CN112143674B - 一种桔黄假单胞菌cm-9及其应用 - Google Patents

一种桔黄假单胞菌cm-9及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桔黄假单胞菌及其应用。本发明的桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM‑9 CGMCC No.18905能够明显抑制栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)和/或墨水病菌(Phytophthora cinnamon)菌丝的生长具有高效的抑制作用。桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM‑9 CGMCC No.18905培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

一种桔黄假单胞菌CM-9及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种桔黄假单胞菌及其应用。
背景技术
我国是一个农业大国，粮食、果蔬产量和质量关乎民生和社会稳定。全世界因为植物病害所造成的主要农作物的经济损失达数千亿美元，而病害中的70％-80％都是由病原真菌导致的，如导致板栗疫病的病原真菌为栗疫病菌。
栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)属于子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordariomycetes)间座壳目(Diaporthales)隐丛壳科(Cryphonectriaceae),可寄生于欧洲板栗、美洲板栗、板栗、日本板栗、锥栗和其它栎类。板栗苗木和结果树都可以受到栗疫病菌的侵染，发病后病斑迅速包围枝、干，导致栗实产量和质量都明显降低，严重时造成整个枝条或全株枯死。栗疫病菌已成为危害板栗最严重的病菌。墨水病菌(Phytophthoracinnamon，樟疫霉菌)，属于不等鞭毛门(Heterokontophyta)卵菌纲(Oomycota)霜霉目(Peronosporales)霜霉科(Peronosporaceae)，疫霉属(Phytophthora),其产生的感染会引起植物“根腐病”或“枯萎病”。植物病原体是世界上最具侵入性的物种之一，并且存在于世界各地的70多个国家中。植物的顶梢枯死就是指致命的樟疫霉菌(Phytophthoracinnamomi)进入植物体导致的植物疾病。
目前，提高栗疫病和/或墨水病抗性的主要方法是通过传统育种的方式，包括通过用美洲栗或欧洲栗与具有抗性的中国栗和日本栗进行杂交培育抗病的品种。另外，对栗疫病菌和/或墨水病菌的主要防治方法为农业防治、生物防治、化学防治和综合防治。在意大利和法国发现了含有dsRNA的弱毒力菌株，能有效控制栗疫病菌带来的危害；部分生物制剂也能起到抑制作用；另外多菌灵、杀菌剂等化学药品也能起到一定效果。
假单胞菌(Pseudomonas)是一类需氧的革兰氏阴性细菌，该属微生物具有极其丰富的代谢多样性，这些多样性也使得它们能够在非常广阔的生态位中生存。自上世纪中期，假单胞菌属中的某些物种就开始被用来抑制作物致病菌的生长或定殖。这种应用通常称作生物防治。作为生物防治的试剂应用和研究，荧光假单胞菌和Pseudomonas protegens的菌株(如CHAO或Pf-5)的生物防治特性是目前研究最为透彻的。桔黄假单胞菌(Pseudomonasaurantiaca)曾被归属于绿针假单胞菌，产生di-2,4-diacetylfluoroglucylmethan是一种抑制革兰氏阳性细菌的抗生素类物质。假单胞菌含有的微生物资源可创造巨大价值，它的生物多样性非常丰富，也是产生生物活性物质最多的微生物种类之一。但目前对桔黄假单胞菌生防活性和生防制剂的研究较少，CN201010247536.5公开了一种促进植物生长的桔黄假单胞菌种及其培养方法，具体公开了桔黄假单胞菌种可促进植物生长，并进一步公开了其在防治油菜、水稻、小麦、蕃茄、玉米病害中的应用。CN201110299609.X公开了一种植物根际促生菌桔黄假单胞菌菌剂的制备方法，通过该方法制得的桔黄假单胞菌菌剂用于制备微生物肥料，可降低植株发病率，促进作物生长；通过离体叶片实验，桔黄假单胞菌活体微生物肥料能够显著抑制植物病原菌，增强植株抵抗植物病原的能力，起到预防和防治植物病原菌的效果。CN201210452050.4公开了一种桔黄假单细胞菌微生物农药及其制备方法，以硅藻土为载体，将桔黄假单细胞菌JD37菌株经培养获得菌体，加入助剂羧甲基纤维素溶液，与经处理的硅藻土混合均匀，得桔黄假单细胞菌微生物农药，该生物农药可能够增强植株对病原真菌的防御能力，降低其发病率。
综上，至今没有利用桔黄假单胞菌产生活性物质抑制板栗疾病的相关报道，尤其针对栗疫病菌和/或墨水病菌的生物防治的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何防治栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)和/或墨水病菌(Phytophthora cinnamon)及其引起的板栗疾病。
本发明所要解决的另一个技术问题是如何防治其他常见和重要的土传病害真菌和卵菌病原菌引起的植物病害，包括：真菌Botrytis cinerea(灰葡萄孢菌引发灰霉病)、Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌引发枯萎病)、Verticillium dahliae(大丽轮枝菌引发黄萎病)和卵菌Phytophthora infestans(致病疫霉引发晚疫病)。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种桔黄假单胞菌株。
本发明所提供的是桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.18905。该菌种已于2019年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
本发明所提供的是桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905在多种培养基上均可快速生长，包括TSA,KB和PDA，菌株生长速度快，形成的菌株群落成橙黄色。本发明所提供的桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)的易培养，快速生长等属性为其生防应用提供了便利条件，为开发本发明所述的桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9的天然活性产物提供了充足的物质材料。
本发明所提供的栗疫病菌抑制剂，其活性成分是所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905或/和桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905的代谢物。
上述栗疫病菌抑制剂中，所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905包括活体细胞和/或其胞外分泌的活性代谢物质。
上述栗疫病菌抑制剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述栗疫病菌抑制剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述栗疫病菌抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述栗疫病菌抑制剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
本发明还提供了制备所述栗疫病菌和/或墨水病菌抑制剂的方法。
本发明所提供的制备所述栗疫病菌和/或墨水病菌抑制剂的方法，包括在KB培养基中培养所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9CGMCC No.18905，收集发酵液，得到栗疫病菌和/或墨水病菌抑制剂。
本发明还提供了下述1)-4)中任一种应用：
1)所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9CGMCC No.18905包括活体细胞和/或其胞外分泌的活性代谢物在抑制栗疫病菌和/或墨水病菌中的应用；
2)所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9CGMCC No.18905包括活体细胞和/或其胞外分泌的活性代谢物在制备栗疫病菌和/或墨水病菌抑制剂中的应用；
3)所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9CGMCC No.18905包括活体细胞和/或其胞外分泌的活性代谢物在制备栗疫病菌和/或墨水病菌引起的植物病害抑制剂中的应用；
4)所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9CGMCC No.18905包括活体细胞和/或其胞外分泌的活性代谢物在抑制栗疫病菌和/或墨水病菌引起的植物病害中的应用。
所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9CGMCC No.18905的代谢物可从所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905的发酵液中获得。所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonaschlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905，除去液体培养物(发酵液)中的所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCCNo.18905的细胞即得到所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905的代谢物。
上述应用中，所述植物病害为板栗疫病和板栗墨水病。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了培养所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonaschlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905的方法。
本发明所提供的培养所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905的方法，包括将所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905在用于培养桔黄假单胞菌的培养基中培养的步骤。
上述培养所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905的方法，可包括在液体培养基中培养所述桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905的步骤；所述液体培养基具体可为液体发酵培养基:TSA培养基、KB培养基和PDA培养基等；所述培养温度可为26-30℃，具体可为28℃；所述培养时间为1-3天，具体为2天。
实验证明，本发明的桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905能够明显抑制栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)和/或墨水病菌(Phytophthora cinnamon)菌丝的生长具有高效的抑制作用。桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
本发明的有益技术效果：
1.本发明首次发现一种桔黄假单胞菌株，其所产生的活性物质可抑制板栗疾病，尤其针对栗疫病菌和/或墨水病菌的生物防治。
2.基因组中的新的功能基因以及其新天然活性代谢物质有重要的应用价值。本发明成功的从板栗树根际的土壤中筛选出桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905，且通过基因组相似度比较分析，该菌株与桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)的基因组相似度最高(69.26％)，因此，本发明提供的桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905可作为研究发现的新假单胞菌株。
3.通过体外培养基上的对峙实验筛选可以抑制栗疫病菌真菌病原菌Cryphonectria parasitica和/或墨水病菌卵菌病原菌Phytophthora cinnamon的根际细菌菌株。对峙实验结果显示桔黄假单胞菌株CM-9同时对两种病原菌均有很强的生长抑制作用。
4.为了进一步验证桔黄假单胞菌株CM-9的广谱抑菌性能，以土传病害防控为重点，对峙实验扩展选择了多种常见和重要的土传病害真菌和卵菌病原菌进行测试，包括：真菌Botrytis cinerea(灰葡萄孢菌引发灰霉病)、Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌引发枯萎病)、Verticillium dahliae(大丽轮枝菌引发黄萎病)和卵菌Phytophthora infestans(致病疫霉引发晚疫病)。结果显示所获得的桔黄假单胞菌株CM-9对所选择的病原菌生长有广谱的生长抑制作用。
保藏说明
菌种名称：桔黄假单胞菌
拉丁名：Pseudomonas sp.
菌株编号：CM-9
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2019年11月5日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18905
附图说明
图1：本发明的生防细菌与真菌病原菌Cryphonectria parasitica和卵菌病原菌Phytophthora cinnamon的对峙实验对比图；
图2：本发明的生防细菌与真菌病原菌Verticillium dahliae、Fusariumoxysporum、Botrytis cinerea和卵菌病原菌Phytophthora infestans的对峙实验对比图；
图3本发明的生防细菌与对照桔黄假单胞菌株(DSM19603)的对峙实验对比图；
图4：假单胞杆菌基因组分析图；
图5：不同板栗树龄的细菌群落的差异性分析；
图6：板栗树核心菌群的丰度分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)和/或墨水病菌(Phytophthora cinnamon)均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的培养基如下：
TSA培养基：15g胰酪蛋白胨，5.0g大豆蛋白胨，5.0g NaCl，15g琼脂粉，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
PDA培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
KB培养基：20.0g蛋白胨,10.0ml甘油,1.5g K2HPO4,1.5g MgSO4.7H2O,15g琼脂，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
实施例1
桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCCNo.18905的分离及鉴定
1、桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCCNo.18905的分离
采集北京怀柔板栗园板栗树根际的土壤样品，采用梯度稀释平板法，获取各菌株单菌落，试管保存并进行分子生物学鉴定，筛选得到桔黄假单胞菌株(Pseudomonaschlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905。
2、桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCCNo.18905的鉴定
(1)形态学鉴定
桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCCNo.18905菌体为杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动。在KB培养基上培养24小时后可形成菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。
(2)分子鉴定
使用KB培养基活化桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905，从菌落中挑取菌株细胞在KB培养液中震荡培养24小时(转速：220rpm)，收集菌株细胞于无菌离心管中，采用细菌DNA提取试剂盒的方法操作，提取桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCCNo.18905的基因组DNA，作为PCR反应的模板。以16S rDNA通用引物为扩增引物，其中正向引物63F：5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’和反向引物1389R5’-ACGGGCGGTGTGTACAAG-3’。
50μL PCR反应体系包括模板DNA 1μL，正向引物P1 2μL，反向引物P6 2μL，2×TaqPCR MasterMix 25μL，ddH2O 20μL。
PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环扩增，最后72℃延伸10min，4℃保存。
将桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCCNo.18905菌株的16S rDNA序列的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到约1470bp的DNA片段，测序后，利用Geneious 8.1.9软件进行与数据库中已知的相关序列进行在线比对。
桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCCNo.18905的基因组DNA同时进行了基因组重测序。通过使用SPAdes v.3.9.0进行了全基因组序列的拼装和在线于其他已知假单胞菌株基因组的比较分析，利用生物信息工具ModelFinder包含IQ-TREE构建系统发育树(图4)，通过Python ETE3 library进行注释和生成展示。桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCCNo.18905与桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)的基因组相似度最高(69.26％)，而菌株CM6-8的基因组序列与参考桔黄假单胞菌株基因组相似度分别为69.32％，67.86％,68.72％。因此，本发明提供的假单胞菌株鉴定为桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)，结果同时证明本发明提供的桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905可作为研究发现的新假单胞菌株。基因组中的新的功能基因以及其新天然活性代谢物质有重要的应用价值。此外，菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca DSM19603)是可以找到的DSMZ唯一这个亚种的菌株，基因组信息也是以这个菌株的基因组为参考。
实验一
桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCCNo.18905菌株的滤液对栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)和/或墨水病菌(Phytophthora cinnamon)抑制作用的影响
实验方法：将桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)CM-9 CGMCC No.18905(下文简称CM-9菌株)接种于10mL液体培养基培养基中，在28℃，转速为220rpm条件下振荡培养2天，获得CM-9菌株的悬浮液。然后将CM-9菌液在4000rpm条件下离心5min，倒掉上清液，使用0.9％氯化钠容液重悬用来洗脱培养基，重复2－3次。调节菌液浓度为大概109个细胞每毫升(OD600＝1.0)。
采用PDA平板活化栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)和/或墨水病菌(Phytophthora cinnamon)，用直径5mm的打孔器获得活化后的栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)和/或墨水病菌(Phytophthora cinnamon)的菌饼。取2ul CM-9菌株菌液滴在距离PDA培养基边缘1cm的圆周上，将病原菌菌饼菌丝向下置于PDA培养基中心，观测病原菌生长情况。测试均设有至少3个重复。空白对照为PDA培养基，当病原菌株菌丝在对照的PDA培养基上刚好覆盖整个表面时，测量所有培养基平板上病原菌菌丝长度，进行定量分析，计算出抑菌率。
其中，抑菌率＝[(对照真菌生长半径-处理真菌生长半径)/对照真菌生长半径]×100％。
表1桔黄假单胞菌株与栗疫病菌的对峙实验结果
Figure GDA0002947682390000091
表2桔黄假单胞菌株与墨水病菌的对峙实验结果
Figure GDA0002947682390000092
实验结果：
由表1桔黄假单胞菌株CM-9与栗疫病菌的对峙实验共进行了三次，结果看出，桔黄假单胞菌株对栗疫病菌的抑制作用明显，抑制率最低为63.56％，最高为72.15％。可见，桔黄假单胞菌株CM-9对栗疫病菌有明显的拮抗作用，可作为生防菌株应用。
由表2桔黄假单胞菌株CM-9与墨水病菌的对峙实验共进行了三次，结果看出，桔黄假单胞菌株对墨水病菌的抑制作用明显，抑制率最低为78.06％，最高为83.47％。可见，桔黄假单胞菌株CM-9对墨水病菌有明显的拮抗作用，可作为生防菌株应用。
由图1的桔黄假单胞菌株CM-9与栗疫病菌真菌病原菌Cryphonectria parasitica和/或墨水病菌卵菌病原菌Phytophthora cinnamon的对峙实验对比图可看出，桔黄假单胞菌株CM-9对两种病原菌均有很强的生长抑制作用，且抑制效果明显优于对照组。为了进一步挖掘所获得菌株的应用范围，以土传病害防控为重点，对峙实验扩展选择了多种常见和重要的土传病害真菌和卵菌病原菌进行测试，包括：真菌Botrytis cinerea(灰葡萄孢菌引发灰霉病)、Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌引发枯萎病)、Verticillium dahliae(大丽轮枝菌引发黄萎病)和卵菌Phytophthora infestans(致病疫霉引发晚疫病)。结果显示所获得的桔黄假单胞菌株CM-9对上述所选择的病原菌生长均有广谱的生长抑制作用，如图2，且抑制效果明显优于对照组。这4株桔黄假单胞菌与P.protegens CHA0和P.protegens Pf-5两种著名的具有抗真菌活性的生物防治剂关系密切。我们进一步发现了这些菌株表现出广谱的抗真菌和抗卵菌活性的原因，通过进行基因组学分析比较发现，它们的基因组中有一个巴南酰胺生物合成基因簇BGC和一个吡咯烷腈类BGC。巴南酰胺是脂环肽，先前在另外2个假单胞菌菌株中被鉴定，纯化的巴南酰胺对某些真菌有拮抗作用，吡咯烷腈是几种具有较强抗真菌活性的假单胞菌产生的次生代谢产物。
实验二
实验方法：
本实验主要研究本发明的桔黄假单胞菌生防细菌与对照桔黄假单胞菌株(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca DSM19603)的对峙实验对比，将选择测试的桔黄假单胞菌株CM-6到9以及参考菌株接种于10mL液体培养基培养基中，在28℃，转速为220rpm条件下振荡培养2天，获得菌株的悬浮液。然后将菌液在4000rpm条件下离心5min，倒掉上清液，用无菌水重悬菌株细胞。反复两次以洗脱培养液。无菌水重悬菌液，通过测量OD600吸光值鉴定菌液细胞浓度，调节至OD600＝1.0(大概109个细胞/毫升菌液)。采用PDA平板活化栗疫病菌和墨水病菌，用直径5mm的打孔器获得活化后的栗疫病菌和墨水病菌的菌饼。取2ul参考菌株和CM-6到9菌株的菌液，在距离1/5 PDA培养基边缘1cm的圆周上均匀接种，将病原菌菌饼菌丝向下置于1/5 PDA培养基中心。在28℃静止培养，观测病原菌生长情况。测试均设有至少3个重复。空白对照为1/5 PDA培养基，当病原菌株菌丝在对照的1/5PDA培养基上刚好覆盖整个表面时，测量所有培养基平板上病原菌菌丝边缘到细菌克隆边缘的距离，进行定量分析，计算和比较测试菌株与参考菌株对病原菌生长抑制强度差异。其中，参考菌株六个重复，测试菌株三个重复。
实验结果：
表3本发明的桔黄假单胞菌株CM6-CM9和对照桔黄假单胞菌株(DSM19603)分别与栗疫病菌、墨水病菌的对峙实验，结果看出，本发明的桔黄假单胞菌株对墨水病菌的抑制作用明显，本发明的桔黄假单胞菌株CM-9对疫病菌、墨水病菌均有明显的拮抗作用，可作为生防菌株应用。
由图3本发明桔黄假单胞菌株CM-9与栗疫病菌真菌病原菌Cryphonectriaparasitica和/或墨水病菌卵菌病原菌Phytophthora cinnamon的对峙实验对比图可看出，桔黄假单胞菌株CM-9对两种病原菌均有很强的生长抑制作用，且抑制效果明显优于对照组。
表3本发明桔黄假单胞菌株与对照菌株的对峙实验结果
Figure GDA0002947682390000111
实验三
板栗树核心微生物群的表征与鉴定
实验方法：位于中国北京始建于明代的板栗园，以几十年到几百年不等的板栗树土壤作为实验材料，从每棵树周围，20-30厘米深的地方，移除表层土壤，在树冠边缘的正下方取样。土壤在相似的位置和深度收集，但在没有板栗根的地方。样本收集重复4次。对其微生物群里多样性、丰度分布进行统计分析。
见图5，a 2016年，对一棵幼树(约10年生)和3棵老树(372年、440年和620年)进行了采样。B 2017年取样3棵幼树(8年、10年和20年)和6棵老树(372年、440年、505年、580年、620年和830年)。C 2016年和2017年对采样的树木进行OTU分布。绘制了与土壤(SO)、根际(RH)和内生隔室(EC)相关的细菌门的相对序列丰度。研究了细菌群落的差异性(BrayCurtis)与各隔室(SO、RH和EC)的树龄差异之间的关系。每个点表示两个样本(Y轴)的Bray-Curtis相异值(X轴，Δyears)。通过检验树龄差异与相关Bray-Curtis距离之间的线性关系，添加回归线。黑色十字叉突出表示了布雷-柯蒂斯在特定树龄差异方面的平均值。
见图6，2016年采集的栗树土壤、根际和EC的核心菌群绘制在条形图(a-c)中。从每个组分中筛选出前10个高丰度的OTU，形成核心菌群。黄色：核心土壤细菌微生物群含有20个OTU；绿色：核心根际细菌微生物群含有19个OTU。蓝色：核心EC菌群包含22个OTU；条形高度表示每个OTU相对丰度的平均值。误差条表示复制的标准偏差。我们还用核心菌群比较了每个隔室的微生物群。这是通过选择每棵树的土壤、根际和EC的前10个OTU(基于相对丰度)来创建的。
实验结果：
对这3个分区2016年的核心微生物群进行比较，发现这些微生物在幼树和老树中非常相似(图6a-c)。值得注意的是，假单胞菌(OTU1)在所有树木的根际极为丰富(高达50％，图6b)，而缓生根瘤菌(OTU12)在EC中始终高度丰富(超过5％，图6c)。对于2017年的试验，进行了相同的核心微生物组比较，土壤和根室中的高丰度OTU也非常丰富在幼树和老树上相似。假单胞菌OTU1在根际再次非常丰富，尽管相对丰度低于2016年。根据玉米根际微生物群落分析，假单胞菌属的相对丰度可随季节和年份而变化。在这项研究中，由于这些树木的树龄在8到800年以上，表明它们的核心根微生物群的组成与年龄无关。
我们的研究表明，8-800年生栗树的根系微生物群落相当相似。这有力地表明板栗能够避免土壤的负反馈，这有助于板栗的长寿。在本研究中，我们发现单一的假单胞菌OTU在板栗根际中非常丰富。如此丰富的数量表明对其宿主有益。这种OTU具有强烈而广泛的拮抗活性，其中一个成员可以刺激拟南芥(异源)的生长。这两种特性都有助于板栗的长寿。
可见，本发明筛选出的有益板栗树生长的桔黄假单胞菌菌株及其组成的核心根微生物群落是利于板栗树长期生长的菌群。这种寿命依赖于基因组，树木的寿命似乎与防御相关基因数量的增加呈正相关，植物-土壤的负反馈导致寿命短。除了防御相关基因外，植物的微生物群对其生长和健康也很重要。通过我们多年的研究，测试百年古树板栗树的微生物群落，反映出没有这种负的植物-土壤反馈，以及它们的根系土壤中含有对板栗树主要病原菌具有拮抗活性的微生物，即本发明筛选出的菌株。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (13)

1.一种桔黄假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）菌株CM-9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.18905。
2.权利要求1所述的菌株CM-9在生产生防菌剂中的应用。
3.栗疫病菌和/或墨水病菌抑制剂，其特征在于：其活性成分是权利要求1所述的菌株CM-9。
4.制备权利要求3所述栗疫病菌和/或墨水病菌抑制剂的方法，其特征在于：包括在KB培养基中培养权利要求1所述的菌株CM-9，收集发酵液，得到栗疫病菌和/或墨水病菌抑制剂。
5.权利要求1所述菌株CM-9在抑制栗疫病菌和/或墨水病菌中的应用。
6.权利要求1所述菌株CM-9在制备栗疫病菌和/或墨水病菌抑制剂中的应用。
7.权利要求1所述菌株CM-9在制备栗疫病菌和/或墨水病菌引起的植物病害抑制剂中的应用。
8.权利要求1所述菌株CM-9在抑制栗疫病菌和/或墨水病菌引起的植物病害中的应用。
9.权利要求1所述菌株CM-9在抑制灰葡萄孢菌Botrytis cinerea中的应用。
10.权利要求1所述菌株CM-9在抑制尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum中的应用。
11.权利要求1所述菌株CM-9在抑制大丽轮枝菌Verticillium dahliae中的应用。
12.权利要求1所述菌株CM-9在抑制致病疫霉Phytophthora infestans中的应用。
13.一种利用权利要求2所述的生防菌剂降低植物病原体所致的植物病理损伤的方法，其特征在于：使植物叶片、根、茎、芽、种子或植物生长栽培基质与所述生防菌剂接触。
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