CN111187741A

CN111187741A - 生防假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN111187741A
Application number: CN202010107600.3A
Authority: CN
Inventors: 梁靖聆; 朱勃; 聂文翰; 王沛鸿; 吴言; 王赛; 阿衣则克然木·依明
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2040-02-21
Also published as: CN111187741B

Abstract

一种生防假单胞菌(Pseudomonas sp.)及其应用，具体为生防菌株GZ9，保藏号为CCTCC M 20191037。该菌株对灰霉菌具有显著的抑制效果，同时对辣椒疫霉、稻瘟病菌和小麦赤霉病菌表现出较好的抑制效果。该菌株发酵液对番茄灰霉病具有良好的防治效果，防效到达78.66％。因此，该菌株具有良好的生防应用前景。

Description

生防假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及的是一种生物化学领域的技术，具体是一种生防假单胞菌及其应用。

背景技术

植物病害是限制世界粮食产量的主要因素之一，每年由于植物病害所造成的粮食损失可达世界粮食产量的25％。其中，70％～80％的植物病害是由植物病原真菌引起的。目前，施用化学农药是防治植物真菌病害最主要的方式。但是长期不合理地使用化学农药，造成了农药残留、病原菌产生抗药性、生态平衡破坏等一系列问题，不仅对食品安全和生态环境造成很大影响，也严重制约农业产业发展。

植物病害的生物防治主要是利用微生物活体或其代谢产物来抑制病原菌的生长。生物防治对人畜安全，不污染环境，对植物及其他天敌无不良影响，不干扰其他防治措施，是今后病虫害综合防治的重要组成部分。

假单胞菌(Pseudomonas spp.)是植物根际最普遍的微生物类群，具有分布广、种类多、竞争定殖能力强、抗菌谱广等特点，其在生物防治与促植物生长方面的作用仍然是目前研究的热点。虽然假单胞菌种类丰富，但目前得到商品化利用的生防假单胞菌绝大多数都为荧光假单菌，国际生防微生物资源呈现严重趋同性。生防菌作用机理的单一更容易使病原菌产生抗性。近年来的很多研究表明，除了荧光假单胞菌之外，一些在研究领域较少见的假单胞菌也具有生防功能。如Rafikova等(2016)发现P.koreensis IB-4对镰刀菌属(Fusarium)、链格孢(Alternaria) 和平脐蠕孢属(Bipolaris)的真菌具有拮抗作用，是一株具有生防潜力的菌株。Agaras等(2018) 发现P.donghuensis SVBP6具有拮抗多种植物病原真菌的能力，并且通过基因组测序发现可能有一些新的机制能解释其广泛的抗菌活性。

因此，筛选新的生防假单胞菌资源，为植物病害的生物防治提供更多选择，是农业可持续发展的必然要求。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种生防假单胞菌及其应用，该菌株对灰霉菌具有显著的抑制效果，同时对辣椒疫霉、稻瘟病菌和小麦赤霉病菌表现出较好的抑制效果。该菌株发酵液对番茄灰霉病具有良好的防治效果，防效到达78.66％。因此，该菌株具有良好的生防应用前景。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一株对灰霉菌(Botrytis cinerea)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)和小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)具有抑制作用的假单胞菌 (Pseudomonas sp.)，具体为Pseudomonassp.GZ9，该菌株于2019年12月11日在中国典型培养物保藏中心保藏(湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏号为CCTCC NO: M20191037。

所述的生防菌株GZ9的16S rRNA基因序列如Seq ID No.1所示。

本发明涉及一种基于上述菌株的生防菌剂，通过将上述生防菌株GZ9制成种子液后接种至发酵培养基中得到活菌总浓度为1×10⁹CFU/mL以上的发酵产物，即生防菌剂。

所述的种子液，通过将所述的生防菌株GZ9在LB液体培养基中28℃180rpm振荡培养 12h，制成种子液。

所述的接种，通过将种子液以1％的接种量接种于发酵培养基中，在28℃、180rpm振荡培养48h，得到发酵产物。

当然，制备生防菌株GZ9发酵液的条件参数并不限于以上所述。凡是在合适的范围内更改培养基的营养成分和振荡培养的温度、摇床转速、培养时长，从而大量培养GZ9，且保持其抗灰霉病菌、辣椒疫霉、稻瘟病菌和小麦赤霉病菌活性的方法均可用于制备本发明请求保护的生防菌剂。

本发明涉及一种基于上述生防菌剂GZ9的应用，将其用于防治番茄灰霉病，具体为：将含有生防菌株GZ9的生防菌剂均匀喷洒在处于苗期，株龄约30～40天的番茄植株上。

所述的生防菌剂，要求生防菌株GZ9的有效含量至少为1×10⁹～1×10¹0CFU/mL。

技术效果

本发明提供的生防菌株GZ9能同时对灰霉病菌、辣椒疫霉、稻瘟病菌和小麦赤霉病菌具有较强的抑制作用，其中对灰霉病菌的抑制作用最强，其发酵液在平板对峙中对灰霉病菌的抑制率达到83％以上，盆栽实验防效可达78.66％。

本发明提供的生防菌株GZ9来源于玉米地土壤，其发酵液对植物本身、环境及人畜安全，在番茄植株上的灰霉病具有良好的防治效果，有利于番茄的绿色无公害生产。

本发明提供的生防菌剂制备工艺简单，耗时短，施用方式便捷。

附图说明

图1为生防菌株GZ9对4种植物病原菌的拮抗作用，其中，(A)灰霉菌，(B)辣椒疫霉，(C)稻瘟病菌，(D)小麦赤霉病菌；左边为菌株GZ9，右边为对照。

图2为生防菌株GZ9基于16S rRNA基因构建的系统发育树。

具体实施方式

以下实施例中所用的菌种培养基如下：

LB液体培养基的组分及配比(每1L)为：胰蛋白胨10g、酵母浸膏粉5g、氯化钠5g、去离子水1L，该培养基通过将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到。

LB固体培养基的组分及配比(每1L)为：配方为胰蛋白胨10g、酵母浸膏粉5g、氯化钠 5g、琼脂17g、去离子水1L，该培养基通过将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到。

PDA培养基的组分及配比(每1L)为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、去离子水1L，该培养基通过将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌15min得到。

假单胞菌选择性培养基的组分及配比(每1L)为：蔗糖15g、酪蛋白水解物4g、NaHCO₃ 1g、MgSO₄·7H₂O 1g、K₂HPO₄ 2.3g、月桂酰肌氨酸钠1.2g、甘油10g、琼脂18g、去离子水1L 该培养基通过将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到。

实施例1

生防菌株GZ9的分离和筛选，具体步骤包括：

步骤1)土壤假单胞菌的分离和保存

生防菌株GZ9分离自贵州省毕节市的玉米根际土壤，分离过程如下：称取10g所述土样于无菌锥形瓶中，加入90mL无菌水，灭菌小钢珠5g，于28℃、180rpm摇床中振荡20min，然后室温静置5min，得到10^-1稀释液，吸取100μL加入到900μL的无菌水中，混匀即为10^-2稀释液，采用同样的方法进行梯度稀释，得到10^-3和10^-4稀释液。每个梯度各取100μL均匀涂布在假单胞菌选择性培养基上，每个梯度涂板3个平板，置于28℃培养箱，倒置培养。

经1～3天后，挑取单菌落于LB固体培养基上生长，1天后，选取生长状况良好且菌落特征具有差异性的菌株进行假单胞菌特异性引物PCR。

特异性引物使用针对假单胞菌16S rDNA 3’端的半段和整个16S-23s rDNA间隔区所设计的一对引物：

fPs16S(position 756–779)，如Seq ID No.2所示，具体为：5’

-ACTGACACTGAGGTGCGAAAGCG-3’。

rPs23S(position 1–25)，如Seq ID No.3所示，具体为：5’

-ACCGTATGCGCTTCTTCACTTGACC-3’。

PCR反应体系(20μL)：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 10μL，模板DNA 1μL，上游引物fPs16S 0.75μL，下游引物rPs23S 0.75μL，ddH₂O 7.5μL。模板DNA通过煮沸法提取：在0.2mL PCR管中加入10μL无菌水，用高压灭菌的枪头沾取少许菌体，在沸水中煮约8min，取1μL上清为模板。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸70s，共32个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。收集PCR产物在1100-1300bp有单一条带的菌株，将其接种在LB液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h后，取1mL菌液于2mL保菌管中，与1mL 50％的无菌甘油混匀，置于-80℃保存。

步骤2)生防菌株GZ9的筛选

对分离到20多株菌株在PDA培养基上进行平板对峙实验。用到的植物病原菌包括假单胞菌对灰霉菌、辣椒疫霉、水稻稻瘟病菌和小麦赤霉病菌。具体操作方法如下：将收集的菌株分别接种于LB液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h，并将发酵液OD₆₀₀值调至0.8 左右。将水稻稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、灰霉病菌分别在PDA培养基上培养，待其长满平板后，用孔径6mm的打孔器打取边缘生长旺盛的菌块，菌丝面朝下，接种到PDA平板上，距离平板边缘2cm。再在离菌块4cm处放置一直径4mm的灭菌滤纸片，于上接种3μL发酵液。真菌菌块与滤纸片在同一条直径上。每个处理三个重复，以接LB液体培养基的为对照。28℃进行培养。对照处理中病原真菌长到培养皿边缘时，测量病原菌直径，计算抑菌率。抑制率(％)＝ [对照处理平板菌落直径—对峙处理平板菌落直径]/空白对照处理平板菌落直径×100

通过平板对峙实验，筛选到一株对灰霉菌、辣椒疫霉、水稻稻瘟病菌和小麦赤霉病菌均具有明显抑菌效果的菌株，即GZ9。平板对峙实验结果如表1和图1所示。

表1菌株GZ9对病原菌的抑制效果

病原菌	灰霉菌	辣椒疫霉	稻瘟病菌	小麦赤霉病菌
					抑制率(％)	87.45±3.86	66.81±2.42	60.57±5.14	45.02±5.96

实施例2

生防菌株GZ9的鉴定，具体步骤包括：

步骤1)生理生化特征

表2菌株GZ9的主要生理生化特性

步骤2)16S rRNA基因鉴定

使用如Seq ID No.4所示的细菌16S rRNA基因通用引物27

F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3’)和如Seq ID No.5所示的1492

R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)，以菌株GZ9基因组DNA为模板；按下述反应体系(30μL) 进行PCR反应：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 15μL，模板DNA 1μL，上游引物27F 1.4μL，下游引物1492R 1.4μL，ddH₂O 11.2μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃ 退火30s、72℃延伸90s，共32个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物约1500bp。

将PCR产物送上海派森诺生物进行测序，测序结果见Seq ID No.1，全长1414bp。测得的序列使用数据库RDP(The Ribosomal Database Project)中的SeqMatch功能(http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp)与现有的假单胞菌标准菌株的16S rRNA基因序列进行比对。再通过MEGAX构建系统发育树，如图2结果所示，该菌株鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。

实施例3

GZ9生防菌剂的制备，具体步骤包括：将生防菌株GZ9接入LB液体培养基中，28℃、180rpm培养12h，制成种子液；将种子液以1％的接种量接种于发酵培养基中，28℃、180rpm振荡培养48h，得到发酵液，活菌总浓度为1×10⁹CFU/mL以上，即为所制备的生防菌剂。发酵培养基仍使用LB液体培养基。

实施例4

生防菌株GZ9在番茄离体叶片上的番茄灰霉病防治，具体步骤包括：

步骤1)将实施例3所述发酵液5000r/min离心10min，取上清，以孔径0.22μm过滤器过滤得到发酵滤液。

步骤2)用25℃真菌培养箱中生长7～10天的灰霉菌，制备孢子悬浮液，使得孢子浓度约为100个/mL，分别与GZ9生防菌剂、生防菌剂10倍稀释液、生防菌剂100倍稀释液及发酵滤液按照1:1比例均匀混合；以无菌LB液体培养基同法制备无菌悬液作为对照。

步骤3)取大小、叶龄基本一致的健康番茄叶片，去除叶片表面灰尘，置于含琼脂培养基的培养皿中，取上述各混合液及对照液滴于叶片主叶脉两侧，每侧滴加10μL，25℃培养箱中培养3天。每组处理5片叶片，测量病斑直径，防治效果(％)＝(对照平均病斑直径-处理平均病斑直径)/对照平均病斑直径×100。

番茄叶片接种灰霉菌48h后，经菌株GZ9无菌滤液原液处理后的番茄植株叶片基本没有任何病斑出现，防效达到100％，说明菌株GZ9能够有效控制灰霉菌对叶片组织的侵染。并且发酵液原液对灰霉菌的抑制效果比发酵滤液更好。

表3生防菌株GZ9在番茄离体叶片上对灰霉菌的防治效果

	对照组	生防菌剂	10倍稀释液	100倍稀释液	发酵滤液
						病斑直径(mm)	7.87	0	4.32	5.21	2.14
防治效果(％)	-	100	45.11	33.80	72.81

实施例5

生防菌株GZ9在番茄植株上的番茄灰霉病防治，具体步骤包括：

步骤1)采用喷雾法分别将GZ9生防菌剂、生防菌剂10倍稀释液及发酵滤液均匀喷洒于生长周期为一个月的番茄植株上；

步骤2)24h后用实施例4中同样方法制备的灰霉菌孢子悬浮液处理番茄植株底端、中间及顶端的部分叶片，吸取50μL孢子悬浮液于选定的待处理叶片上，用灭菌毛笔均匀涂开。

步骤3)以灭菌LB液体培养基为对照同法操作。每组5株，每株植株处理10片真叶，重复3次。25℃保湿黑暗培养24h，然后在25℃、12h光暗交替条件下培养7天。

分级调查各处理发病情况，计算各处理的病情指数和防治效果，病情指数分级标准为：

0级：无病斑；

1级：病斑占整个叶面积的5％以下；

3级：病斑占整个叶面积的5％～15％；

5级：病斑占整个叶面积的15％～25％；

7级：病斑占整个叶面积的25％～50％；

9级：病斑占整个叶面积的50％以上。

发病率(％)＝发病的叶片数/接种的总叶片数×100

病情指数(％)＝[∑(各级病叶数×相对病级值)]/(调查总叶数×最高代表级值)×100

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

表4菌株GZ9番茄植株上的防治效果

数据显示，本发明菌株的发酵液对番茄灰霉病具有良好的防治效果，防效到达78.66％。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 生防假单胞菌及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1414

<212> DNA

<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp.)

<400> 1

acacatgcaa gtcgagcggt agagaggtgc ttgcacctct tgagagcggc ggacgggtga 60

gtaatgccta ggaatctgcc tggtagtggg ggataacgct cggaaacgga cgctaatacc 120

gcatacgtcc tacgggagaa agcaggggac cttcgggcct tgcgctatca gatgagccta 180

ggtcggatta gctagttggt gaggtaatgg ctcaccaagg cgacgatccg taactggtct 240

gagaggatga tcagtcacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca 300

gtggggaata ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagcc atgccgcgtg tgtgaagaag 360

gtcttcggat tgtaaagcac tttaagttgg gaggaagggc attaacctaa tacgttagtg 420

ttttgacgtt accgacagaa taagcaccgg ctaactctgt gccagcagcc gcggtaatac 480

agagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcgcgtaggt ggttcgttaa 540

gttggatgtg aaagccccgg gctcaacctg ggaactgcat tcaaaactgt cgagctagag 600

tatggtagag ggtggtggaa tttcctgtgt agcggtgaaa tgcgtagata taggaaggaa 660

caccagtggc gaaggcgacc acctggactg atactgacac tgaggtgcga aagcgtgggg 720

agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtcaac tagccgttgg 780

gagccttgag ctcttagtgg cgcagctaac gcattaagtt gaccgcctgg ggagtacggc 840

cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 900

taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggccttgaca tccaatgaac tttccagaga 960

tggattggtg ccttcgggag cattgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1020

gtgagatgtt gggttaagtc ccgtaacgag cgcaaccctt gtccttagtt accagcacgt 1080

tatggtgggc actctaagga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1140

aagtcatcat ggcccttacg gcctgggcta cacacgtgct acaatggtcg gtacagaggg 1200

ttgccaagcc gcgaggtgga gctaatccca caaaaccgat cgtagtccgg atcgcagtct 1260

gcaactcgac tgcgtgaagt cggaatcgct agtaatcgcg aatcagaatg tcgcggtgaa 1320

tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaccagaag 1380

tagctagtct aaccttcggg gggacggtac cacg 1414

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

actgacactg aggtgcgaaa gcg 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

accgtatgcg cttcttcact tgacc 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims

1.一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)，其特征在于，具体为生防菌株GZ9，该菌株于2019年12月11日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 20191037；该生防菌株GZ9的16S rRNA基因序列如Seq ID No.1所示。

2.一种根据权利要求1所述假单胞菌的应用，其特征在于，用于拮抗灰霉菌(Botrytiscinerea)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)和小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，用于防治番茄灰霉病方面的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征是，将含有生防菌株GZ9的生防菌剂均匀喷洒在株龄的番茄植株上实现防治番茄灰霉病。

5.一种基于上述任一权利要求所述假单胞菌的生防菌剂的制备方法，其特征在于，通过将生防菌株GZ9制成种子液后接种至发酵培养基中得到活菌总浓度为1×10⁹CFU/mL以上的发酵产物，即生防菌剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的种子液，通过将所述的生防菌株GZ9在LB液体培养基中28℃180rpm振荡培养12h，制成种子液。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的接种，通过将种子液以1％的接种量接种于LB液体培养基中，在28℃、180rpm振荡培养48h，得到发酵产物。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的LB液体培养基的组分及配比(每1L)为：胰蛋白胨10g、酵母浸膏粉5g、氯化钠5g、去离子水1L，该培养基通过将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到。