CN113249243B - 一株假单胞菌、含有该菌的微生物生防菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZL8，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.21874；还公开了含有该假单胞菌的微生物生防菌剂及其制备方法，以及ZL8和其生防菌剂在抑制植物病原真菌中和植物促生中的应用。本发明提供的生防菌株ZL8对黄瓜褐斑菌、油菜菌核菌、小麦赤霉、马铃薯黄萎病或丹参病原真菌具有较强的抑制作用，在黄瓜、三七植株中具有良好的病害防治效果及促进生长和增产的效果。

Description

一株假单胞菌、含有该菌的微生物生防菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术和生物防治技术领域，尤其涉及一株假单胞菌、含有该菌的微生物生防菌剂及其应用。

背景技术

近几十年的农业生产中，化肥、农药、除草剂等农业投入品的不合理使用等问题，已造成了各种有毒有害物质的积累，破坏了土壤的物理结构，土壤酸化日益严重和有机质的下降，引起了土壤中功能微生物的失衡与土壤肥力的下降，肥料利用率不高，作物病害频发，农业效益下降，要解决我国农业生产的障碍，实现农业可持续发展，正好与微生物菌剂的功能相吻合，也正是微生物菌剂的特点和专长。

假单胞菌(Pseudomonas adaceae)是无核细菌，在自然界中分布极为广泛，可以利用多种不同的物质作为能源，生长营养需求并不高。研究表明假单胞菌具有杀虫、改善植物营养、降解有毒物质、产生抗生素和植物生长调节物质、改善植物微环境和诱导系统抗性等生物防治作用。假单胞菌也是一类常见的植物根际促生菌。Rajendran等(Rajendran L,Samiyappan R,Raguchander T,et al.Endophytic bacteria mediate plant resistanceagainst cotton bollworm[J].Journal of Plant Interactions,2007,2(1):1-10)分离得到的内生细菌中有 2株芽孢杆菌和1株荧光假单胞菌对美洲棉铃虫的防治效果最为明显，这3株内生细菌制成生物菌剂有效降低了美洲棉铃虫的发生率。

筛选新的生防假单胞菌资源，为植物病害的生物防治提供更多选择，是农业可持续发展的必然要求。

发明内容

本申请发明人筛选到一株对植物致病真菌有良好抑制作用，同时又对植物生长具有促进作用的生防假单胞菌。基于此，本申请要求保护以下技术方案：

第一方面，本发明提供一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZL8，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.21874。

第二方面，本发明提供一种微生物生防菌剂，含有上述的假单胞菌ZL8；

优选所述微生物菌剂为液体菌剂。

优选地，所述微生物生防菌剂，是上述的假单胞菌ZL8在发酵培养基中发酵而得，

优选所述发酵培养基为液体培养基，其中活菌总浓度不低于1×10⁹CFU/mL。

优选地，所述液体培养基为LB液体培养基；

优选所述LB液体培养基组分及配比为：蛋白胨10g/1L，酵母粉5g/1L，NaCl 10g/1L。

第三方面，本发明提供上述的微生物生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的假单胞菌ZL8制成种子液；

(2)将种子液接种至发酵培养基中培养，得到发酵产物即所述微生物生防菌剂。

优选地，所述步骤(1)种子液的制备方法为：将假单胞菌ZL8接种到LB液体培养基中28～32℃、150～250rpm振荡培养10～14h；

优选培养条件为30℃、200rpm振荡培养12h；

优选所述LB液体培养基的组分及配比为：蛋白胨10g/1L，酵母粉5g/1L，NaCl 10g/1L。

在上述技术方案中，所述步骤(2)将种子液接种至发酵培养基中培养的具体方法为：将种子液以0.8～1.2％的接种量接种于发酵培养基中，在28～32℃、150～250rpm振荡培养44～52h，得到发酵产物；

优选将种子液以1％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃、200rpm振荡培养48h；

优选发酵产物的活菌总浓度不低于1×10⁹CFU/mL；优选1×10⁹～1×10¹⁰CFU/mL。

第四方面，本发明提供上述的假单胞菌ZL8或上述的微生物生防菌剂在抑制植物病原真菌中的应用；

优选所述植物病原真菌为黄瓜褐斑菌、油菜菌核菌、小麦赤霉、马铃薯黄萎病或丹参病原真菌。

第五方面，本发明提供上述的假单胞菌ZL8或上述的微生物生防菌剂在植物促生中的应用；

优选所述促生为植株根系发育的促进或作物产量的提高；优选，所述植物为黄瓜或三七。

在上述应用中，应用方式包括采用所述微生物生防菌剂对待处理植物进行浸种、喷洒植株或幼苗定植后灌根。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的生防菌株ZL8能同时对黄瓜褐斑菌、油菜菌核菌、小麦赤霉、马铃薯黄萎病和丹参病原真菌具有较强的抑制作用，其中菌液乙酸乙酯萃取物和水相部位活性最强且相当。

2、本发明提供的生防菌株ZL8来源于健康猪苓菌核，其发酵液对植物本身、环境及人畜安全，在黄瓜、三七植株中具有良好的病害防治效果及促进生长和增产的效果。

3、本发明的微生物生防菌剂制备工艺简单、耗时短、施用方式便捷。

附图说明

图1是实施例6中本发明的生防菌株ZL8对植物致病菌的抑菌效果测定实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。未特别说明的实验试剂来源，均可通过商购获得。

主要试剂来源：

细菌基因组DNA提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；

2×M5supermix：北京聚合美生物科技有限公司；

本发明所用的培养基如下：

LB培养基的组分及配比(每1L)为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂15g，加水定容至1L，该培养基通过将前述组分混合后在121℃高压灭菌15min。

NA培养基的组分及配比(每1L)为：称取10g蛋白胨，3g氯化钠，3g牛肉膏粉，琼脂粉15g，加水定容至1L，121℃高压灭菌15min。

YMA培养基的组分及配比(每1L)为：甘露醇10g，酵母提取物1g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.2g，琼脂15g，加水定容至1L，121℃高压灭菌15min。

猪苓固体培养基的组分及配比(每1L)为：葡萄糖20g，酵母粉5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，琼脂15g，加水定容至1L，pH＝6.0，121℃灭菌15min。

此外，实验过程中所用液体培养基为未加琼脂的对应的固体培养基配方。

实施例1、生防菌株ZL8的分离和筛选

具体步骤包括：

步骤1、假单胞菌的分离和保存

本发明提供的生防菌株ZL8是于陕西省宁陕县采集健康猪苓(polyporus，非褶菌目多孔菌科树花属药用真菌)菌核中分离，分离过程如下：首先，用流水将材料反复冲洗干净，以除去附着在表面的泥土及大部分的土壤微生物。随后依次用70％的乙醇洗3min， 2％的次氯酸分别浸泡2、5、7min，结果表明采用次氯酸钠浸泡2min时平皿内仍有部分细菌生长，浸泡5、7min的材料均可达到表面消毒彻底的效果，但浸泡7min或更长时间时无内生细菌的生长，因此判定次氯酸钠浸泡7min以上则消毒过于彻底。最终选定表面消毒程序为75％的乙醇洗3min，2％的次氯酸浸泡5min，无菌水冲洗5-6次后以无菌滤纸吸干表面水分，取最后一次冲洗的蒸馏水涂布于培养基作空白对照，于30℃培养2-5d，检测消毒情况。

若空白对照处理的分离培养基平板上没有菌落生长，则可以认为材料表面消毒彻底，实验分离到的细菌均为猪苓内生细菌。

以无菌手术刀切取表面消毒良好的猪苓菌核，将切取的样品放入无菌研钵中，加1-2ml蒸馏水制成研磨液，静置30min，研磨液梯度稀释至10^-3倍，每个处理设置三个重复，取100μL液体涂布于NA培养基/LB培养基/YMA培养基上。30℃倒置培养2-5天至有菌落长出。根据观察到的内生细菌的菌落颜色、形态对分离得到的菌株进行分类，挑取相应单菌落，经过多次分离纯化后，编号，保存。

对分离得到的菌株的菌液(菌株于LB培养基中30℃发酵培养24h得到)进行PCR 鉴定，使用细菌16S rRNA基因通用引物：

上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3'(SEQ ID No.1)，

下游引物27R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCC-3'(SEQ ID No.2)。

PCR反应体系(20μL)：2×M5supermix 25μl,上游引物(10μM)2μl,下游引物(10μM)2μl,菌液1μl,余量为ddH₂O。

PCR反应程序：预变性94℃10分钟，(变性94℃30秒，退火温度55℃30秒，延伸温度72℃1分钟)35个循环，72℃5分钟，4℃终止反应。

反应结束后，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖电泳检测片段大小与目的条带大小一致的扩增产物送北京睿博兴科生物技术有限公司测序，得到拼接序列后，以 NCBI数据库中Blast程序比对分析，确定分离得到的候选菌株为假单胞菌属细菌。

步骤2、生防菌株ZL8的筛选

对分离得到的候选假单胞菌属细菌在猪苓固体培养基上进行平板对峙实验，以观察细菌对猪苓菌丝生长的影响。选取培养25d的猪苓菌落作为供试菌落，用打孔器在供试猪苓菌丝平板边缘打出直径6mm的菌饼。挑取候选假单胞菌单菌落于LB培养基中30℃培养12h，调整OD600约为0.7左右。取1块供试菌饼，放在直径90mm的猪苓固体培养基平板中心，距菌饼2cm处划线涂布假单胞菌细菌菌液，每处理6次重复，25℃避光培养，分别记录5d、10d、15d、20d以十字交叉法测量猪苓菌落直径。

通过平板对峙实验，筛选到一株对猪苓菌丝具有明显抑菌效果的菌株--ZL8。平板对峙实验结果如表1所示。

表1假单胞属细菌对猪苓菌丝生长的影响(n＝6)

实施例2、生防菌株ZL8的鉴定

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株ZL8基因组DNA，采用16S rRNA基因鉴定，具体步骤为：

使用前述的细菌16S rRNA基因通用引物27F/27R，以菌株ZL8基因组DNA为模板；按下述反应体系(25μL)进行PCR反应：2×M5supermix 25μl,上游引物(10μM)2μl,下游引物(10μM)2μl,菌液1μl,余量为ddH₂O。PCR反应程序：预变性94℃10分钟，(变性94℃30秒，退火温度55℃30秒，延伸温度72℃1分钟)35个循环，72℃5分钟，4℃终止反应。

PCR产物约1500bp。将PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，测序结果见SEQ ID No.3，全长1365bp。利用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)数据库对拼接后序列进行BLASTN比对，该菌株鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。

将菌株ZL8于2021年3月送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)进行保藏：

地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2021年3月5日；

保藏编号为：CGMCC NO.21874，

分类名为：姜黄色假单胞菌(Pseudomonas gingeri)。

实施例3、ZL8生防菌剂的制备

具体步骤为：将生防菌株ZL8接入LB液体培养基中，30℃、200rpm培养12h，制成种子液；将种子液以1％的接种量接种于发酵培养基(采用LB液体培养基)中，30℃、 200rpm振荡培48h，得到发酵液，活菌总浓度为1×10⁹CFU/mL以上，即为所制备的生防菌剂。

实施例4、生防菌株ZL8对黄瓜植株的促生能力实验

1、试验样品：假单胞菌ZL8

2、田间试验作物：黄瓜

3、试验方法及步骤

(1)菌种活化及菌液制备

挑取假单胞菌ZL8平板上单菌落接种于5ml液体LB培养基中，30℃震荡培养24h，再以5％的接种量接种于100ml液体LB培养基中，30℃震荡培养96h，得到培养液，计数(菌数为1.1×10⁹CFU/ml)，备用。

(2)田间试验

在黄瓜幼苗定植后第二片真叶展开时用5倍稀释的菌液灌于根部，分别设置对照进行比较，在一个生长季结束时(约4个月)测量作物的产量，并对作物的根系进行比较。

结果显示：黄瓜的产量比之前增长了10％，且假单胞菌ZL8对植株根系的发育具有良好的促进作用。

实施例5、生防菌株ZL8对三七植株的促生能力实验

1、试验样品：假单胞菌ZL8

2、田间试验作物：三七

3、试验方法及步骤

(1)菌种活化及菌液制备

挑取假单胞菌ZL8平板上单菌落接种于5ml液体LB培养基中，30℃震荡培养24h，再以5％的接种量接种于100ml液体LB培养基中，30℃震荡培养96h，得到培养液，计数(菌数为1.1×10⁹CFU/ml)，备用。

(2)田间试验

在三七定植后第二片真叶展开时用5倍稀释的菌液灌于根部，分别设置对照进行比较，在一个生长季结束时测量作物的产量，并对作物的根系进行比较。

结果显示，三七的产量比之前增长了15％，且假单胞菌ZL8对三七植株根系的发育具有良好的促进作用。

实施例6、生防菌株ZL8对植物致病菌的抑制作用

1、抗真菌活性筛选

将发酵罐发酵得到的假单胞菌ZL8发酵液离心得到菌液上清和菌丝体，用DMSO溶剂将菌丝体甲醇萃取物、滤液乙酸乙酯萃取物、滤液水相萃取部分和酮康唑(阳性对照) 配制成浓度为10mg/mL原液。以10株农作物病原真菌作为测试菌，采用滤纸片法测定各萃取部位的抗真菌活性。

基本操作方法如下：首先，将测试病原真菌在PDA培养基进行菌种活化。然后，将单菌落病原菌接种至新鲜PDA培养板，接着在培养板中放置已灭菌滤纸片。最后，将待测样品、阳性对照和阴性对照DMSO分别滴加到滤纸片上，随后将培养平板置于28℃恒温培养箱中培养2-3天，随时观测活性结果，并记录抑菌圈大小。

2、测试植物病原真菌

马铃薯黄萎病(Verticillium dahliae Kleb)、白菜黑斑(Alternaria mali)、水稻纹枯菌 (Rhizoctonia solani)、油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麦赤霉(Gibberella saubinetii)、蛹虫草(Cordyceps militaris)、黄瓜褐斑(Corynesporacassiicola)、丹参病原真菌(Fusarium oxysporum Dahl-1)、丹参病原真菌(Fusariumsp.Dahl-2)和丹参病原真菌(Fusarium solani Dahl-3)，均由中国中医科学院中药资源中心分子生药实验室提供。

3、测试结果

测试结果见附图1和表2，由结果可知，本发明提供的生防菌株ZL8能同时对黄瓜褐斑菌、油菜菌核菌、小麦赤霉、马铃薯黄萎病和丹参病原真菌具有较强的抑制作用，其中菌液乙酸乙酯萃取物和水相部位活性最强且相当。

表2

序列表

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 一株假单胞菌、含有该菌的微生物生防菌剂及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> 上游引物

<400> 1

agagtttgat cctggctcag aacgaacgct 30

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> 下游引物

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac ttcaccc 27

<210> 3

<211> 1365

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> 假单胞菌(Pseudomonas sp.)

<400> 3

ctacttctgg tgcaacccac tcccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac 60

gtattcaccg cgacattctg attcgcgatt actagcgatt ccgacttcac gcagtcgagt 120

tgcagactgc gatccggact acgatcggtt ttatgggatt agctccacct cgcggcttgg 180

caaccctttg taccgaccat tgtagcacgt gtgtagccca ggccgtaagg gccatgatga 240

cttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtctccttag agtgcccacc 300

ataacgtgct ggtaactaag gacaagggtt gcgctcgtta cgggacttaa cccaacatct 360

cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtctca atgttcccga aggcacccat 420

ccatctctgg aaagttcatt ggatgtcaag gcctgagtaa ggttcttcgc gttgcttcga 480

attaaaccca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcatttg agttttaacc 540

ttgcggcccg tactccccag gcggtcaact taatgcgtta gctgcgccac taagaactca 600

aggttcccaa cggctagttg acatcgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg 660

tttgctcccc acgctttcgc acctcagtgt cagtatgagt ccaggtggtc gccttcgcca 720

ctggtgttcc ttcctatatc tacgcatttc accgctacac aggaaattcc accaccctct 780

accctactct agcttgccag ttttggatgc agttcccagg ttgagcccgg ggatttcaca 840

tccaacttaa caaaccacct acgcgcgctt tacgcccagt aattccgatt aacgcttgca 900

ccctctgtat taccgcggct gctggcacag arttagccgg tgcttattct gtcggtaacg 960

tcaaaacact aacgtattag gttaatgccc ttcctcccaa cttaaagtgc tttacaatcc 1020

gaagaccttc ttcacacacg cggcatggct ggatcaggct ttcgcccatt gtccaatatt 1080

ccccactgct gcctcccgta ggagtctgga ccgtgtctca gttccagtgt gactgatcat 1140

cctctcagac cagttacgga tcgtcgcctt ggtgagccat tacctcacca actagctaat 1200

ccgacctagg ctcatctgat agcgcaaggc ccgaaggtcc cctgctttct cccgtaggac 1260

gtatgcggta ttagcgttcc tttcgaaacg ttgtccccca ctaccaggca gattcctagg 1320

cattactcac ccgtccgccg ctgaatcgaa gagcaagctc ttctc 1365

Claims (16)

1.一株姜黄色假单胞菌(Pseudomonas gingeri)ZL8，在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.21874。

2.一种微生物生防菌剂，其特征在于：含有如权利要求1所述的姜黄色假单胞菌ZL8。

3.如权利要求2所述的微生物生防菌剂，其特征在于：所述微生物生防菌剂为液体菌剂。

4.如权利要求2所述的微生物生防菌剂，其特征在于：是权利要求1所述的姜黄色假单胞菌ZL8在发酵培养基中发酵而得。

5.如权利要求4所述的微生物生防菌剂，其特征在于：所述发酵培养基为液体培养基，其中活菌总浓度不低于1×10⁹CFU/mL。

6.如权利要求5所述的微生物生防菌剂，其特征在于：所述液体培养基为LB液体培养基。

7.如权利要求6所述的微生物生防菌剂，其特征在于：所述LB液体培养基组分及配比为：蛋白胨10g/1L，酵母粉5g/1L，NaCl 10g/1L。

8.权利要求2至7任一项所述的微生物生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的姜黄色假单胞菌ZL8制成种子液；

(2)将种子液接种至发酵培养基中培养，得到发酵产物即所述微生物生防菌剂。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)种子液的制备方法为：将姜黄色假单胞菌ZL8接种到LB液体培养基中28～32℃、150～250rpm振荡培养10～14h。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于：培养条件为30℃、200rpm振荡培养12h；

所述LB液体培养基的组分及配比为：蛋白胨10g/1L，酵母粉5g/1L，NaCl10g/1L。

11.如权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)将种子液接种至发酵培养基中培养的具体方法为：将种子液以0.8～1.2％的接种量接种于发酵培养基中，在28～32℃、150～250rpm振荡培养44～52h，得到发酵产物。

12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于：将种子液以1％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃、200rpm振荡培养48h。

13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于：发酵产物的活菌总浓度不低于1×10⁹CFU/mL。

14.权利要求1所述的姜黄色假单胞菌ZL8或权利要求2至7任一项所述的微生物生防菌剂在抑制植物病原真菌中的应用；所述植物病原真菌为黄瓜褐斑菌、油菜菌核菌、小麦赤霉、马铃薯黄萎病或丹参病原真菌。

15.权利要求1所述的姜黄色假单胞菌ZL8或权利要求2至7任一项所述的微生物生防菌剂在植物促生中的应用，所述植物为黄瓜或三七；

所述促生为植株根系发育的促进或作物产量的提高。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于：应用方式包括采用所述微生物生防菌剂对待处理植物进行浸种、喷洒植株或幼苗定植后灌根。

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