CN114875058B - 一种定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法 - Google Patents

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Abstract

本申请属于农业生物防治技术领域，具体涉及一种定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法。该方法通过在工程菌基因组中转入flg22基因来提高植物对根腐病致病菌的抗性；具体改造方法包括：获得flg22基因或者设计含有flg22基因的重组用基因片段，构建含有flg22基因的重组质粒，三株杂交法构建表达flg22的工程菌等步骤。本申请中，通过对假单胞菌转化植物免疫激发子flg22来诱导植物免疫反应，突破RBC的防御作用，进而实现假单胞菌在植物根尖定植，最终达到防止根腐病病原真菌侵染目的。在小麦中的初步应用效果表明，所构建的工程菌有效防止了病原菌对小麦根尖的感染，在小麦根腐病防治中表现出较好的生物防治效果。

Description

一种定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法
技术领域
本申请属于农业生物防治技术领域，具体涉及一种定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法。
背景技术
农业生产中，根腐病普遍发生于各地、各种农作物中，而且在农作物的整个生育期均有可能发生，为此，每年均会造成巨大的经济损失。
研究表明，根腐病是由一类土传性真菌病原菌所引起的，包括：腐霉菌（Pythium）、疫霉菌（Phytophthora）、丝核菌（Rhizoctonia）、镰刀菌（Fusarium）和全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminis）等，病原菌的菌丝通过侵染根尖，进而侵染整个根部和茎基部，造成根尖褐黑、腐烂，最终造成根和茎基部发生黑斑、腐烂、叶子变黄和枯萎、植株猝倒等症状。
根腐病具有隐发性特点，即，发病部位首先在地下根尖，当地上部出现症状时，根部已经腐烂，无法为植物的上部提供足够的水分，发病植株已无法存活。同时，根腐病还具有连发性特点，即，病原菌的孢子、休眠体或菌丝体能够在土壤中存活多年，最长甚至高达30年，一旦条件适宜，如高湿（连阴雨或灌溉）和适宜的温度，就会生长繁殖，侵染根尖。
现有技术中，针对根腐病的防治方法，包括农业防治如采用无病种子种苗、土壤有机改良、生物熏蒸、改进栽培方法和耕作制度和加强田间卫生管理等，其中生物防治手段则采用生防菌如用木霉菌、枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌等浸种、蘸根、灌根、滴灌施用和混土等。总体上，生物防治比常规农业防治方式更为有效，且对环境无毒性，且具有成本效益，是目前最为提倡和推广的防治方法。
但需要明确的是，由于根腐病致病病原微生物不同，不同生防菌防治根腐病的机理也有所不同。例如：木霉菌通过寄生根腐病原菌抑制其生长；而枯草芽孢杆菌和一些假单胞菌等通过诱导植物系统抗性或合成的抑真菌物质来对根腐病原菌发挥拮抗作用；生防菌荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）则通过在根尖定植方式，从与病原菌竞争营养和生态位层面来发挥抗菌作用。
总体上，从生物防治技术角度而言，结合不同致病病原菌特点，如何进一步筛选或者改造现有生防菌，对于根腐病的防治是具有重要的技术意义的。
发明内容
基于生物防治目的需要，本申请目的在于提供一种微生物工程菌改造方式，从而为根腐病防治奠定一定技术基础，同时也为生物防治技术改进提供一定借鉴和参考。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法，所述工程菌为假单胞菌，具体例如为美国农业研究菌种保藏中心保藏编号为NRRL B-50193的假单胞菌UW4（Pseudomonassp. UW4）菌株；
该方法通过在工程菌基因组中转入flg22基因来增强工程菌对根腐病致病菌在植物根部的竞争性（即，提高植物根部对于根腐病致病菌抗性）；
所述根腐病致病菌具体例如为立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）；
所述flg22基因，碱基序列（99bp）如SEQ ID No.1所示，具体如下：
AACCGTGCTACCGATGCACTTTCGACCTCGATGCAACGTCTGTCTTCCGGCCTGAAAATCAACAGCGCCAAGGACGACGCCGCCGGCCTGCAGATCGCA
具体改造方法包括如下步骤：
（一）获得flg22基因
所述flg22基因，碱基序列（99bp）如SEQ ID No.1所示，具体如下：
AACCGTGCTACCGATGCACTTTCGACCTCGATGCAACGTCTGTCTTCCGGCCTGAAAATCAACAGCGCCAAGGACGACGCCGCCGGCCTGCAGATCGCA；
优选的，为便于后续检测和应用，构建获得含有flg22基因的flg22-EGFP基因片段；
所述flg22-EGFP基因片段，序列两端分别带有Xho1酶和BamHI酶切位点序列、氨苄抗性基因启动子序列、编码丁香假单胞菌flg22的序列（也是信号肽序列）、编码EGFP的序列和编码6His标签序列；序列设计（957bp）如SEQ ID No.2所示，具体片段序列如下：
CCGCTCGAG CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAACCGTGCTACCGATGCACTTTCGACCTCGATGCAACGTCTGTCTTCCGGCCTGAAAATCAACAGCGCCAAGGACGACGCCGCCGGCCTGCAGATCGCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGcatcaccaccaccatcacGGATCCGCG；
上述序列结构中：
序列上游的“CTCGAG”、下游的“GGATCC”分别为Xho1酶和BamHI酶切位点序列；
序列中的“CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGT”部分序列为氨苄抗性基因启动子序列；
序列中的“AACCGTGCTACCGATGCACTTTCGACCTCGATGCAACGTCTGTCTTCCGGCCTGAAAATCAACAGCGCCAAGGACGACGCCGCCGGCCTGCAGATCGCA”部分序列为flg22编码序列；
序列中的“catcaccaccaccatcac”序列为编码6His序列。
（二）构建含有flg22基因的重组质粒
以pBBR1AmP-EGFP质粒（ pBBR1MCS2-pAmp-EGFP）为载体，重组整合步骤（一）中的flg22基因以获得重组质粒；
以具体flg22-EGFP基因片段为例，具体重组时：
将pBBR1AmP-EGFP质粒进行Xho1、BamHI双酶切，并利用连接酶与flg22-EGFP基因片段进行连接，进一步转化、筛选、获得构建正确的可表达flg22-EGFP的重组质粒pBBR1Amp-flg22-EGFP。
（三）三株杂交法构建表达flg22-EGFP的工程菌
将步骤（二）所构建的重组质粒pBBR1Amp-flg22-EGFP转化大肠杆菌E. coliDH5α，筛选转化正确菌株作为供体菌；
将大肠杆菌JM101（PRK2013）（含有结合辅助质粒pRK2013）作为帮助菌；
以假单胞菌（具体例如为假单胞菌UW4）作为受体菌；
具体三株杂交时：
首先，将供体菌、帮助菌、受体菌分别培养扩增；
随后，按照如下顺序进行菌体杂交：
先将供体菌菌液离心后，收集菌体，并用0.85%的NaCl溶液重悬，加入帮助菌菌液后，再次离心后，收集菌体，并再次用0.85%的NaCl溶液重悬，最后，加入受体菌菌液后，再次离心后，用0.85%的NaCl溶液重悬；
最后，将上述混合菌液滴加平铺于固体培养基表面的硝酸纤维素膜上进行培养，培养完成后用0.85%的NaCl溶液将硝酸纤维素膜上的菌体冲洗下来，稀释后涂布在抗性（100 μg/mL Kana + 100 μg/mL Amp）培养基平板上进行筛选，对筛选所得阳性转化子进行进一步鉴定以获得可表达的flg22-EGFP的假单胞菌工程菌。
利用所述定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法改造所得工程菌。
所述工程菌在小麦根腐病防治中应用，用于防治根腐病致病菌所致根腐病，所述根腐病致病菌具体例如为：立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）。
在对植物根系周围微生物研究中，人们很早就发现，在植物根尖部位很少有微生物定植，不论是有益菌还是病原菌，在根尖的定植量均显著低于在根的其他部位。根尖（由根冠分生组织和根冠组成的距根端1-2 mm的区域）往往由根冠分生组织产生的根边缘细胞（Root bordercells，RBC）包围，一旦去除RBC，微生物则可快速定植并侵染根尖。因此，可以说是RBC阻止了微生物在根尖的定植侵染。然而，当降雨或灌溉导致土壤中自由水较多时，根边缘细胞即会从根尖扩散出去，进而导致根尖易被病原菌侵染。因此，发明人认为，最为有效的生防策略就是利用植物促生根际细菌（PGPR）来竞争相应生态位（根尖）和营养。
现有技术中，假单胞菌UW4是一种研究应用较多的植物促生根际细菌，本申请中，即以此菌为基础，通过对其转化植物免疫激发子flg22来诱导植物发生RBC免疫反应，突破RBC的防御作用，进而实现假单胞菌UW4在植物根尖定植，最终达到防止根腐病病原真菌侵染目的。
在小麦中的初步应用效果表明，所构建的工程菌有效防止了病原菌对小麦根尖的感染，在小麦根腐病防治中表现出较好的生物防治效果，同时也为其他类型根腐病致病菌的防控提供了较好借鉴和参考作用。
附图说明
图1为质粒pBBR1Amp-EGFP 与Flg22片段连接后所构建重组质粒pBBR1Amp-EGFP-Flg22电泳图，其中：M，Marker； 1、3，pBBR1Amp-EGFP；2，pBBR1Amp-EGFP-Flg22；4，酶切pBBR1Amp-EGFP；5，酶切pBBR1Amp-EGFP-Flg22；
图2为质粒pBBR1Amp-EGFP-Flg22 的转化子菌落PCR验证；其中：M， Trans 2Kplus II marke；1、2，转化子；
图3为 Western blot法对UW4工程菌分泌flg22-EGFP情况检测结果，其中：M，PM2510蛋白质Marker；1、2，UW4-flg22-EGFP培养液上清；3，UW4，UW4-EGFP培养液上清；
图4为活性氧荧光探针染色激光共聚焦显微镜观察假单胞菌菌株菌悬液诱导根边缘细胞产生的活性氧情况；
图5为扫描电镜观察假单胞菌UW4不同菌株在小麦根尖端和其后伸长区的定植情况；
图6为假单胞菌UW4不同菌株在小麦根尖的定植量结果，图中：UW4-E，假单胞菌UW4-EGFP；UW4-f-E，假单胞菌UW4-flg22-EGFP；
图7为不同假单胞菌UW4菌株和立枯丝核菌共接种小麦根系情况下，假单胞菌在根尖的定植量（A）、小麦根鲜重（B）和苗高（C）结果，图中：
Rs，单接种立枯丝核菌；E+Rs，接种假单胞菌UW4-EGFP和立枯丝核菌；f-E+Rs，接种假单胞菌UW4-flg22-EGFP和立枯丝核菌；
*表示处理间差异达到显著水平（p＜0.05）；数据标注的不同小写字母表示差异达到显著水平（p＜0.05）；数据标注的不同大写字母表示差异达到显著水平（p＜0.01）；
图8为假单胞菌UW4不同菌株对立枯丝核菌侵染小麦根的防治效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
相关生物材料：
假单胞菌UW4（Pseudomonassp. UW4）：一种美国农业研究菌种保藏中心保藏编号为NRRL B-50193（保藏日为2008年6月9日）的、可公开获得的常用菌株（美国农业研究菌种保藏中心，英文全称AgrieultutalResearch Service Culture Colleetion，简称NRRL，该中心位于伊利诺伊州皮契里亚，为一个由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心）；
立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani），一种根腐病致病菌，由河南省农业科学院植保所惠赠；
大肠杆菌DH5α感受态细胞，购买于北京宝日医生物科技公司；
pBBR1AmP-EGFP质粒（ pBBR1MCS2-pAmp-EGFP），购自淼灵质粒平台；
大肠杆菌JM101（pRK2013）菌株：大肠杆菌JM101属于基因工程中常用菌株，可由公开渠道获得；pRK2013属于一种基因工程常用结合辅助质粒，也可由公开渠道获得；实施例中所采用大肠杆菌JM101（pRK2013）菌株为转化有pRK2013质粒的大肠杆菌JM101（常规转化即可），来自于河南农业大学食用及药用真菌实验室。
相关培养基：
LB液体培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，去离子水1000 mL；
LB固体培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g，去离子水1000 mL；
相关培养基按照现有技术常规配制、灭菌即可，不再赘述。
实施例1
本申请中，发明人的主要技术构思为：利用flg22所导致的免疫效应来突破根尖RBC的防御作用，进而实现有益菌在根尖的定植，最终有益菌通过生态位（根尖）和营养竞争方式来阻止根腐病致病菌对植物根尖的侵染。
下述实验中，以具体的假单胞菌UW4和小麦为例，进行了相关工程菌改造和具体生物防治实验，具体试验过程简介如下。
（一）获得flg22基因
所述flg22基因，碱基序列（99bp）如SEQ ID No.1所示，具体如下：
AACCGTGCTACCGATGCACTTTCGACCTCGATGCAACGTCTGTCTTCCGGCCTGAAAATCAACAGCGCCAAGGACGACGCCGCCGGCCTGCAGATCGCA；
实际实验中，为便于后续检测，委托北京华大生物科技公司合成提供了含有flg22基因的flg22-EGFP片段。
所述flg22-EGFP基因片段，序列两端分别带有Xho1酶和BamHI酶切位点序列、氨苄抗性基因启动子序列、编码丁香假单胞菌flg22的序列（也是信号肽序列）、编码EGFP的序列和编码6His标签序列；序列设计（957bp）如SEQ ID No.2所示，具体片段序列如下：
CCGCTCGAG CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAACCGTGCTACCGATGCACTTTCGACCTCGATGCAACGTCTGTCTTCCGGCCTGAAAATCAACAGCGCCAAGGACGACGCCGCCGGCCTGCAGATCGCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGcatcaccaccaccatcacGGATCCGCG；
上述序列结构中：
序列上游的“CTCGAG”、下游的“GGATCC”分别为Xho1酶和BamHI酶切位点序列；
序列中的
“CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAAC CCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGT”部分序列为氨苄抗性基因启动子序列；
序列中的
“AACCGTGCTACCGATGCACTTTCGACCTCGATGCAACGTCTGTCTTCCGGCCTGAAAATCAACAGCGCCAAGGACGACGCCGCCGGCCTGCAGATCGCA”部分序列为flg22编码序列；
序列中的“catcaccaccaccatcac”序列为编码6His序列。
（二）构建含有flg22基因的重组质粒
以pBBR1AmP-EGFP质粒（pBBR1MCS2-pAmp-EGFP）为载体，重组整合步骤（一）中的flg22基因以获得重组质粒；
以具体flg22-EGFP基因片段为例，具体重组时：
将pBBR1AmP-EGFP质粒与flg22-EGFP基因片段分别进行Xho1、BamHI双酶切，然后利用连接酶进行连接，并进一步转化、筛选、获得构建正确的可表达flg22-EGFP的重组质粒pBBR1Amp-flg22-EGFP。
具体酶切体系（50µl）可参考如下：
pBBR1Amp-EGFP质粒，12µl；
XhoI，1µl；
BamHI，1µl；
10×NEBuffer，5µl；
水，31µl；
37℃酶切40min；酶切完成后，将酶切后的线性化pBBR1Amp-EGFP质粒进行电泳检测和进行切胶回收。
具体连接时，10µl连接体系参考设计如下：
酶切后所回收线性化pBBR1Amp-EGFP质粒，2µl；
flg22-EGFP基因，1µl；
2×ClonExpress Mix，5µl；
ddH2O，2µl；
16℃连接过夜。
对连接后产物进一步取样进行电泳检测，结果如图1所示。可以看出，连接产物大小符合预期。
进一步将上述连接产物（即所构建的pBBR1Amp-EGFP-Flg22质粒）转化至大肠杆菌，并进行筛选鉴定。
鉴定验证过程中，对所挑取阳性转化子进行菌液PCR验证时，PCR反应体系可参考如下：
转化子菌液，2µl；
Flg22上游引物，1µl；
Flg22下游引物，1µl；
2×Taq PCR Star Mix，12µl；
ddH2O，4µl；
Flg22上游引物：5’-CATCACCACCACCATCACCAG-3’，
Flg22下游引物：5’-GGCGATCTGCAGGCCGGCGGC-3’；
PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、3s，31个循环；72℃、10min。
PCR反应程序结束后，吸取5 µl的 PCR产物进行凝胶电泳检测，结果如图2所示。分析可以看出，其条带大小符合预期，表明所鉴定的为阳性转化子。
进一步将阳性转化子进行测序鉴定，并与目标序列进行对比，确保转化正确。
（三）三株杂交法构建表达flg22-EGFP的工程菌
将步骤（二）所构建的重组质粒pBBR1Amp-flg22-EGFP转化大肠杆菌E. coliDH5α，筛选转化正确菌株作为供体菌（相关操作参考前述“步骤（二）”或者现有技术即可，不再赘述）；
作为对照，同步将原始空白质粒pBBR1Amp-EGFP转化大肠杆菌E. coliDH5α，以此作为供体对照菌；
将大肠杆菌JM101（PRK2013）（含有结合辅助质粒pRK2013）作为帮助菌；
以假单胞菌（假单胞菌UW4）作为受体菌。
具体三株杂交转化过程参考如下操作。
首先，将供体菌、帮助菌和受体菌分别按1%（v/v）接菌量分别接种至液体LB培养基中，220 rpm振荡培养过夜（培养温度可参考分别为：37℃、37℃、30℃）；再取过夜培养的三种菌菌液分别以1%（v/v）分别接种至液体LB培养基中，培养4 h（培养条件参考前述）以实现稳定扩增。
随后，按照如下顺序进行菌体杂交：
取2 mL的供体菌菌液，12000 rpm离心1 min，弃上清液，然后用500 μL 0.85%的NaCl溶液重悬菌体，12000 rpm离心1 min，弃上清液；
取1 mL帮助菌液加入到上述同一离心管中，摇匀后12000 rpm离心1 min，弃上清液，用500 μL 0.85%的NaCl溶液重悬菌体，12000 rpm离心1 min，弃上清液；
再取2 mL的受体菌加入上述同一离心管中，摇匀后12000 rpm离心1 min弃上清液，用500 μL 0.85%的NaCl溶液重悬菌体，12000 rpm离心1 min，弃上清液；
最后用75 μL 0.85%的NaCl溶液重悬菌体。
最后，将上述混合菌液滴加平铺于固体培养基表面的硝酸纤维素膜上进行培养（恒温培养箱中正置培养24 h，培养温度30℃）；培养完成后用750 μL 0.85%的NaCl溶液将硝酸纤维素膜上的菌体冲洗下来，梯度稀释后涂布在抗性（100 μg/mL Kana + 100 μg/mLAmp）LB固体平板上进行筛选培养，直到长出转化子（30℃正置培养16 h左右）；
挑取筛选所得转化子接种至LB液体培养基，30℃、220 rpm培养16 h左右，进行菌液PCR鉴定和测序鉴定，获得分别表达表达EGFP和flg22-EGFP的转化正确工程菌，分别命名为假单胞菌UW4-EGFP和UW4-flg22-EGFP。
（四）Western blot鉴定
将步骤（三）所得假单胞菌UW4-EGFP-flg22和UW4，分别在LB液体培养基中，30 ℃、220 rpm过夜培养，培养结束后，12000 rpm离心1 min，收集上清液，用超滤管进行浓缩（浓缩比为25:1），使用Western blot试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品）检测蛋白表达情况（通过分泌液中蛋白是否带有6His标签来鉴定目标flg22-EGFP蛋白）。
部分检测结果如图3所示。分析可以看出：
flg22-EGFP的分子量约为31 kD；而所选择的2个假单胞菌UW4-flg22-EGFP转化子的培养液上清中均检测到flg22-EGFP蛋白，但假单胞菌UW4-EGFP转化子的培养液上清中则没有检测到flg22-EGFP蛋白。这一结果进一步证明相关工程菌的构建是符合技术预期的，可以满足后续实验需要。
实施例2
在实施例1基础上，以小麦和具体根腐病致病菌为例，发明人对实施例1构建所得工程菌的生物防治效果进行实验检测，具体试验过程简介如下。
（一）小麦育苗
将小麦种子先用无菌水浸泡一夜，然后浸泡在70%的酒精中1 min，无菌水冲洗5次，再浸泡在2%次氯酸钠溶液中5 min，无菌水冲洗5次，接着浸泡在0.1%氯化汞溶液中5min，再次用无菌水冲洗5次；
将小麦种子均匀地放在含有发芽纸的1%琼脂平板上，28℃恒温培养促使小麦发芽。
（二）假单胞菌菌株在小麦根际定植实验
取平板发芽3 d后根长2-3厘米左右的小麦苗，将其根系在5 ml假单胞菌UW4菌株菌悬液（OD600=1.0）中浸泡30 min，然后移入装有15 mL无菌水的无菌生长袋中，28℃培养；
以无菌水浸泡根系作为对照。
（三）假单胞菌菌株和致病菌立枯丝核菌混合接种小麦根系实验
刮取PDA平板28℃培养7 d的立枯丝核菌表面菌丝，在加有玻璃珠的无菌水中震荡20 min，适当稀释，得到约为2×104CFU/mL的菌悬液；
取平板发芽根长2-3厘米左右的小麦苗，将其根系在2.5 ml假单胞菌UW4菌株菌悬液（OD600= 2.0）和2.5 mL 2×104CFU/mL的立枯丝核菌菌悬液的混合液体中浸泡30min；然后移入装有15mL无菌水的无菌生长袋中，28℃培养；
以5 ml无菌水和5 ml的 2×104CFU/mL的立枯丝核菌菌悬液浸泡根系分别作为对照。
（四）实验结果
（1）小麦根边缘细胞活性氧情况
由于活性氧情况是细胞活性情况的一种直观指标，因此，发明人对改造后工程菌UW4-flg22-EGFP所分泌的flg22-EGFP能否诱导小麦根边缘细胞产生活性氧情况进行了检测。
检测时：将1 μM的H2DCFDA活性氧（ROS)荧光探针（购自苏州科铭生物技术有限公司）和假单胞菌UW4-flg22-EGFP菌悬液（OD600= 2.0）加入到培养3 d的小麦根部，分别于反应0 min、10 min、20 min时用激光共聚焦显微镜观察是否有荧光；
同时，以假单胞菌UW4-EGFP处理作为对照。
实验结果如图4所示。分析可以看出：
假单胞菌UW4-flg22-EGFP菌悬液与小麦根一起孵育时，从0 min起根边缘细胞即开始产生活性氧，随后第10 min和第20 min产生大量活性氧（图4A）；
而假单胞菌UW4-EGFP菌悬液与小麦根一起孵育时，从0 min至第20 min仅可观察到微弱荧光，推测认为该荧光可能来自菌体合成的荧光蛋白，根边缘细胞并没有产生活性氧（图4B）；
另外，假单胞菌UW4菌悬液与小麦根一起孵育时，根边缘细胞同样没有产生荧光（图4C）。
综合上述结果可以看出，改造后工程菌UW4-flg22-EGFP所分泌的flg22-EGFP可以有效激发根尖细胞的免疫反应，对于突破根边缘细胞防御机制具有关键性作用。
（2）假单胞菌在小麦根际定植量情况
由于本发明根本目的之一在于实现有益菌在根尖定植，因此，小麦根部假单胞菌定植情况是重要技术指标，定植量具体测定时：
首先，取小麦根部进行称重和根长测量；
随后，取不同试验组处理后小麦根尖1 cm，放在1.5 mL的离心管中，添加1 mL的无菌水，用1.5ml离心管玻璃研磨棒碾磨，研磨均匀后进行平板稀释计数。
进一步地，取不同试验组处理后小麦根尖1 cm，采用戊二醛固定后，进行扫描电镜观察，以便进行直观判定。
在将小麦幼苗根系接种假单胞菌UW4不同菌株菌悬液后，培养7d后，扫描电镜观察（放大倍数3000×）根尖端和其后伸长区菌体定植情况，结果如图5所示。可以看出：
假单胞菌UW4-flg22-EGFP在根尖的定植量明显高于UW4-EGFP和UW4。
进一步定量测定这些菌株在根际的定植量，统计结果如图6所示，也进一步证明了UW4-flg22-EGFP在根尖的定植量显著高于UW4-EGFP和UW4。
（3）对根腐病致病菌立枯丝核菌侵染小麦根的防治效果
将小麦幼苗根系接种假单胞菌UW4不同菌株和立枯丝核菌菌悬液，并培养7 d后，分别定量测定UW4菌株在根际的定植量和相关生理指标。结果如图7所示。分析可以看出：
就定植量而言（图7A），即使在致病菌存在条件下，UW4-flg22-EGFP在根尖的定植量仍然显著高于UW4-EGFP的定植量46.3%；
而就根鲜重和苗高指标而言（图7B、7C），致病菌存在条件下，根鲜重、苗高显著受到显著影响，而UW4-flg22-EGFP和UW4-EGFP与立枯丝核菌共接种小麦根系后，对小麦苗根鲜重和苗高的影响与未接菌的对照没有差异，但都显著高于单接立枯丝核菌，这也结果说明有益菌的应用能够有效竞争致病菌的生态位。
但进一步的根尖褐变情况观察结果表明（图8），UW4-EGFP与立枯丝核菌共接种小麦根系中，小麦根尖出现褐变的比例明显高于UW4-flg22-EGFP和立枯丝核菌共接种的小麦根系，这一结果表明：在面临致病菌情况下，flg22对于进一步提高有益菌UW4在根尖定植、以及提高有益菌UW4的生态位竞争能力，都是具有益处的。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南农业大学
河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一种定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
aaccgtgcta ccgatgcact ttcgacctcg atgcaacgtc tgtcttccgg cctgaaaatc 60
aacagcgcca aggacgacgc cgccggcctg cagatcgca 99
<210> 2
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 2
ccgctcgagc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 60
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgaac 120
cgtgctaccg atgcactttc gacctcgatg caacgtctgt cttccggcct gaaaatcaac 180
agcgccaagg acgacgccgc cggcctgcag atcgcagtga gcaagggcga ggagctgttc 240
accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 300
gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 360
accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 420
cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 480
cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 540
cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 600
gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 660
aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 720
cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 780
ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 840
aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 900
atcactctcg gcatggacga gctgtacaag catcaccacc accatcacgg atccgcg 957

Claims (5)

1.一种定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法，其特征在于，所述工程菌为假单胞菌，该方法通过在工程菌基因组中转入flg22基因来提高植物对根腐病致病菌的抗性；
所述假单胞菌为美国农业研究菌种保藏中心保藏编号为NRRL B-50193的假单胞菌（Pseudomonas sp.）UW4菌株；
改造方法包括如下步骤：
（一）获得flg22基因或者设计含有flg22基因的重组用基因片段
所述flg22基因，碱基序列如SEQ ID No.1所示；
或者设计含有如SEQ ID No.1所示flg22基因的重组用基因片段；
（二）构建含有flg22基因的重组质粒
以在大肠杆菌中外泌性表达flg22基因质粒为载体，重组整合步骤（一）中的flg22基因以获得重组质粒；
（三）三株杂交法构建表达flg22的工程菌
将步骤（二）所构建的重组质粒转化大肠杆菌，筛选转化正确菌株作为供体菌；
将含有结合辅助质粒pRK2013的大肠杆菌作为帮助菌；
以假单胞菌作为受体菌；
三株杂交时：
首先，将供体菌、帮助菌、受体菌分别培养扩增；
随后，按照如下顺序进行菌体杂交：
先将供体菌菌液离心后，收集菌体，并用0.85%的NaCl溶液重悬，加入帮助菌菌液后，再次离心后，收集菌体，并再次用0.85%的NaCl溶液重悬，最后，加入受体菌菌液后，再次离心后，用0.85%的NaCl溶液重悬；
最后，将上述混合菌液滴加平铺于固体培养基表面的硝酸纤维素膜上进行培养，培养完成后用0.85%的NaCl溶液将硝酸纤维素膜上的菌体冲洗下来，稀释后涂布在抗性培养基平板上进行筛选，对筛选所得阳性转化子进行鉴定以获得表达flg22基因的假单胞菌工程菌。
2.如权利要求1所述定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法，其特征在于，步骤（二）中，所述可在大肠杆菌中外泌性表达flg22基因质粒为质粒pBBR1MCS，或者基于质粒pBBR1MCS进一步改造的 pBBR1MCS2。
3.如权利要求1所述定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法，其特征在于，步骤（一）中，所述含有flg22基因的重组用基因片段为flg22-EGFP基因片段；
所述flg22-EGFP基因片段序列如SEQ ID No.2所示。
4.利用权利要求1~3任一项所述定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法改造所得工程菌。
5.权利要求4所述工程菌在小麦根腐病防治中应用，其特征在于，用于防治根腐病致病菌所致根腐病；所述根腐病致病菌为：立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）。
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