CN102199558A - 桔黄假单胞菌的培育方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术，一种桔黄假单胞菌的培育方法及应用。现有技术发现桔黄假单胞菌对多种植物致病菌有抑制作用，但是桔黄假单胞菌在自然界中存在数量少，繁殖速度慢，无法满足植物防治病害、促进植物生长的需要。本发明桔黄假单胞菌的培育方法，步骤如下：试样采集；制备培养基；选择和确定抗生素和供试病原真菌；菌种初筛和复筛；将复筛选出的菌种发酵繁殖。将桔黄假单胞菌在防治油菜、水稻、小麦、蕃茄、玉米病害中应用。本发明的优点是：具有高效抑菌活性，防治植物病害效果显著；人畜安全、无毒；促进农作物生长；繁殖容易；使用简便。

Description

桔黄假单胞菌的培育方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术，具体地说是一种桔黄假单胞菌的培育方法及应用。

背景技术

植物病害造成农作物品质变差、产量下降，给农业生产和食品安全带来了巨大的经济损失和安全隐患。现有技术植物病害的防治方法主要是利用农药的化学防治。化学药剂具有防治速度快、效果好、杀虫抗菌谱广、成本低、使用简单的优点。现有的化学防治缺点是：长期使用破坏生态平衡、造成次要病害猖獗、药剂残留导致环境污染等问题。

植物病害的生物防治是利用对植物无害或有益的生物来影响或抑制病原物的生存和活动，减少病害的发生或降低病害的发展速率的方法。生物防治不仅有效地控制了农作物病害，又促进了农业的可持续发展，是一种保护生态环境、提高农作物产量和品质的好方法。假单胞菌是一种植物根际促生菌(Plant Growth-promoting Rhizobacteria，PGPR)，能够通过多种方式促进植物生长，同时分泌抗病物质抑制土壤中植物病原菌繁殖，控制植物病害发生。

现有技术发现桔黄假单胞菌对多种植物致病菌有抑制作用(Rosas BS等，Phyton-Revista Internacional de Botanica Experimental，2001，67：203-209)；Rosas和Rovera等人(Carlier E，Rovera M等World JMicrobiol Biotechnol，2008，24：2653-2658)研究发现，桔黄假单胞菌SR1通过产生铁载体、拮抗蛋白、氢氰酸(HCN)、植物激素类似物等来抑制植物病原菌、促进植物的生长。Feklistova和Maksimova(Feklistova IN等，Bulletin of BSU，chemistry，biology，Geography，2005，2：29-31)发现，桔黄假单胞菌还能合成吩嗪类物质(phenazines)起到生物防治的作用。现有桔黄假单胞菌的缺点是：桔黄假单胞菌自然界中存在数量少，繁殖速度慢，无法满足植物防治病害、促进植物生长的需要，无法满足农业生产中减轻作物病害、提高作物产量的需要。所以发明一种对人畜无毒、生态环境友好、对多种植物病原菌有良好防治效果，并能促进植物生长的桔黄假单胞菌新菌种对于保护环境、促进植物生长和农业发展有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种对人畜无毒、生态环境友好、对多种植物病原菌有良好防治效果，并能促进植物生长的桔黄假单胞菌种。

本发明的另一目的是提供桔黄假单胞菌在防治油菜、水稻、小麦、蕃茄、玉米病害中的应用。

本发明的目的是这样实现的：

桔黄假单胞菌的培育方法，步骤如下：

(1)试样采集：从上海市嘉定区红薯作物的根际土壤，深度5cm-15cm，采集土样，风干，贮存于塑料袋中，置于冰箱4℃保存备用；

(2)制备培养基：

①KB液体富集培养基：蛋白胨20g、甘油10mL、K₂HPO₄ 1.5g、MgSO₄·7H₂O 1.5g、去离子水1L，混合静置；

②固体富集培养基：蛋白胨20g、甘油10mL、K₂HPO₄ 1.5g、MgSO₄·7H₂O1.5g、去离子水1L、琼脂18g，混合静置；

③斜面保藏培养基：蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母膏5g、琼脂18g、去离子水1L，混合静置；

④真菌培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、去离子水水1L，混合静置；

⑤固体真菌培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂38g、去离子水水1L，混合静置；

(3)抗生素和供试病原真菌：

①抗生素：氨苄青霉素贮存浓度50mg/mL，氯霉素贮存浓度34mg/mL；

②供试病原真菌：油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、玉米小斑病菌Bipolaris maydis；

(4)菌种筛选：

①菌株分离、纯化与保存：

将采集试样放入含有氨苄青霉素40μg/mL与氯霉素13μg/mL的1/3KB液体富集培养基培养6-8小时；

将富集好的菌液在含有氨苄青霉素40μg/mL与氯霉素13μg/mL的KB固体培养基上，梯度稀释、平板涂布；将涂布好的KB平板置于28℃培养箱中培养2-3天，挑取单菌落接至新鲜固体培养基上，分离纯化4-6代后保藏于斜面培养基，备用；

②供试菌株平板对峙生长法初筛：

以油菜菌核病菌为指示菌，将分离到的细菌菌株采用平板对峙生长法进行拮抗性筛选；在内径90mm的PDA平板中央接种直径为8mm的油菜菌核病菌菌饼；同时在距菌饼相距25mm的4个角处分别点接4个分离纯化后待测的细菌菌株；对照平板接种病原真菌菌饼，重复试验3次；

将做好的平板置于25℃培养，3-5d内观察待测菌株对油菜菌核病菌的拮抗作用，选择对病原真菌有抑制作用的菌株进行复筛；

③拮抗菌株的复筛：

在病原真菌菌饼两侧距离30mm的位置点接同一个菌株，选取拮抗菌株菌落边缘到病原真菌菌落边缘距离大、抑菌宽带、拮抗作用持久的菌株，备用；

(5)将上述复筛选出的菌种发酵繁殖，方法为：

①制备培养基：蛋白胨2g，葡萄糖12g，酵母膏15g，水1L；

②培养基起始pH7.0；

③将菌种接种到培养基，接种量3％；

④培养基温度25℃；

⑤摇瓶转速200r/min，培养时间60h。

桔黄假单胞菌在防治油菜、水稻、小麦、蕃茄、玉米病害中的应用。

本发明的主要内容是：

提供了一种对供试病原真菌具有显著拮抗作用的桔黄假单胞菌，命名为JD37，在GeneBank中的登录号为GQ358919。

本发明还提供了桔黄假单胞菌在油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、番茄灰霉病菌的植物病害中的应用。

鉴于假单胞菌作为生物防治菌的诸多优势，本发明以假单胞菌为拮抗试验的对象，从上海市郊农作物根际土壤中共分离纯化得到276株细菌，利用平板对峙法筛选出1株对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)具有强拮抗作用的菌株，命名为JD37。

JD37能够抑制病原真菌的生长，对病原菌产生的菌核也有一定的抑制效果。经过形态学观察、生理生化特征以及16S rDNA的同源性分析，初步鉴定该菌株为桔黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)，该菌株的16S rDNA序列已在GenBank中注册，登录号为GQ358919。

本发明采用单因素实验和正交试验对具抑菌活性的桔黄假单胞菌JD37(Pseudomonas aurantiaca JD37)发酵培养基和发酵条件进行优化选择。确定最佳发酵培养基为：蛋白胨2g，葡萄糖12g，酵母膏15g，水1L。确定最佳发酵条件：培养温度25℃，起始pH7.0，接种量3％，装瓶量150mL/500mL，摇瓶转速200r/min条件下培养60h。本发明结果为大规模的发酵提供了有价值的数据。

桔黄假单胞菌产生的抑菌物质主要存在于发酵液中，Ph1D，phzCD，PrnC基因分别是2，4-DAPG，PCA，Prn合成所必须的，同时也可以作为产此种抗生素的分子标记^{[93，92，96]}。通过PCR检测，在JD37中扩增得到的PrnC与phzCD的基因片段，与NCBI数据库中相应的抗生素合成基因簇的基因片段具有较高的同源性，最高达到98％。

根据二氯甲烷萃取液的紫外吸收光谱的全波段扫描，发现最大吸收峰出现在250nm附近，因此选择紫外检测波长254nm进行HPLC分析。结果在色谱图上发现4个波峰，其中峰1的主吸收峰在255nm左右，峰2的主吸收峰在255nm，还有一个接近370nm的副峰，在低波段有较高的峰值，故推测：该制备样品中有两种主成分物质峰1与峰2，且这两种物质的紫外波峰与PCA和Prn的波峰较为相似。因此判断：桔黄假单胞菌JD37能够产生抗生素吩嗪-1-羧酸PCA和硝吡咯菌素Prn。

本发明提供了测定菌株发酵上清液中抑菌物质的方法，具体方法为抑菌物质合成相关基因的基因克隆与分析，C18反相高效液相色谱RP-HPLC检测抑菌物质。

本发明提供了制备菌剂的方法，将其施用到植物根部，观察其对植物的促进生长作用。

本发明还提供了一种控制或抑制植物病原真菌生长的方法，具体方法为将发酵培养28h的JD37菌液稀释60倍，含菌量为1.2×10⁸CFU/mL后和病原真菌先后施用到玉米和小麦植物叶片上，观察菌株对植株的生物防治效果。

本发明的优点是：

1、具有高效抑菌活性，防治植物病害效果显著。

2、人畜安全、无毒。

3、促进农作物生长。

4、发酵繁殖容易。

5、使用简便。

附图说明

图1为本发明桔黄假单胞菌在KB培养基上的形态图；

图2为本发明桔黄假单胞菌的电镜照片图；

图3为本发明桔黄假单胞菌的总DNA电泳图；M：Lamda DNA/Hind IIIMarker；1，2：JD37菌株

图4为本发明16srDNA电泳图；M：DL2000Marker；1，2：JD37菌株16srDNA；

图5为本发明菌株与相关菌株的系统发育树；

图6为本发明菌株对植物病原真菌的抑菌效果图；

其中：1为对番茄灰霉病菌的抑制效果；2为对小麦赤霉病菌的抑制效果；3为对水稻纹枯病菌的抑制效果；4为对玉米小斑病菌的抑制效果；5为对油菜菌核病菌的抑制效果；6为对油菜菌核病菌菌核的抑制效果。

图7为JD37合成抗生素相关基因检测电泳图；M：DL2000DNA Marker，其中：1：phzCD扩增产物；2：PrnC扩增产物；

图8为纯化后的样品高效液相色谱图(UV波长：254nm)；

图9为制备样品的高效液相色谱图(UV波长：254nm)；1：Prn的波峰；2：PCA的波峰；3，4：杂质波峰；

图10为Prn紫外吸收光谱全波段扫描图；

图11为PCA紫外吸收光谱全波段扫描图；

图12为两种杂质紫外吸收光谱全波段扫描图；3，4：HPLC图谱中的杂质3和4。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明。

菌株的筛选：将供试土样放入1/3KB培养基，培养基中含有氨苄青霉素40μg/mL与氯霉素13μg/mL，培养6小时。将富集好的菌液在含有氨苄青霉素40μg/mL与氯霉素13μg/mL的KB固体培养基上，按照梯度稀释进行平板涂布，分离纯化得到276株菌株，作为初筛备用。以油菜菌核病菌为指示菌，将分离到的细菌菌株采用平板对峙生长法进行拮抗性筛选。在内径90mm的PDA平板中央接种直径为8mm的油菜菌核病菌菌饼，同时在距菌饼相距25mm的四个角处分别点接4个分离纯化后待测的细菌菌株。对照平板只接种病原真菌菌饼，不点接筛选菌，将做好的平板置于25℃培养，3-5d内观察抑菌圈形成，并选出有抑菌圈的48株菌株进入复筛。其中一株采自嘉定区红薯田地中的菌株JD37表现出较强的拮抗活性，经多次实验后确定该菌株长势良好、性质稳定，故用作进一步实验的菌株。

菌种的鉴定：菌落圆形微隆起，微黄色，边缘光滑，表面较湿润，易被挑起；培养48h后菌体产生桔红色色素，覆盖在菌落表面，同时菌落周围产生桔黄色色素，随着培养时间的增加，慢慢扩散至培养基中如图1所示。取一定浓度的样品进行电镜观察，菌体呈杆状，(0.3-0.5)μm×(1.0-1.4)μm，两端极生多根鞭毛，长度约为4.4μm，其电镜照片见图2。

对该菌株进行常规生理生化特征鉴定，该菌是革兰氏阴性菌，能够产生色素，但不能产生水溶性的荧光色素，最适的生长温度在26-28℃之间，葡萄糖产酸但不能产气，氧化酶反应阳性，结果见表2、表3。结合形态学的鉴定，本发明JD37菌株与假单胞菌的特征较为接近。

以基因组DNA为模板见图3，用细菌通用引物S1和S2进行PCR扩增，得到的序列片段见图4。(GenBank：GQ358919，附录一)，经BLAST比对，结果如表1所示：JD37菌株的16S rDNA序列与Pseudomonas aurantiaca VKMB-816T(AY271791)的同源性高达100％，结合上述生理生化及形态学的鉴定结果，初步判断JD37为Pseudomonas aurantiaca。选取相似度达99％的部分序列和其它假单胞菌属的序列共11条构建系统发育树，发现菌株JD37在亲缘关系上与绿针假单胞菌较为接近见图5。该菌株的16S rDNA序列已在GenBank中注册，登录号为GQ358919。

抗菌谱的测定：对复筛得到的菌株JD37进行了初步的抗菌谱测定如图6，发现该菌株对油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、番茄灰霉病菌都有比较好的拮抗性，尤其对小麦赤霉病菌和番茄灰霉病菌的拮抗效果最佳，见表2，虽然不能完全杀死病原真菌，但能起到良好的抑制作用。

JD37不仅能够抑制病原真菌菌丝体的生长，对菌核也有较好的拮抗效果，如表2中显示，油菜菌核病菌的菌核主要集中在拮抗菌的四周，且数量明显少于对照组表3，菌核形成的时间比对照组提前1-2天。

PCR检测菌株JD37的抑菌物质：以细菌的基因组DNA为模板，用引物对PCA2a、PCA3b(Raaijmakers J等Appl Environ Microbiol，1997，63：881 887)，PHL2a、PHL2b及PrnCf、PrnCr(van P ée KH等，J Antibiot(Tokyo)，1983，36(12)：173542)进行PCR扩增(表4)。

PCR反应体系(50μL)：2×Master Mix 25μL，引物各1μL，DNA模板2μL，双蒸水加至50μL，PCR程序：PCR扩增条件为：94℃5min；94℃1min，65℃0.5min，72℃1min，30个循环；72℃10min。

取2μL PCR扩增产物，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，检测扩增产物的浓度和分子量，本发明的纯化和测序工作由华大基因科技股份有限公司完成。

将测序结果输入NCBI，通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析。

实验结果如图7，在1号和2号泳道上均有一条明亮的长约750bp和1200bp的条带，与预计的序列长度一致，故可初步判断这两组条带是phzCD基因和PrnC基因。将相应的基因序列测序结果(Prn：693bp，PCA：1086bp)提交到NCBI，通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析。

在桔黄假单胞菌JD37中扩增得到的Prn合成基因簇中PrnC的基因片段，与已发表的多个菌株的PrnC具有较高的同源性，最高达98％(表5)；扩增得到的phzCD基因片段也与已知的PCA合成基因簇有着较高的同源性(表6)。因此判断：本发明桔黄假单胞菌JD37能够产生抗生素吩嗪-1-羧酸PCA和硝吡咯菌素Prn。

HPLC检测菌株JD37的抑菌物质：

1.样品制备：

在优化后的YPG液体培养基中活化JD37，把经活化的细菌培养物以1％的比例加入到新鲜的YPG液体培养基，比例150mL/500mL，25℃，200rpm振荡培养60h，然后将细菌发酵液10000rpm条件下离心15min，收集上清液，用等体积的二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发浓缩后抽干有机相，最终用1ml乙酸乙酯与甲醇的混合液重新溶解，用作HPLC检测。

2.色谱条件：

将上述萃取物混合液用0.22μm滤膜过滤后经C18反相高效液相色谱RP-HPLC检测。分析柱为AQ-C18，规格：150mm×4.6mm，5μm，流动相为甲醇∶水∶磷酸(V∶V∶V)＝65∶35∶0.1；柱温为室温，流速为1.0mL/min，二极管阵列器检测，检测波长为254nm。

取拮抗效果最好的二氯甲烷萃取液进行紫外吸收光谱的全波段扫描，发现最大吸收峰出现在250nm附近；选择常规的紫外检测波长254nm进行检测。结果如图10、图11、图12，在色谱图上发现4个波峰，分别对这4个波峰进行分析。峰1的主吸收峰在255nm左右，峰2的主吸收峰在255nm，还有一个接近370nm的副峰，全波段紫外扫描两者图谱较为相似，故推测该两种物质结构可能较为相似。峰3和峰4只有在低波段有较高的峰值，推测极有可能是杂质。

根据HPLC分析结果，我们确认该制备样品中有两种主成分物质峰1与峰2，且这两种物质的紫外波峰与PCA^[94](峰2)和Prn^[95](峰1)的波峰较为相似，这与PCR检测结果相吻合。

温室盆栽试验检测JD37菌株对玉米植株幼苗的促生作用：

用0.3％的次氯酸钠溶液对玉米种子进行表面消毒，冲洗干净后，清水浸泡2小时，取四个平皿，铺上灭菌的滤纸，分别加入稀释60、80、100、120倍，含菌量分别为1.2×10⁸、9×10⁷、7.2×10⁷、6×10⁷CFU/mL，培养28h的桔黄假单胞菌JD37发酵液40ml浸泡4h，清水对照。种子附菌后种入花盆，待幼苗长到一叶期时再用上述稀释的发酵液浇灌幼苗根部土壤，待幼苗长到五叶期时每处理随机取30株，通过测定苗高，苗鲜重，苗干重，根鲜重四项指标判断JD37菌对玉米植株的促生作用。本实验重复三次。通过表7可以看出，不同稀释度的菌液都能促进玉米幼苗的生长，其中稀释60倍的菌液(含菌量为1.2×10⁸cfu/ml)促生效果最显著。

桔黄假单胞菌JD37对玉米小斑病和小麦赤霉病的防治效果：

将玉米、小麦种子用0.3％的次氯酸钠消毒后，室温下催芽6h后种入花盆，待玉米、小麦植株长到五叶期时，将事先培养好的JD37菌稀释到1.2×10⁸cfu/ml、病原菌调整适当浓度1.0×10⁸孢子/ml。对玉米、小麦叶片进行以下处理，每次处理30片叶子，重复两次：

(1)先用清水涂抹植物叶片表面，晾干后用保鲜膜包被保湿24h后，每天一次，处理一周后再涂抹病原菌于植株叶片表面，晾干后用保鲜膜包被保湿24h，每天1次，处理1周，作为对照试验。

(2)先用病原菌涂抹于植株叶片表面，晾干后用保鲜膜包被保湿24h后，每天一次，处理一周后再涂抹JD37菌发酵液于植株叶片表面，晾干后用保鲜膜包被保湿24h，每天处理1次，处理1周。

(3)先用JD37菌发酵液涂抹于植株叶片表面，晾干后用保鲜膜包被保湿24h后，每天一次，处理一周后再涂抹病原菌于植株叶片表面，晾干后用保鲜膜包被保湿24h，每天处理1次，处理1周。

观察病斑情况，统计病情指数：

玉米小斑病情严重程度分级指标：

0：叶片没有染病；

1：病斑直径在5CM以下；

2：病斑直径在5CM≤r＜10CM；

3：病斑直径在10CM≤r＜15CM；

4：病斑面积占叶面1/2左右；

5：病斑面积占叶面2/3左右；

6：病斑面积占整个叶面，整叶枯死。

小麦赤霉病情严重程度分级指标：

0：叶片没有染病；

1：接种部位有少许病斑，直径＞6mm的病斑数不超过10个；

2：病斑侵染直径0＜r≤6cm，接种面积1/2发黄；

3：病斑侵染直径0＜r≤6cm，接种面积2/3发黄；

4：病斑侵染直径0＜r≤6cm，接种面积全部发黄；

5：病斑侵染直径6＜r＜≤11cm，接种面积全部发黄；

病情指数＝∑(各病级×各级叶片数)/(最高病级×总调查叶片数)

防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情情指数×100％

从表8、9中可以看出处理3的生防效果最好，分别达到43.63％、29.57％，因此可以推断出JD37菌的发酵液中有抑菌物质，对病原真菌的生长有抑制作用。但这种抑制作用体现在接种病原真菌前，当病原真菌已经侵入到植株叶片后，JD37防治效果不明显。

以上所述仅为本发明部分实施例，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

表1序列相似性分析表

表2 JD37菌株对5株植物病原真菌的抑菌效果

表3 JD37对油菜菌核病菌菌核的影响

表4 引物及相关PCR条件

表5 Prn序列相似性分析表

表6 PCA序列相似性分析表

表7 JD37菌对玉米幼苗的促生作用

表8 JD37菌株对玉米小斑病的防治效果

表9 JD37菌株对小麦赤霉病的防治效果

Prn合成基因簇中PrnC的部分基因片段：

CGTTCTTCAGGGACGCTCCTTATCCTCGCTGCCGTGGGGGCCGGAGAGCCATTATTACCGGCAA

GACGTCGACGCCTACCTGTTGCAAGCCGCCATCAAATACGGCTGCACGGTCCGCCAGAAGACGA

GCGTGAGCGAATACCACGCCGATAAAGACGGCGTCGCGGTGACCACCGCCCAGGGCGAACGGTT

CACCGGCCGCTACATGATCGACTGCGGAGGCCCCCGCGCGCCGCTCGCGACCCAGTTCAAGCTC

CGCGAAGAACCGTGTCGCTTCAAGACGCACTCGCGCAGCCTCTACACGCACATGCTCGGGGTCA

AACCGTTCGACGACATCTTCAAGGTCAAGGGGCAGCGTTGGCGCTGGCACGAAGGGACCTTGCA

CCACATGTTCACGGGCGGCTGGCTCTGGGTGATTCCGTTCAACAACCACCCGCGGTCGACCAAC

AACCTGGTGAGCGTCGGCCTGCAGCTCGACCCGCGTATCTACCCGAAAACGGACATCCCCGCGC

AGCAGGAATTCGACGAGTTCCTCGCGCGATTCCCGAGCATCGCGGCGCAGTTCCGGGACGCCGT

GCCGGTGCGCGACTGGGTCAAGACCGACCGCCTGCAGTTCTCGTCGAACGCCTGCGTCGGCGAT

CGCTACTGCCTGATGCTGCACGCGAACGGCTTCATCGACCGCCTTCTTTTTCA

PCA合成基因簇中PhzCD的部分基因片段：

CGGGTTGGCACCGGACGCCGTTGTCGGCGGCCCACTGGCGAATGCGCGCGGCATTGCTCA

CGACCTGTTCACGCAGGGCGTCGGGCAAGGGCCGCAGGAAGTAGCGCTGCATGTCATGCACCAG

CAGCACGGCACGCTCGGGGTCGATGCTCCATTGCGCGAGGTTGACGGGCAGGTCGCGCGAAGTA

GGCAAGACGTAGGGGACGATCGATGGAATGCCGGTCATGTCGACAAACTCCAGTCAAAAGGAGG

CAAGGGTTGAGGTGGGCTGGTTCTTCCAGGCCATCACCGCGGTAATGGCCTGCCAGGGGTTCAG

GCGCGGGTCGCACAGGCTTTTGTAGCGGCTGGCGACCTGATGCAGGCCGGCGGCATCGGAAGCG

CACTCGCTGACGTCGTCAGGGGTGGTTTCCAGGTGCAGGCCGGCGGCCACGCCACCGGCTGAGG

TCACGGCATGCTTGAAGGCGGTGATTTCCTCGGTGATGGCCTGCACCATGCGGGTCTTGTTGCC

GCAGGGCGCGACGATGGTGTTGCCGTGCATCGGGTCGCTCAGCCAGATGATCTTGTGGCCGGCC

TGGCGCACCGCTTCAACCAGCGGCGGCAGCCGATCGGCGACCTTTTGCGCGCCCATGCGGGCAA

TCAGGGTCAGCCGGCCGGGTTCGCGCTTGGAGTCCAGGCGTTCACACAGGCTCAGCAACTGGTC

CCGGGTGATGTCCGGGCCGACCTTGCACGCCACCGGATTGAGCACTTCGCTGAGCAGCGTCACG

TGAGCGCCCGTTAACTGACGGGTACGCTCGCCGATCCACGGCCAGTGGGTAGAGCCGAGAAATA

CCCGGCCCTGTTCGTCCTGGCGCAGTTGTGGCAGTTCGTAGTCGAGTACCAGCATTTCATGGCT

GGTCCAGGCCGGTGAACCGCTGAGGTGTTCCTGGCTTGCCGACGCTTTCCAGCCCAGGTGTTGC

ATGATGTCCCGCGCGGCGCTATAGCCTCGAACCAGCGTTGCGCATCGTGCTGGCGATGACCGCA

GACGGCCTCGCGACCGTTGACCATGTCGCGCGATACACCGGCAATTCGACATCGCCGATGCGTC

G

Claims (2)

1.一种桔黄假单胞菌的培育方法，步骤如下：

(1)试样采集：从上海市嘉定区红薯作物的根际土壤，深度5cm-15cm，采集土样，风干，贮存于塑料袋中，置于冰箱4℃保存备用；

(2)制备培养基：

①KB液体富集培养基：蛋白胨20g、甘油10mL、K₂HPO₄ 1.5g、MgSO₄·7H₂O 1.5g、去离子水1L，混合静置；

②固体富集培养基：蛋白胨20g、甘油10mL、K₂HPO₄ 1.5g、MgSO₄·7H₂O1.5g、去离子水1L、琼脂18g，混合静置；

③斜面保藏培养基：蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母膏5g、琼脂18g、去离子水1L，混合静置；

④真菌培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、去离子水水1L，混合静置；

⑤固体真菌培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂38g、去离子水水1L，混合静置；

(3)抗生素和供试病原真菌：

①抗生素：氨苄青霉素贮存浓度50mg/mL，氯霉素贮存浓度34mg/mL；

②供试病原真菌：油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、玉米小斑病菌Bipolaris maydis；

(4)菌种筛选：

①菌株分离、纯化与保存：

将采集试样放入含有氨苄青霉素40μg/mL与氯霉素13μg/mL的1/3KB液体富集培养基培养6-8小时；

将富集好的菌液在含有氨苄青霉素40μg/mL与氯霉素13μg/mL的KB固体培养基上，梯度稀释、平板涂布；将涂布好的KB平板置于28℃培养箱中培养2-3天，挑取单菌落接至新鲜固体培养基上，分离纯化4-6代后保藏于斜面培养基，备用；

②供试菌株平板对峙生长法初筛：

以油菜菌核病菌为指示菌，将分离到的细菌菌株采用平板对峙生长法进行拮抗性筛选；在内径90mm的PDA平板中央接种直径为8mm的油菜菌核病菌菌饼；同时在距菌饼相距25mm的4个角处分别点接4个分离纯化后待测的细菌菌株；对照平板接种病原真菌菌饼，重复试验3次；

将做好的平板置于25℃培养，3-5d内观察待测菌株对油菜菌核病菌的拮抗作用，选择对病原真菌有抑制作用的菌株进行复筛；

③拮抗菌株的复筛：

在病原真菌菌饼两侧距离30mm的位置点接同一个菌株，选取拮抗菌株菌落边缘到病原真菌菌落边缘距离大、抑菌宽带、拮抗作用持久的菌株，备用；

(5)将上述复筛选出的菌种发酵繁殖，方法为：

①制备培养基：蛋白胨2g，葡萄糖12g，酵母膏15g，水1L；

②培养基起始pH7.0；

③将菌种接种到培养基，接种量3％；

④培养基温度25℃；

⑤摇瓶转速200r/min，培养时间60h。

2.一种桔黄假单胞菌在防治油菜、水稻、小麦、蕃茄、玉米病害中的应用。

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