼焦腐病菌、莲雾黑腐病菌、枇杷炭疽病菌、梨炭疽病菌、甘薯灰霉病菌具有抑制作用，并且对葡萄灰霉病具有良好的防治效果。
Description
【技术领域】
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种生防复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
葡萄灰霉病由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染引起，是葡萄贮藏过程中的毁灭性病害，每年可造成葡萄高达50％的产后损失(张迪等，2017)。目前葡萄灰霉病的防治仍以化学杀菌剂为主，但长期使用化学杀菌剂不仅容易产生抗药性，而且农药残留导致环境污染及威胁人类健康等。绿色防控技术利用生态控制及生物防治等方法实现安全生产及化学农药使用量减少目标，从而构建环境友好型方式的生物控制措施(柯杨等，2017；Smilanicket al.,2010；Chen et al.,2016)。随着消费者对食品中的农药残留和环境安全的日益关注，开发病害控制的替代方法的需求也在不断增加(Rosslenbroich et al.,2000；Romanazzi et al.,2011)，因而，研究和寻找有效安全的葡萄灰霉病生物防治技术和方法，是解决葡萄绿色种植的重要方向之一。在实际生产应用时，复合生防菌对环境的适应性、抗病范围、防效稳定性等方面比单一菌株更有优势，能够提高对植物病害的防治效果(孙菲菲等，2012；Mao et al.,1998)。陈永珍(2013)利用复合生防细菌解淀粉芽孢杆菌和荧光假单胞菌防治烟草灰霉病，对单个菌株和复合菌株进行药效测试并发现，复合菌剂对灰霉病的防效显著高于单一菌剂。谯天敏(2015)利用铜绿假单胞菌和长枝木霉对竹梢枯病进行防治，结果表明两菌株分别对竹梢枯病有良好的防治作用，而将两个菌株混合使用，协同防效很大提高。因此，筛选获得不同功能微生物，进行复合菌剂的研发将更有助于葡萄灰霉病菌的绿色防控。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种生防复合微生物菌剂及其制备方法和应用，该复合微生物菌剂对葡萄灰霉病菌、龙眼焦腐病菌、莲雾黑腐病菌、枇杷炭疽病菌、梨炭疽病菌、甘薯灰霉病菌具有抑制作用，并且对葡萄灰霉病具有良好的防治效果。
本发明是这样实现的：
一种生防复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂包括短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX，短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034，所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX与短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034混合菌株的用量百分比为90％～70％:10％～30％，其中短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034的用量为1:1。
进一步地，所述的一种生防复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化：用接种环将短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)FJAT-55034分别划线于LB培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，并且培养温度为30℃；
(2)制备种子液：将步骤(1)所获得的短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034的单菌落分别接种于100ml的LB培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，温度30℃，转速180rpm/min；
(3)制备液体发酵液：按1％移种量将步骤(2)所获得的短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034种子液分别转入已消毒灭菌的LB培养基中培养，温度30℃，转速180rpm/min，培养48h；
(4)复合微生物菌剂的制备：将步骤(3)所获得的短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034液体发酵液按1:1混合，然后将短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX发酵液与该混合发酵液按90％～70％:10％～30％的比例混匀即可获得所述复合微生物菌剂。
进一步地，所述复合微生物菌剂用于抑制葡萄灰霉病菌、龙眼焦腐病菌、莲雾黑腐病菌、枇杷炭疽病菌、梨炭疽病菌、甘薯灰霉病菌的生长。
进一步地，所述复合微生物菌剂用于葡萄灰霉病的防治。
本发明具有如下优点：
本发明提供的生防复合微生物菌剂对葡萄灰霉病菌、龙眼焦腐病菌、莲雾黑腐病菌、枇杷炭疽病菌、梨炭疽病菌、甘薯灰霉病菌具有抑制作用，并且对葡萄灰霉病具有良好的防治效果，可为葡萄灰霉病生物防治提供了生防菌株筛选来源。
【具体实施方式】
本发明涉及一种生防复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂包括短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX，短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034，所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX与短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034混合菌株的用量百分比为90％～70％:10％～30％，其中短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034的用量为1:1。
本发明所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX，于2010年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.4115；所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623，于2021年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23697；所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034，于2021年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23698。
本发明还涉及上述一种生防复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化：用接种环将短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)FJAT-55034分别划线于LB培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，并且培养温度为30℃；
(2)制备种子液：将步骤(1)所获得的短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034的单菌落分别接种于100ml的LB培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，温度30℃，转速180rpm/min；
(3)制备液体发酵液：按1％移种量将步骤(2)所获得的短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034种子液分别转入已消毒灭菌的LB培养基中培养，温度30℃，转速180rpm/min，培养48h；
(4)复合微生物菌剂的制备：将步骤(3)所获得的短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034液体发酵液按1:1混合，然后将短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX发酵液与该混合发酵液按90％～70％:10％～30％的比例混匀即可获得所述复合微生物菌剂。
本发明也涉及上述一种生防复合微生物菌剂的应用，所述复合微生物菌剂是基于上述一种生防复合微生物菌剂的制备方法制备得到，所述复合微生物菌剂用于抑制葡萄灰霉病菌、龙眼焦腐病菌、莲雾黑腐病菌、枇杷炭疽病菌、梨炭疽病菌、甘薯灰霉病菌的生长。
本发明还涉及上述一种生防复合微生物菌剂的应用，所述复合微生物菌剂是基于上述一种生防复合微生物菌剂的制备方法制备得到，所述复合微生物菌剂用于葡萄灰霉病的防治。
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一、菌株的筛选分离
1、本发明中短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX是从福建省永泰县的西瓜根际土壤中分离的菌株。
1.1.该菌株FJAT-0809-GLX的分离：
(1)取西瓜根际土壤10g于90mL无菌水中，充分振荡后吸取1mL进行梯度稀释，选用稀释度为10-4，10-5或10-6；
(2)将步骤(1)获得的土壤稀释液涂布于NA培养基平板上，然后将NA培养基平板置于30℃下培养2d；
(3)将步骤(2)培养获得的各菌株接种于营养琼脂培养基中，并在温度30℃、转速180r·min-1条件下培养48h，收集培养液。
(4)将步骤(3)菌液进行葡萄灰霉病菌抑制筛选。筛选葡萄灰霉病菌接入PDA培养基上培养7d，待菌丝长满平板后，采用6mm打孔器进行打孔取菌饼，取3ml的菌液于30mLPDA培养基中(该PDA培养基组分：马铃薯葡萄糖琼脂培养基46g、水1000mL，pH7.2)，混合后制备成含有拮抗菌的平板，以等量的无菌水为对照，取6mm葡萄灰霉病菌菌饼于该平板上，25℃培养5天后，采用十字交叉法测定菌饼直径，获得拮抗菌株。
(5)菌株鉴定：将菌株送至中国科学院微生物研究所对其理化特性等进行鉴定，得到该菌株的主要形态及生物学特征如下：菌落无光泽，不透明，浅黄色，表面湿润，革兰氏染色呈阳性，营养体细胞杆状，大小约0.7×2.6μm，周生鞭毛；芽孢近椭圆形，中生，不膨大，无其它特殊结构。以下是其具体生理生化鉴定指标：
注：+表示有作用或有反应；-表示无作用或无反应
将上述各指标结合16S rDNA序列进行比对后鉴定该菌株为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)，命名为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX。所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX的序列如SEQ ID NO.1所示。
2、本发明中短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623是从福建省顺昌县的柑橘叶片分离的菌株。
2.1.该菌株FJAT-10623的分离：
(1)取柑橘叶片10g于90mL无菌水中，充分振荡后吸取1mL进行梯度稀释，选用稀释度为10-4，10-5或10-6；
(2)将步骤(1)获得的叶片稀释液涂布于NA培养基平板上，然后将NA培养基平板置于30℃下培养2d；
(3)将步骤(2)培养获得的各菌株接种于营养琼脂培养基中，并在温度30℃、转速180r·min-1条件下培养48h，收集培养液。
(4)将步骤(3)菌液进行葡萄灰霉病菌抑制筛选。筛选葡萄灰霉病菌接入PDA培养基上培养7d，待菌丝长满平板后，采用6mm打孔器进行打孔取菌饼，取3ml的菌液于30mLPDA培养基中(该PDA培养基组分：马铃薯葡萄糖琼脂培养基46g、水1000mL，pH7.2)，混合后制备成含有拮抗菌的平板，以等量的无菌水为对照，取6mm葡萄灰霉病菌菌饼于该平板上，25℃培养5天后，采用十字交叉法测定菌饼直径，获得拮抗菌株。
(5)菌株鉴定：将该菌株进行16S rDNA序列测定，并比对后鉴定该菌株为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)，命名为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623。所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623的序列如SEQ ID NO.2所示。
3、本发明中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034是从福建省福安市的葡萄叶片分离的菌株。
3.1.该菌株FJAT-55034的分离：
(1)取葡萄叶片10g于90mL无菌水中，充分振荡后吸取1mL进行梯度稀释，选用稀释度为10-4，10-5或10-6；
(2)将步骤(1)获得的叶片稀释液涂布于NA培养基平板上，然后将NA培养基平板置于30℃下培养2d；
(3)将步骤(2)培养获得的各菌株接种于营养琼脂培养基中，并在温度30℃、转速180r·min-1条件下培养48h，收集培养液。
(4)将步骤(3)菌液进行葡萄灰霉病菌抑制筛选。筛选葡萄灰霉病菌接入PDA培养基上培养7d，待菌丝长满平板后，采用6mm打孔器进行打孔取菌饼，取3ml的菌液于30mLPDA培养基中(该PDA培养基组分：马铃薯葡萄糖琼脂培养基46g、水1000mL，pH7.2)，混合后制备成含有拮抗菌的平板，以等量的无菌水为对照，取6mm葡萄灰霉病菌菌饼于该平板上，25℃培养5天后，采用十字交叉法测定菌饼直径，获得拮抗菌株。
(5)菌株鉴定：将该菌株进行16S rDNA序列测定，并比对后鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034。所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034的序列如SEQ ID NO.3所示。
二、菌株的应用
实施例1：不同混合比例复合微生物菌剂对葡萄灰霉病菌的抑制作用
葡萄灰霉病菌接入PDA培养基上培养7d，待菌丝长满平板后，采用6mm打孔器进行打孔取菌饼，取3ml的复合微生物菌剂于30mLPDA培养基中(该PDA培养基组分：马铃薯葡萄糖琼脂培养基46g、水1000mL，pH7.2)，混合后制备成含有拮抗菌的平板，以等量的无菌水为对照，取6mm葡萄灰霉病菌菌饼于该平板上，25℃培养5天后，采用十字交叉法测定菌饼直径。将所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX与短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034混合菌株分别按90％：10％、80％：20％和70％:30％的比例进行混合。不同混合比例复合微生物菌剂对葡萄灰霉病的抑制率分别为83.53％、85.10％和82.73％。因此，以80份短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX，20份短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034(此两株菌混合比例为1:1)混合的复合微生物菌剂抑菌效果最好，不过，实际应用过程中，混合比例90％：10％、80％：20％和70％:30％等均可。
表1不同比例混合复合微生物菌剂对葡萄灰霉病菌的抑制率
| 不同混合比例 | 抑制率％ |
| FJAT-0809-GLX 100％ | 67.63±4.46 |
| 90％:10％ | 83.53±1.15 |
| 80％:20％ | 85.10±1.83 |
| 70％:30％ | 82.73±4.49 |
实施例2：复合微生物菌剂对葡萄灰霉病菌、龙眼焦腐病菌、莲雾黑腐病菌、枇杷炭疽病菌、梨炭疽病菌、甘薯灰霉病菌生长的抑制作用
将葡萄灰霉病菌、枇杷炭疽病菌、龙眼焦腐病菌、莲雾黑腐病菌、梨炭疽病菌、甘薯灰霉病菌分别接入PDA培养基上培养7d，待菌丝长满平板后，采用6mm打孔器进行打孔取菌饼，取3ml的复合微生物菌剂于30mLPDA培养基中(该PDA培养基组分：马铃薯葡萄糖琼脂培养基46g、水1000mL，pH7.2)，混合后制备成含有拮抗菌的平板，以等量的无菌水为对照，取6mm葡萄灰霉病菌、枇杷炭疽病菌、梨炭疽病菌、甘薯灰霉病菌菌饼于该平板上，25℃培养5天后，采用十字交叉法测定菌饼直径。将所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX与短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034混合菌株按80％：20％比例进行混合。
该复合微生物菌剂对葡萄灰霉病菌的抑制率为85.10％，对甘薯灰霉病菌抑制率为82.74％，对莲雾黑腐病菌的抑制率81.57％，对龙眼焦腐病菌的抑制率为76.47％，对枇杷炭疽病菌的抑制率为68.97％，对梨炭疽病菌的抑制率分别为68.78％。
表2复合微生物菌剂对不同病原菌的抑制率
| 不同病原菌 | 抑制率％ |
| 葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea FJAT-32835 | 85.10±2.45 |
| 甘薯灰霉病菌Botrytis cinerea FJAT-32045 | 82.74±2.45 |
| 莲雾黑腐病菌Lasiodiplodia theobromae FJAT-9860 | 81.57±1.80 |
| 龙眼焦腐病菌Lasiodiplodia pseudotheobromae FJAT-3586 | 76.47±5.39 |
| 枇杷炭疽病菌Colletotrichum orbiculare FJAT-30256 | 68.97±3.45 |
| 梨炭疽病菌Colletotrichum acutatum FJAT-31072 | 68.78±0.92 |
实施例3：测定复合微生物菌剂对葡萄灰霉病的防治效果
取外观整齐无病虫害的夏黑葡萄叶片、果实，无菌水洗净晾干，75％酒精进行表面消毒。在叶片和果实针刺长3mm×宽3mm×深3mm伤口，每组处理30个，将其浸泡于1×106个/mL葡萄灰霉病孢子悬浮液10min后，晾干。再于稀释20倍复合微生物菌剂浸泡处理10min，晾干。以无菌水处理为对照，3个重复。置于25℃培养10d后，统计直径大于3mm的病斑数量，计算发病率。将所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX与短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034混合菌株按80％：20％的比例进行混合。葡萄叶片病原菌接种对照组发病率87.49％，复合微生物菌剂处理组发病率为48.34％；葡萄果实病原菌接种对照组发病率86.84％，复合微生物菌剂处理组发病率为27.27％。
表3、复合菌剂处理葡萄果实和叶片发病率
| 对照发病率％ | 处理发病率％ | |
| 葡萄叶片 | 87.49±1.41 | 48.34±1.21 |
| 葡萄果实 | 86.84±2.09 | 27.27±2.08 |
综上，本发明提供的生防复合微生物菌剂对葡萄灰霉病菌、龙眼焦腐病菌、莲雾黑腐病菌、枇杷炭疽病菌、梨炭疽病菌、甘薯灰霉病菌具有抑制作用，并且对葡萄灰霉病具有良好的防治效果，可为葡萄灰霉病生物防治提供了生防菌株筛选来源。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110> 福建省农业科学院农业生物资源研究所
<120> 一种生防复合微生物菌剂及其制备方法和应用
<130> 100
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1433
<212> DNA
<213> （Brevibacillus brevis）
<400> 1
gcagtcgagc gagtgtcttc ggaccctagc ggcggacggg tgagtaacac gtaggcaacc 60
tgcctctcag actgggataa catagggaaa cttatgctaa taccggatag gtttttggat 120
cgcatgatcc gaaaagaaaa gatggcttcg gctatcactg ggagatgggc ctgcggcgca 180
ttagctagtt ggtggggtaa cggcctacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg 240
tgaccggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga 300
attttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgaacgatg aaggtcttcg 360
gattgtaaag ttctgttgtt agggacgaat aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga 420
cggtacctga cgagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 480
ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta aagcgcgcgc aggcggctat gtaagtctgg 540
tgttaaagcc cggggctcaa ccccggttcg catcggaaac tgtgtagctt gagtgcagaa 600
gaggaaagcg gtattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt 660
ggcgaaggcg gctttctggt ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac 720
aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tgggggtttc 780
aataccctca gtgccgcagc taacgcaata agcactccgc ctggggagta cgctcgcaag 840
agtgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900
gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcccgc tgaccgctct ggagacagag 960
cttcccttcg gggcagcggt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcttt agttgccagc attcagttgg 1080
gcactctaga gagactgccg tcgacaagac ggaggaaggc ggggatgacg tcaaatcatc 1140
atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggt tggtacaacg ggatgctacc 1200
tcgcgagggg acgccaatct cttaaaacca atctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg 1260
cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc 1320
cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgggagtttg caacacccga agtcggtgag 1380
gtaaccgcaa ggagccagcc gccgaaggtg gggtagatga ctggggtgaa gtc 1433
<210> 2
<211> 1398
<212> DNA
<213> （Brevibacillus brevis）
<400> 2
tggctccttg cggttacctc accgacttcg ggtgttgcaa actcccgtgg tgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga 120
ttccgacttc atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagattgg ttttaagaga 180
ttggcgtcct ctcgcgaggt agcatcccgt tgtaccaacc attgtagcac gtgtgtagcc 240
caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccgcc ttcctccgtc ttgtcgacgg 300
cagtctctct agagtgccca actgaatgct ggcaactaaa gataagggtt gcgctcgttg 360
cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcacc 420
gctgccccga agggaagctc tgtctccaga gcggtcagcg ggatgtcaag acctggtaag 480
gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa 540
ttcctttgag tttcactctt gcgagcgtac tccccaggcg gagtgcttat tgcgttagct 600
gcggcactga gggtattgaa acccccaaca cctagcactc atcgtttacg gcgtggacta 660
ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcgc ctcagcgtca gttacagacc 720
agaaagccgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac cgctacacgt 780
ggaataccgc tttcctcttc tgcactcaag ctacacagtt tccgatgcga accggggttg 840
agccccgggc tttaacacca gacttacata gccgcctgcg cgcgctttac gcccaataaa 900
tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc 960
tttctcgtca ggtaccgtca aggtaccgcc ctattcgaac ggtacttatt cgtccctaac 1020
aacagaactt tacaatccga agaccttcat cgttcacgcg gcgttgctcc atcagacttt 1080
cgtccattgt ggaaaattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1140
cccagtgtgg ccggtcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg taggccgtta 1200
ccccaccaac tagctaatgc gccgcaggcc catctcccag tgatagccga agccatcttt 1260
tcttttcgga tcatgcgatc caaaaaccta tccggtatta gcataagttt ccctatgtta 1320
tcccagtctg agaggcaggt tgcctacgtg ttactcaccc gtccgccgct agggtccgaa 1380
gagactcgct cgactgca 1398
<210> 3
<211> 1514
<212> DNA
<213> （Bacillus velezensis）
<400> 3
tagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag 60
cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa cacgcgggta 120
acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga tggttgtctg 180
aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg gacccgcggc 240
gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccgaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga 300
gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 360
ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 420
tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct 480
tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540
ggtggtaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc 600
tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc 660
agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac 720
cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc 780
aaacaggatt agataccctg gtagtcccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg 840
ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc 900
gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat 1020
aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccagcattca 1140
gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa caaagggcag 1260
cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc gcagtctgca 1320
actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1380
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg 1440
gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg 1500
taacaaggta acca 1514
Claims (4)
1.一种生防复合微生物菌剂，其特征在于：所述复合微生物菌剂包括短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX，短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034，所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX与短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034混合菌株的用量百分比为90％～70％:10％～30％，其中短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034的用量为1:1；
所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX的保藏编号为CGMCCNo.4115；所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623的保藏编号为CGMCCNo.23697；所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034的保藏编号为CGMCCNo.23698。
2.如权利要求1所述的一种生防复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)菌株活化：用接种环将短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)FJAT-55034分别划线于LB培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，并且培养温度为30℃；
(2)制备种子液：将步骤(1)所获得的短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034的单菌落分别接种于100ml的LB培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，温度30℃，转速180rpm/min；
(3)制备液体发酵液：按1％移种量将步骤(2)所获得的短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)FJAT-0809-GLX、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034种子液分别转入已消毒灭菌的LB培养基中培养，温度30℃，转速180rpm/min，培养48h；
(4)复合微生物菌剂的制备：将步骤(3)所获得的短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)FJAT-10623和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJAT-55034液体发酵液按1:1混合，然后将短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)FJAT-0809-GLX菌株发酵液与该混合发酵液按90％～70％:10％～30％的比例混匀即可获得所述复合微生物菌剂。
3.一种生防复合微生物菌剂的应用，其特征在于：所述复合微生物菌剂是由权利要求2所述的一种生防复合微生物菌剂的制备方法制备得到，所述复合微生物菌剂用于抑制葡萄灰霉病菌、龙眼焦腐病菌、莲雾黑腐病菌、枇杷炭疽病菌、梨炭疽病菌和/或甘薯灰霉病菌的生长。
4.一种生防复合微生物菌剂的应用，其特征在于：所述复合微生物菌剂是由权利要求2所述的一种生防复合微生物菌剂的制备方法制备得到，所述复合微生物菌剂用于葡萄灰霉病的防治。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202210533250.6A CN115029261B (zh) | 2022-05-17 | 2022-05-17 | 一种生防复合微生物菌剂及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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