KR100423121B1 - 길항미생물 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 조104 및 이균주가 생산하는 항균물질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곰팡이 및 세균에 길항성을 갖는 미생물을 토양에서 분리하여 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104(Bacillus amyloliquefaciensCHO104)로 동정된 미생물의 배양액으로부터 분리한 항균활성물질 및 그의 분리방법 그리고 길항성을 갖는 미생물제제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 길항성을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104(수탁번호: KCTC 18060P)의 배양액으로부터 아밀로리퀴톤(amyloliquetone)으로 명명한 항균활성물질을 발견하였다.
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104의 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 배양여액을 얻고, 용매분획, 실리카겔 흡착 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피, 옥타데실실란 컬럼 크로마토그래피, 역상-HPLC 등의 단계를 거쳐 최종적으로 항균활성물질을 단리하였으며, 이 항균활성물질의 구조는 MS, NMR 분석에 의해 결정되었다.
본 발명의 아밀로리퀴톤 및 바실러스 아밀로피퀴파시엔스 CHO104 미생물제제는 항균효과가 있는 천연 항균제로서 의약품, 농약, 식품 등에 이용 등 광범위한 용도를 제공하게 될 것이다.

Description

길항미생물 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 조104 및 이 균주가 생산하는 항균물질{Bacillus Amyloliquefaciens CHO104 with Antagonic Property and Antimicrobial Compound Produced by This Strain}
본 발명은 토양유래의 길항미생물로, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104로 분리·동정된 미생물의 배양액으로부터 분리한 항균활성물질인 아밀로리퀴톤(amyloliquetone)과 그의 분리방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 곰팡이, 세균 등의 미생물 생육을 억제시키는 길항효과가 뛰어난 균주로 선발되고 동정된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104로 동정된 이 미생물(수탁번호: KCTC 18060P)은 길항효과가 뛰어나며 또한 이 미생물의 배양액으로부터 아밀로리퀴톤으로 명명한 항균활성물질을 분리하였다.
토양에서 분리한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104는 곰팡이 및 세균의 생육을 강력히 억제하는 길항작용을 보여, 이 균이 미생물의 생육을 저해하는 항미생물 활성물질을 생산하고 있는 사실을 실험적으로 확인하였으나, 항미생물 활성 원인물질을 알 수 없어, 본 발명자들은 이 균주를 배양하여 얻어진 배양액에 함유된 길항원인 활성물질을 분리하고, 구조결정에 성공하였다. 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스가 생산하는 항균활성물질인 아밀로리퀴톤에 관한 보고는 없다.
본 발명은 곰팡이, 세균 등의 생육을 강력히 억제시키는 길항성 미생물을 토양에서 분리·선발하고, 이 균주를 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104로 동정하였으며, 이 균주의 배양액으로부터 길항원인 활성물질로 아밀로리퀴톤으로 명명한 천연 항균활성물질을 분리하고 구조결정함으로써 이 균주가 갖는 길항원인물질인 항균활성물질을 발견하였으며, 또한 분리방법을 발견하였다.
본 발명의 아밀로리퀴톤 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104 미생물제제는 항균효과가 있는 항균제로서 의약품, 농약, 식품 등에 광범위한 용도를 제공하게 될 것이다.
본 발명은 병원성 곰팡이와 세균의 생육 억제 효과가 뛰어난 길항성 세균 CHO104를 토양에서 분리하고, 동정한 결과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 동정되어 2000년 11월 18일자로 한국과학기술원 생명공학연구소에 수탁(미생물의 명칭:Bacillus amyloliquefaciensCHO104, 수탁번호: KCTC 18060P)하였다.
이 미생물을 배양하여 얻어진 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 배양여액을 취한 후, 용매분획, 실리카겔 흡착 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피, 옥타데실실란 컬럼 크로마토그래피, HPLC 등의 단계를 거쳐 최종적으로 항균활성물질을 단리하였으며, 이 항균활성본체의 구조는 MS, NMR 분석에의해 결정되었다.
이하, 하기 실시예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
(실시예 1) 자연계로부터 길항미생물의 분리
식물의 병원성미생물에 길항성을 갖는 미생물을 선발하고자, 표1에서 제시한 식물병원균에 감염된 식물로부터 병원균을 분리하였다.
각종 병원균에 대한 길항미생물 선발은 전국에서 수집된 각종의 토양시료를 tris-HCl 완충용액(pH 7.5) 100 mL에 잘 혼합한 후 영양배지(Nutrient Broth)에 접종하여 25℃에서 30분간 배양시켰다. 배양액 일부를 취하여 생리식염수 (0.85% NaCl)에 단계적으로 희석하여 적정 농도로 영양한천배지(Nutrient Agar)상에 도포한 후 25℃에서 3일간 배양한 후 나타난 균총을 분리하였다. 병원 식물 병원균에 대한 길항성 실험을 위하여, 감자 포도당 한천배지(Potato Dextrose Agar)중앙에 식물 병원성 곰팡이들을 각각 접종하여 25℃에서 1일 배양한 후 주위 네 지점에 분리된 길항성세균을 접종하여 7일간 대치 배양 후 생육저해(Inhibition Zone)를 형성한 균주를 길항성세균으로 선발하였다. 이때 길항력의 정도는 대치배양한 경우와 곰팡이만 배양한 경우의 곰팡이 생육환의 지름을 측정하여 아래의 식으로 결정하였다. 그 결과, 길항성이 뛰어난 길항세균 CHO104를 선발하였으며 이 균주의 길항력을 표 2에 나타내었다.
길항력 (Zone of Inhibition) = (NT - T)/NT ×100
NT : 무처리구의 균총 지름[colony diameter of no treatment(mm)]
TN : 처리구의 균총 지름[colony diameter of treatment(mm)]
(실시예 2) 선발된 길항성세균 CHO104의 미생물 생육억제효과
각종의 식물 병원성 곰팡이를 감자 포도당 한천 사면배지 상에 접종하여 7일간 배양한 후 멸균된 Tween 80 용액(0.1%, v/v) 1 mL와 멸균 증류수 5 mL을 가하여 포자를 씻어내고 여과지에 여과시켰다. 얻어진 포자를 멸균 증류수로 3회 씻어준 후 mL당 107~108개의 포자가 포함되도록, Tween 80 용액과 증류수에 다시 현탁시켰다. 길항성 세균은 SDBP 배지(간장 3%, 포도당 5%, 비프 익스트렉트 0.1%, 프로테오스 펩톤 0.1%) 50 mL에 길항세균 1 mL을 접종하여 30℃에서 3일간 배양하여 사용하였다.
1) 길항균 배양액 살포가 유해곰팡이 억제효과
식물 병원성 곰팡이를 감자 포도당 한천배지에 각각 접종하여 1일간 배양한곰팡이를 감자 포도당 한천배지에 각각 접종하여 1일간 배양한 후 길항균 CHO104가 포함된 배양액 1 mL씩을 생육중인 곰팡이 표면에 부은 후 25℃에서 7일간 배양하면서 생육도를 대조구와 비교하여 길항력을 조사하였다. 실험결과, 표 3에 제시한 바와 같이 모든 병원성 곰팡이에서 95%이상의 억제율을 보였으며, 특히 겹무늬썩음병(부패병), 탄저병, 점무늬낙엽병(반점낙엽병), 부란병, 줄기마름병(동고병), 푸른곰팡이병, 시들음병, 잘록병(입고병), 잿빛곰팡이병, 뿌리썩음병, 자주날개무늬병(자문우병), 흰날개무늬병(흰문우병) 원인 곰팡이의 경우는 완전히 억제되었다.
2) 길항성세균 CHO104 배양여액을 함유한 배지에서 식물 병원성 곰팡이 억제효과
길항성세균 CHO104 배양여액을 함유한 배지를 제조하였다. 즉, 250 mL의 물에 감자포도당 배지 39 g을 녹여 멸균한 후 충분히 식었을 때 750 mL의 CHO104 배양 여과액을 더하여 배지를 만들었다. 식물 병원성 곰팡이를 접종하여 30℃에서 7일간 배양하면서 곰팡이의 생육억제 정도를 조사하여 길항력 정도(Zone of Inhibition)로 나타내었다. 길항성세균 배양여액을 함유한 고체배지에서 식물 병원성 곰팡이를 배양한 결과 겹무늬썩음병(부패병), 탄저병, 점무늬낙엽병(반점낙엽병), 부란병, 줄기마름병(동고병), 시들음병, 뿌리썩음병, 자주날개무늬병(자문우병), 흰날개무늬병(흰문우병)의 곰팡이는 표 4에 제시한 바와 같이 완전히 생육이 억제되었다.
3) 길항성세균 CHO104의 열처리배양액을 함유한 배지에서 식물 병원성 곰팡이 억제효과
길항성세균 열처리 배양액을 함유한 배지를 제조하였다. 즉, 배양후 원심분리하여 얻어진 상등액을 121℃에서 15분간 처리한 열처리배양액에 이 배양액 전체 부피에 해당하는 감자포도당 배지 39 g의 분말을 녹여 멸균한 후 배지를 만들었다. 식물 병원성 곰팡이를 접종하여 30℃에서 7일간 배양하면서 곰팡이의 생육억제 정도를 조사하여 길항력 정도(Zone of Inhibition)로 나타내었다. 길항성세균 열처리 배양액을 함유한 고체배지에서 식물 병원성 곰팡이를 배양한 결과, 겹무늬썩음병(부패병), 탄저병, 부란병, 줄기마름병(동고병), 시들음병, 잿빛곰팡이병, 뿌리썩음병, 자주날개무늬병(자문우병), 흰날개무늬병(흰문우병)등의 곰팡이 생육은 표 5에서 제시한 바와 같이 완전히 억제되었다.
(실시예 3) 길항성미생물 CHO104의 동정
길항력이 뛰어난 균주로 선발된 CHO104를 동정하기 위하여 미생물의 형태적 성질, 배양적 특성 및 생리 생화화적 성질 등을 검토하였다. 또한 BiologMicroLog3 4.01A로 동정한 결과 가능성(PROB) 99%, 유사성(SIM) 0.74의 결과로서Bacillus amyloliquefaciens로 동정되었다. 이러한 결과와 Bergey's manual of systematic bacteriology, microbiological method 등에 기술된 분류기준에 따라 CHO104 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 동정되었다. 또한 CH0104 균주의 16S rRNA를 PCR로 증폭하기 위해서 genomic DNA l μL,E.coli의 universal primer (Forward : 5'-TGGCTCAGAACGCTGGCGGC-3', Reverse : 5'-CCCACTGCCTCCCGTAAGGAGT-3')를 각각 1 μL씩 AccuPower PCR PreMix (Bioneer Inc)에 넣고 최종 부피를 20μL로 맞추었다. PCR 조건은 denaturation : 94℃, 30 sec, annealing : 55℃, 30 sec, extention : 72℃, 30 초로 30회 반복 시행하였다. 이후 PCR 산물을 gel elution kit (Bioneer Inc)를 이용하여 추출하고 추출된 PCR 산물을 벡터(pGEM T-easy vector, Promega Inc)에 ligation 시킨 후 DH5 α에 형질 전환시켰다. ABI 사의 Automated DNA sequencer로 sequencing하여 얻어진 CH0104 균주의 16S rRNA partial nucleotide sequence data를 NCBI에 있는 브라스트 검색(Blast search)을 이용하여 시퀀스 호모로지(sequence homology)를 비교한 결과, 345개의 뉴크레오타이드(nucleotides)중 342개가 일치하여 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefacens)와 99%의 유사성을 나타내었다. 이상의 결과로부터, 길항력이 우수한 균주 CH0104는Bacillus amyloliquefacens로 동정되었으며, 한국과학기술원 생명공학 연구소에B. amyloliquefacensCH0104 균주로 수탁하였다.(수탁번호: KCTC 18060P).
(실시예 4) 길항성세균Bacillus amyloliquefaciensCHO104(수탁번호: KCTC 18060P)의 배양
1) 배양온도에 따른 성장
Bacillus amyloliquefaciensCHO104의 성장최적조건을 설정하기 위해서 배양액의 온도를 25∼45℃ 범위에서 생육도를 조사하였다. 실험결과 33℃에서 생장이 가장 좋은 결과를 보였다.
2) 성장에 미치는 pH의 영향
배지의 pH를 변화시키면서 길항균을 배양한 결과 가장 적합한 pH의 범위는 7내외인 것으로 측정되었다.
3) 대량배양
Bacillus amyloliquefaciensCHO104를 영양한천(Nutrient Agar)배지에서 2∼3회 정도 계대배양하여 활성화시킨 균주를 모균으로 하여, 1 백금이 정도의 균주를 5 mL의 SDBP (Soy Dextrose Beef ex. Proteos Peptone)배지(간장 3%, 포도당 5%, 비프 익스트렉트 0.1%, 프로테오스 펩톤 0.1%)에서 33℃, 12시간동안 배양하였다. SDBP배지에 넣고 배양한 후 배양한 균주 중에서 1%의 균주를 채취하여 새로운 SDBP배지에 옮겨 24시간 진탕 배양하여 길항원인물질의 규명에 사용하였다.
(실시예 5) 천연항균활성물질의 분리
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104의 배양액을 원심분리(5,000 rpm, 15 분)하여 균체를 제거한 배양여액(7 L)을 1 N HCl로 pH 3으로 조정한 다음, 에칠아세테이트로 분배하여 에칠아세테이트 가용 산성·중성획분(EtOAc-soluble acidic·neutral fraction)과 수상획분을 얻었다. 에칠아세테이트 가용 산성·중성획분을 pH 8.0으로 조정된 2% NaHCO3으로 분배하여, 에칠아세테이트 가용 중성획분(EtOAc-soluble neutral fraction)과 수상획분을 얻었다. 얻어진 각 획분의 항균활성을 페이퍼 디스크법(Zaika, L.L.,J. Food safety, 9, p. 97-118, 1988)으로 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 곰팡이로서 보트리티스 시너레아(Botrytis cinerea)를 대상으로 검정한 결과, 에칠아세테이트 가용 중성 획분에서 강한 항균활성이 나타났으며, 이후 활성물질의 정제과정에서 항균활성검정은 스타필로코코스 아우레우스에 의한 활성여부로 수행하였다.
에칠아세테이트 가용 중성획분(421 mg)을 실리카겔 흡착 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 에칠아세테이트 용액에서 메탄올 용액의 농도를 점진적으로 높여 용출분획하여 활성을 검정한 결과, 활성은 에칠아세테이트-메탄올(100:0, v/v)획분에서 나타났으며, 활성 획분 127 mg을 얻었다. 이 활성분획물을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(메탄올-클로로포름 4:1, v/v)로 분획하여 활성을 검정한 결과,Ve/Vt (elution volume/column bed volume) 0.64∼0.78의 위치에서 용출된 분획물에 활성이 나타났다. 이 활성획분(120 mg)을 옥타데실실란 컬럼 크로마토그래피( 메탄올-물)에 의해서 용출 분획하여 활성을 검정한 결과, 메탄올-물 80:20 (v/v)의 용매로 용출된 획분(14.6 mg)에 활성이 나타났다. 이 활성획분(14.6 mg)을 역상컬럼을 탑재한 HPLC (Senshu pak, 8 ×250 mm, 70% 메탄올, 1.5 mL/min)에 의하여 retention time 19분에 단일피크로 분리되어, 백색분말 형태로 3.36 mg을 성공적으로 단리하였다. 단리된 활성물질 10 ㎍을 6 mm paper disc에 올려 스트렙토코코스 아우레우스에 대한 활성을 검정한 결과, 생육억제환의 크기는 12 mm로, 대조구로 사용한 벤조산(200 ㎍)은 10 mm로 나타났다. 또한 단리된 활성본체의 최소저해농도(MIC)는 5 ㎍ 이하 수준이었다.
(실시예 6) 기기분석에 의한 아밀로리퀴톤의 구조결정
아밀로리퀴톤의 구조를 결정하기 위하여 질량분석기(MS, Jeol JNM AX 505 WA, 30 eV)에 의해 측정된 질량 분석치는 통상의 EI-MS에서 채용하는 70 eV에서는 분자 개열이 심하여 분자 이온의 관측이 불가능하였으나, 30 eV로 낮추어 측정한 결과, 분자이온 [M+] 이m/z(rel. int.) 402(1.3)에서, 개열(fragment) 이온이 384(15.4), 366(18.6), 273(15.6), 255(16.0), 227(9.0), 172(20.7), 133(35.1), 107(54.8), 81(82.0), 67(base peak)에서 측정되었고, 고분해 질량분석(HR-MS)에 의해 분석된 값은m/z402.2401이었으며, 측정된 분자식은 C24H34O5이었다. 또한, 핵자기공명분석기(NMR, Varian Unity Inova 500, 500 MHz, CD3OD)에 의해 측정된1H-NMR,13C-NMR, HMBC(하기에 스펙트럼제시)등의 분석 결과와 질량분석의 결과를 종합하여 아밀로리퀴톤의 구조를 하기와 같이 결정하였다.
(실시예 7) 아밀로리퀴톤의 항균활성 검정
실시예 5에서 기술한 방법으로 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104의 배양액으로부터 단리된 아밀로리퀴톤의 항균활성을 페이퍼 디스크법(Zaika, L.L.,J.Food safety, 9, p. 97-118, 1988)으로 실시하였다. 즉, 푸어 플레이트 방법(pour plate method)에 의해 45℃로 조절된 멸균배지 20 mL에 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureusKCTC1928)의 전배양액 0.1 mL를 혼합시킨 후, 페트리디쉬에 넣고 응고시킨 다음, 항균 활성물질이 포함된 6 mm 크기의 페이퍼디스크를 올려 0.85% 식염수로 확산시킨 후 30℃에서 16시간 배양하여 생육저해환의 크기(mm)로 효과를 측정하였다. 배지는 뉴트리언트(Nutrient) 배지(Difco)를 사용하였다. 또한 곰팡이에 대한 항진균활성검정은 보트리티스 시너레아(Botrytis cinerea)의 포자를 도말한 감자포도당 한천배지(PDA Plate, 두께 4 mm)상에 생육저해(Inhibition zone)를 형성하는 방법으로 검정하였다. 즉, 멸균된 cork borer(직경 9 mm)를 사용하여, 원형의 agar hole를 만든 후 아밀로리퀴톤을 넣어 28℃에서 4일간 배양시킨 후 그 생육저해의 크기로 활성을 측정하였다. 스타필로코코스 아우레우스와 보트리티스 시너레아를 대상으로 벤조산(benzoic acid)를 대조구로 하여측정된 결과는 표 6과 같다.
즉, 아밀로리퀴톤은 곰팡이 및 세균에 대해 강한 항균활성을 나타내었다.
본 발명은 토양에서 길항성 미생물로 선발되어, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스로 동정된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104(수탁번호: KCTC 18060P) 및 이 미생물의 배양액에서 항균활성물질로 분리되고 구조 결정된 아밀로리퀴톤과 이 미생물을 포함한 배양액은 천연 항균제로써 의약품, 농약, 식품 등에 광범위하게 이용 될 수 있다.

Claims (8)

  1. 토양에서 분리된 길항성 미생물 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104 (Bacillus amyloliquefaciens CHO104, 수탁번호 : KCTC 18060P)로 구성된 미생물제제
  2. 제 1항에 있어서, 미생물 제제에 적용할 수 있는 식물의 병원균은 겹무늬썩음병(부패병), 탄저병, 점무늬낙엽병(반점낙엽병), 부란병, 줄기마름병(동고병), 참다래과실무름병, 시들음병, 잘록병(입고병), 잿빛곰팡이병, 뿌리썩음병, 자주날개무늬병(자문우병), 흰날개무늬병(흰문우병)의 병원성 곰팡이를 포함한 식물 병원균을 특징으로 하는 미생물제제.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 균주를 SDBP(Soy Dextrose Beef ex. Proteos Peptone)배지(간장 3%, 포도당 5%, 비프 익스트렉트 0.1%, 프로테오스 펩톤 0.1%)에서 30∼35℃에서 배양시킴을 특징으로 하는 미생물제제.
  4. 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104 (수탁번호 : KCTC 18060P)의 배양액으로부터 분리하여 얻은 하기와 같은 구조를 갖는 항균활성 물질
  5. 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104의 배양단계와 배양여액 분리단계, 그리고 상기 배양액을 pH 3(1 N HCl)으로 조절하여 분배한 수상획분과 에칠아세테이트 가용 산성·중성획분(EtOAc-soluble acidic·neutral fraction)분리단계와, 상기의 에칠아세테이트 가용 산성·중성획분을 다시 약알칼리성인 2∼5%의 NaHCO3(pH 8.0)용액과 분배한 후 수상획분과 에칠아세테이트 가용 중성획분으로 분리하는 단계와, 상기의 에칠아세테이트 중성획분을 실리카겔 흡착 컬럼 크로마토그래피에 의해서 에칠아세테이트에 메탄올의 농도를 점진적으로 높여 용출분획하여 활성획분을 얻는 단계와, 상기의 획분을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피에 의하여 활성획분을 분리하는 겔 여과 단계와, 상기의 활성획분을 옥타데실실란 컬럼 크로마토그래피로 활성획분을 분리하는 단계와, 상기의 정제된 활성획분을 역상의 HPLC로 메탄올-물의 용매계에 의하여 단리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CHO104가 생산하는 항균활성물질의 제조방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008111719A1 (en) * 2007-03-13 2008-09-18 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Bacillus amyloliquefaciens k317 for suppressing the growth of antibiotics-resistant pathogenic microorganism or enteropathogenic microorganism
KR101066877B1 (ko) 2008-09-11 2011-09-26 목포대학교산학협력단 지력증진을 통한 참다래병의 생물학적 방제를 위한 발효퇴비

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100426930B1 (ko) * 2001-06-29 2004-04-13 한국생명공학연구원 음식물 찌꺼기의 습식발효를 위한 양돈 사료화 능력을 보유한 신규한 균주 바실러스 아밀로리키페이시엔스 비 4
KR100429586B1 (ko) * 2001-08-09 2004-05-04 주식회사 한국메디 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 ｋｍ112 균주 및 그를이용한 항진균성 조성물
KR100472376B1 (ko) * 2002-05-24 2005-03-08 주식회사 백광소재 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ) ＬＸ 9 (ＫＣＴＣ 18100Ｐ) 및 그 배양방법
KR100807403B1 (ko) * 2006-07-26 2008-02-28 동아대학교 산학협력단 식물 잿빛 곰팡이병 방제용 바실러스 아밀로리퀘페이션스ｌｐ03 균주 및 이를 이용한 미생물 제제의 제조방법
KR100868901B1 (ko) * 2007-04-25 2008-11-14 동아대학교 산학협력단 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 및 이를 함유하는 제제
KR100919892B1 (ko) * 2007-12-27 2009-10-01 조선대학교산학협력단 메주로부터 분리된 바실러스 서브틸리스 및 이를 포함하는항균 조성물
US20160205943A1 (en) * 2013-02-21 2016-07-21 Korea Bio Chemical Co., Ltd. Technique, Method, and Composition for Controlling Plant Pathogens

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5470827A (en) * 1993-09-30 1995-11-28 Higeta Shoyu Co., Ltd. Method of producing iturin A and antifungal agent for profound mycosis
JPH11163A (ja) * 1997-06-13 1999-01-06 Asada Shoji Kk 熱安定性抗生物質を産生する耐熱性バチルス、その産生物質を有効成分とする芝草病害発生抑制剤および植物活性剤
KR19990078942A (ko) * 1999-08-23 1999-11-05 조정일 식물병해 길항 미생물 제제
KR20000045843A (ko) * 1998-12-30 2000-07-25 이기성 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 미생물, 이를 함유하는 항진균성 미생물 농약제및 그의 제조방법
KR20000063185A (ko) * 2000-04-25 2000-11-06 조정일 길항미생물 씨피220에 의한 아플라톡신 생성 억제 방법 및이를 응용한 콩 발효식품과 동물 사료

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5470827A (en) * 1993-09-30 1995-11-28 Higeta Shoyu Co., Ltd. Method of producing iturin A and antifungal agent for profound mycosis
JPH11163A (ja) * 1997-06-13 1999-01-06 Asada Shoji Kk 熱安定性抗生物質を産生する耐熱性バチルス、その産生物質を有効成分とする芝草病害発生抑制剤および植物活性剤
KR20000045843A (ko) * 1998-12-30 2000-07-25 이기성 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 미생물, 이를 함유하는 항진균성 미생물 농약제및 그의 제조방법
KR19990078942A (ko) * 1999-08-23 1999-11-05 조정일 식물병해 길항 미생물 제제
KR20000063185A (ko) * 2000-04-25 2000-11-06 조정일 길항미생물 씨피220에 의한 아플라톡신 생성 억제 방법 및이를 응용한 콩 발효식품과 동물 사료

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biol Control 1996 Aug;7(1):30-7, Mari M *
Korean journal of turfgrass science Vol.11(3) pp.173-183, 1997, 심규열 *
Plant pathology journal Vol.15(3) pp.162-167, 1999, Seon Hee Park *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008111719A1 (en) * 2007-03-13 2008-09-18 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Bacillus amyloliquefaciens k317 for suppressing the growth of antibiotics-resistant pathogenic microorganism or enteropathogenic microorganism
KR100878799B1 (ko) 2007-03-13 2009-01-14 한국생명공학연구원 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의생장을 억제하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 ｋ317
KR101066877B1 (ko) 2008-09-11 2011-09-26 목포대학교산학협력단 지력증진을 통한 참다래병의 생물학적 방제를 위한 발효퇴비

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