CN111235083A - 表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌，是将如SEQ ID NO:1所示的几丁质酶编码基因运用同源重组技术导入荧光假单胞菌菌株ZX得到的重组工程菌，菌株ZX在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.18755。还公开了该生防重组工程菌的构建方法：一、pUC19‑ArmGm质粒的构建；二、重组质粒pUC19‑ArmGm‑chi的构建；三、打靶质粒和供体菌的构建；四、构建重组工程菌。还公开了该生防重组工程菌在防治植物病害中的应用。该重组工程菌能高效分泌胞外几丁质酶，产生的几丁质酶和荧光假单胞菌工程菌协同作用，显著提高该拮抗菌株生防效力。

Description

表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌及其 构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程和生物防治技术领域，具体涉及一种表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

大多数水果的pH较低，采后主要受病原真菌的侵染，而蔬菜则受到病原真菌和病原细菌的双重危害，但以真菌为主。真菌病害是导致采后果蔬腐烂的主要原因，每年都造成巨大的商业损失和资源浪费。传统控制采后果蔬病害主要依赖于化学杀菌剂，如环酰菌胺、噻苯咪唑、咯菌腈、嘧菌酯等，但长期大量施用合成杀菌剂可能导致化学残留、环境污染、病原菌耐药性出现和增强等问题，甚至会降低食品的安全性。近年来，生物防治由于其无毒环保、安全有效等特点，备受关注和青睐。然而，拮抗微生物的生防效力很不稳定，易受环境影响，干旱、洪涝、高渗透压、低温、高温、紫外辐照等生态环境中的各种胁迫都有可能干扰拮抗微生物的生长繁殖，进而影响其抑菌活性和生防效力。随着生物学技术的迅猛发展，尤其是分子生物学技术的广泛渗入，为解决这一问题提供了一条新思路和新途径。通过基因工程技术，可将外源抗病基因，如几丁质酶基因、β-1,3-葡聚糖基因、抗菌肽基因等导入拮抗微生物细胞，使得拮抗菌能在和病原真菌进行营养与空间竞争的同时，高效分泌具有抑菌作用的活性物质，从而增强拮抗菌的生防效力。

如前所述，病原真菌是引起采后果蔬腐烂的罪魁祸首，而致病真菌的细胞壁主要由几丁质组成。几丁质是一种由N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1,4-糖苷键连接聚合而成的直链多糖，几乎所有的高等植物体内都含有能水解几丁质的几丁质酶，但植物体内并不存在几丁质酶的作用底物。由于几丁质酶可以分解病原真菌的细胞壁，破坏其结构，从而抑制病原菌的生长，且在水解过程中释放出的小分子物质又可作为激发子进一步诱导寄主的抗病性，因此几丁质酶一直是抗病原真菌基因工程的研究热点之一。中国专利申请CN101679995A《线虫几丁质酶基因用于控制植物寄生性线虫的用途》，CN104975034A《羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用》，CN105734033A《一种杜仲几丁质酶编码基因(EuCHIT1)及其应用》，CN1485425A《棉花几丁质酶及其编码基因与应用》，CN104878028A《漾濞大泡核桃几丁质酶基因JsCHI1及应用》，CN106148368A《菊花几丁质酶CmCHI基因及其应用》，CN103290038A《优化的木霉几丁质酶基因和大豆葡聚糖酶基因和双元表达载体及其应用》，CN1369558A《木霉几丁质酶以及表达该酶的基因》，这些专利申请都是将植物或微生物几丁质酶基因转入烟草、水稻、小麦、玉米等作物中，培育抗病品种或抗逆品种，从而增强作物植株的抗病性或抗逆性。然而，由于病原菌生理小种的高度变异特性，而抗病基因通常仅对病原菌的某个生理小种起作用，因此，转抗病基因的抗病策略并不能在农业生产上长期使用。在病害防治领域，更多的是将某种植物或微生物几丁质酶基因克隆出来，而后在大肠杆菌或酵母中高效表达，最后将表达产物制备成生物杀菌剂，从而实现对作物病害的防控。如中国专利申请CN102433351A《绿色木霉几丁质酶基因Tvchi及其表达产物与应用》，CN104120116A《冬虫夏草中国被毛孢几丁质酶F、编码基因及其应用》，CN104130992A《来自冬虫夏草中国被毛孢的几丁质酶A、编码基因及应用》，CN109258693A《重组几丁质酶在杀虫或抑菌方面的应用》，CN103609673A《含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂》等。但这些方法操作复杂，技术要求和设备要求很高，工程菌的大规模培养、活性产物的分离与纯化以及生物杀菌剂的制备，无一不需要大量的人力、物力和财力，且表达产物几丁质酶是一种生物蛋白酶，极易失活，如何有效保持该酶的稳定性和生物活性也是一个很大的问题。

而在生物防治领域，导入外源几丁质酶基因，构建重组生防工程菌的研究多集中在拮抗真菌上，如中国专利申请CN104988080A《一种转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其应用》，CN101492646《一株绿色木霉工程菌及其应用》，CN101724573A《一种高效表达几丁质酶编码基因和β-1,3-葡聚糖酶编码基因的木霉生防重组工程菌及其应用》等，而拮抗细菌则多为利用苏云金杆菌构建基因工程菌，如CN100999718A《几丁质酶基因重组的苏云金杆菌工程菌》，但其主要目的是增强苏云金杆菌对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫的杀虫活性，而不是防治采后果蔬真菌病害。此外，上述专利申请中重组工程菌的构建方法多为基于限制性内切酶和连接酶体系的DNA重组技术，但在限制性内切酶的使用过程中常常会受到酶切位点的限制，大片段的DNA在体外操作也存在很大困难，加之试验周期长、效率低，已逐渐被近年来兴起的同源重组技术所取代。同源重组技术突破了酶切位点的限制，在靶序列两翼序列已知的条件下，就可以在体内对染色体DNA或质粒进行敲除、敲入、替换、突变、克隆等传统DNA重组技术无法做到的复杂的基因操作。目前同源重组技术主要包括两大类：依赖于RecA的大肠杆菌内源性重组系统和不依赖RecA的重组系统(Red重组系统)，相较而言，后者具有极为显著的优势，因为Red重组系统能利用线性DNA分子进行体内同源重组，同源臂也缩短到30～50bp，不再需要通过多个步骤事先建立携带常同源臂的打靶载体，重组效率也更高。另外，这些专利申请选用的几丁质酶编码基因来源的物种与重组工程菌的原始菌株分别来自不同的物种，亲缘关系很远，因而工程菌的几丁质酶产量不高，生物活性也不尽如人意。

细菌种类繁多，生命力旺盛，营养需求低，繁殖速度惊人，且大都可以人工培养和调控，一直以来，拮抗细菌都是作物和采后果蔬病害生物防治中的中坚力量，有些拮抗细菌还同时具有生物防治和促进作物生长的双重作用，其中，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)是最具应用价值的一类生防菌和根际促生菌。P.fluorescens在自然界分布广泛，水体、土壤、植株表面等具有大量天然P.fluorescens菌落存在，P.fluorescens繁殖迅速，施用方便，对人和环境无害，许多菌株能在有效抑制病原真菌的同时，促进作物的生长和增产。近年来，一些学者用P.fluorescens成功防治了草莓、苹果、香蕉和柑橘等多种果蔬的侵染性病害，极大地扩展了P.fluorescens的应用范围。目前，分子生物学技术的迅猛发展和广泛渗入使得P.fluorescens获得更诱人的生防效果。如Yang等选用与P.fluorescens亲缘关系较近的丁香假单胞菌(Pseudomonas synxantha)2-79，将2-79的酚嗪-1-羧酸合成基因导入P.fluorescens中，使得重组菌HC1-07PHZ能同时产生酚嗪-1-羧酸和环脂肽，显著增强了其对小麦全蚀病的生防效力(Yang M,Mavrodi D V,Mavrodi O V,et al.Construction of a recombinant strain of Pseudomonasfluorescens producing both phenazine-1-carboxylic acid and cyclic lipopeptidefor the biocontrol of take-all disease of wheat[J].European Journal ofPlantPathology,2017,149(3):683-694)。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌及其构建方法。

本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

一种表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌，是将如SEQ ID NO:1所示的几丁质酶编码基因运用同源重组技术导入荧光假单胞菌菌株ZX得到的重组工程菌，菌株ZX在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCCNO.18755。

上述表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌的构建方法，包括如下步骤：

一、pUC19-ArmGm质粒的构建：(1)扩增重组手臂：提取荧光假单胞菌菌株ZX的总DNA，以总DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到chi基因片段；(2)扩增庆大霉素抗性基因；(3)将步骤(1)、(2)中得到的扩增片段做融合PCR，得到融合PCR产物；(4)用限制性内切酶酶切载体pUC19，将酶切产物与融合PCR产物用连接酶连接起来，连接反应产物转入大肠杆菌进行克隆，得到质粒pUC19-ArmGm；

二、重组质粒pUC19-ArmGm-chi的构建：(1)目的片段的酶切和连接：将如SEQ IDNO:1所示的chi基因合成后克隆入中间质粒得到重组中间质粒，分别利用限制性内切酶对重组中间质粒、质粒pUC19-ArmGm进行酶切，将两个酶切产物用连接酶连接起来得到重组质粒；(2)重组质粒的克隆：连接反应产物转入大肠杆菌进行克隆，挑取阳性克隆，得到质粒pUC19-ArmGm-chi；

三、打靶质粒和供体菌的构建：用限制性内切酶将打靶片段从pUC19-Arm-Gm-chi质粒上切割下来，再克隆入自杀质粒，得到打靶质粒；将打靶质粒转入大肠杆菌克隆，筛选阳性克隆，得到供体菌；

四、构建重组工程菌：利用供体菌通过接合反应将打靶质粒转移到荧光假单胞菌ZX进行打靶实验，筛选基因组插入chi的阳性克隆，即得到重组工程菌。

在上述技术方案中，步骤一中chi基因的扩增引物对为Chi-5F/Chi-5R、Chi-3F/Chi-3R，引物序列为：

Chi-5F：5’ATATCTAGAGTGCTGGATCTGTGCGAGGAGTAA3’，

Chi-5R：5’CATGTCTTGGCTTTGCAGGGCTG3’，

Chi-3F：5’GTGTGCACTTACATTTAAGTGGGCACC3’，

Chi-3R：5’ATATCTAGAGGTCGAGATTGGGAGAAGAAGTCATGC3’。

步骤一中扩增庆大霉素抗性基因是以pJQ200SK质粒为模板，用引物Chi-GmF和Chi-GmR扩增得到，引物序列为：

Chi-GmF：

5’CAGCCCTGCAAAGCCAAGACATGATATCAGAAATGCCTCGACTTC3’，

Chi-GmR：

5’GGTGCCCACTTAAATGTAAGTGCACACTTGTGACAATTTACCGAACAAC3’。

步骤一中用限制性内切酶Sma I酶切pUC19载体；步骤二中的中间质粒为pET28a，酶切pUC19-ArmGm的限制性内切酶为EcoR V，酶切重组中间质粒的限制性内切酶为Sma I。

步骤三中用Xba I限制性内切酶将打靶片段从pUC19-ArmGm-chi质粒上切割下来，自杀质粒为pCVD442，克隆用大肠杆菌为E.coliβ2155。

本发明的另一目的是提供一种表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌在防治植物病害中的应用。

在上述技术方案中，所述植物病害是指由病原真菌引起的植物病害。

本发明的有益效果是：(1)选用的几丁质酶编码基因来自与重组工程菌株原始菌株亲缘关系较近的菌株，采用Red重组系统进行供体菌和受体菌的同源重组，简单易行，基因重组高效，几丁质酶产量高且活性强。(2)本发明构建的荧光假单胞菌重组工程菌能高效分泌胞外几丁质酶，且几丁质酶活力较高，液体发酵培养12h后，几丁质酶活力高达55.5U/mL。(3)本发明构建的荧光假单胞菌重组工程菌产生的几丁质酶和荧光假单胞菌工程菌协同作用，能显著提高该拮抗菌株的生防效力，对采后柑橘青霉病和绿霉病的防治效果比原始菌株分别提高了30％和25％，同时，显著降低了果实的病斑直径。

附图说明

图1是荧光假单胞菌重组手臂和庆大霉素抗性基因融合PCR电泳图，其中，M是DNAmarker；1是融合PCR产物。

图2是重组质粒克隆的菌落PCR电泳图，其中，M：DNA marker；1-11：第1-11号克隆的菌落。

图3是P.fluorescens ZX及其重组工程菌对采后锦橙青霉病和绿霉病的防治效果，其中，A为发病率，B为病斑直径。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明所用主要试剂来源如下：

pJQ200SK质粒、pUC19载体、E.coli TOP10、FastAP去磷酸化酶、质粒pET28a、自杀质粒pCVD442、E.coli DH5αλπ感受态细胞、E.coliβ2155，均购自上海生工生物工程有限公司。

几丁质酶活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

本发明所用培养基如下：

Luria-Bertani(LB)培养液：10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母提取物，10.0g氯化钠，1000mL蒸馏水。

胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB)培养基：17.0g胰酪蛋白胨，3.0g大豆蛋白胨，2.5g葡萄糖，5.0g氯化钠，2.5g磷酸氢二钾，1000mL蒸馏水。

几丁质酶鉴别培养基：7.0g硫酸铵，1.0g磷酸氢二钾，0.1g七水合硫酸镁，0.5g营养肉汤，5.0g几丁质胶体，15.0g琼脂，1000mL蒸馏水。

实施例1

申请人在研究过程中发现一株P.fluorescens ZX对多种常见的采后果蔬病原真菌具有强烈的抑制作用，研究结果表明，该菌株主要是通过同病原真菌进行营养竞争和空间竞争以及诱导寄主抗性等方式发挥生防作用，不能产生几丁质酶等水解酶。该菌株ZX，经分子生物学技术鉴定为细菌域变形菌门变形菌纲假单胞菌目假单胞菌科假单胞菌属(Pseudomonae)的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。将菌株ZX于2019年10月送中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)进行保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年10月28日，保藏编号为CGMCC NO.18755，分类名为荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens。

很早就有报道，一些P.fluorescens菌株具有几丁质酶的编码基因，能产生胞外几丁质酶，如能选出与ZX亲缘关系很近的P.fluorescens菌株，运用同源重组技术将其几丁质酶编码基因导入ZX中，使得重组后的工程菌能在同病原真菌进行营养与空间竞争的同时，还能高效分泌胞外几丁质酶，这也能有效拓宽其抑菌谱，显著提高其生物防治效果，从而有效改善拮抗微生物普遍存在的稳定性问题，基于此研究思路，申请人做了相关研究。

一、几丁质酶编码基因来源与合成

查询GenBank，选用与初始菌株ZX亲缘关系较近的Pseudomonas fluorescensA506的几丁质酶(Chitinase，chi)编码基因(如下，SEQ ID NO:1，单下划线部分为几丁质结合域蛋白编码基因，双下划线部分为几丁质酶编码基因)，由上海生工生物技术公司合成。

二、pUC19-ArmGm质粒的构建

用高保真酶分别从荧光假单胞菌基因组上扩增上下游同源重组手臂、从pJQ200SK质粒上扩增庆大霉素抗性基因(Gm)，融合PCR连接上游同源重组手臂-Gm-下游同源重组手臂，并将其克隆入pUC19/Sma I位点，得到pUC19-ArmGm质粒。具体方法如下：

(1)重组手臂的扩增

提取荧光假单胞菌ZX的总DNA，以总DNA为模板进行PCR扩增，用引物对Chi-5F(5’ATATCTAGAGTGCTGGATCTGTGCGAGGAGTAA3’，SEQ ID NO:2)和Chi-5R(5’CATGTCTTGGCTTTGCAGGGCTG3’，SEQ ID NO:3)，Chi-3F(5’GTGTGCACTTACATTTAAGTGGGCACC3’，SEQ ID NO:4)和Chi-3R(5’ATATCTAGAGGTCGAGATTGGGAGAAGAAGTCATGC3’，SEQ ID NO:5)分别扩增重组手臂。引物Chi-5F和Chi-3R中均含有Xba I酶切位点(引物序列中的下划线部分)同时，引物Chi-5F的3’端含有终止密码子TAA。PCR反应体系如下：荧光假单胞菌ZX DNA 0.5μL，10×Pfubuffer 5.0μL，dNTP(25mM)0.4μL，引物Chi-5F/5F(50pmol/μL)各0.5μL或者引物Chi-3F/3R(50pmol/μL)各0.5μL，Pfu DNApolymerase(5U/μL)0.5μL，加ddH₂O补至50.0μL；PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性0.5min，62℃退火0.5min，72℃延伸1min，共循环10次；72℃延伸7min。

(2)庆大霉素抗性基因的扩增

以pJQ200SK质粒为模板，用引物Chi-GmF(5’CAGCCCTGCAAAGCCAAGACATGATATCAGAAATGCCTCGACTTC3’，SEQ ID NO:6)和Chi-GmR(5’GGTGCCCACTTAAATGTAAGTGCACACTTGTGACAATTTACCGAACAAC3’，SEQ ID NO:7)扩增庆大霉素抗性基因(Gm)，其中，引物Chi-GmF上带有EcoRV酶切位点(引物序列中的下划线部分)。PCR反应体系如下：pJQ200SK质粒(10ng/μL)0.5μL，10×Pfubuffer 5.0μL，dNTP(25mM)0.4μL，Chi-GmF(50pmol/μL)0.5μL，Chi-GmR(50pmol/μL)0.5μL，Pfu DNA polymerase(5U/μL)0.5μL，加ddH₂O补至50.0μL；PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸1min，共循环10次；72℃延伸7min。

(3)融合PCR

将步骤(1)、(2)中得到的扩增片段同时纯化，以Chi-5F和Chi-3R为引物，融合PCR连接上游同源重组手臂-Gm-下游同源重组手臂。PCR反应体系如下：上述的Chi 5F/5R PCR产物5.0μL、Chi-3F/3R PCR产物5.0μL、Chi-GmF/R PCR产物5.0μL，10×Pfubuffer 5.0μL，dNTP(25mM)0.4μL，Chi-5F(50pmol/μL)0.5μL，Chi-3R(50pmol/μL)0.5μL，Pfu DNApolymerase(5U/μL)0.5μL，加ddH₂O补至50.0μL；PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性0.5min，62℃退火0.5min，72℃延伸3min，共循环25次；72℃延伸7min。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，该融合PCR产物DNA分子量约为2500bp。

(4)融合PCR产物的克隆

用限制性内切酶Sma I处理pUC19载体，30℃反应4h。酶切产物和融合PCR产物进行电泳分离和凝胶纯化，分别洗脱于50μL无菌去离子水，各取4μL，两者混合，用T4 DNA连接酶将两者连接起来。连接反应产物直接通过化学转化方法进入E.coli TOP10感受态细胞，在LB平板(含氨苄青霉素50μg/mL和庆大霉素25μg/mL)上于37℃培养至单克隆形成。在双抗性平板上生长的克隆含有融合PCR产物，随机挑选1个克隆制备质粒，命名为pUC19-ArmGm。

三、重组质粒pUC19-ArmGm-chi的构建

将如SEQ ID NO:1所示的chi基因合成后克隆入质粒pET28a/Sal I位点，得到质粒pET28a-chi；用Sma I限制性内切酶将chi基因从pET28a-chi上切割下来，再克隆入pUC19-ArmGm，得到含有完整打靶片段的重组质粒pUC19-ArmGm-chi。

具体方法如下：

(1)目的片段的酶切和连接

利用EcoRV限制性内切酶对pUC19-ArmGm进行酶切，37℃反应2h，加入FastAP去磷酸化酶，继续于37℃反应1h；利用Sma I限制性内切酶于30℃酶切pET28a-chi质粒2h；酶切完成后，两管产物直接进行电泳分离和凝胶纯化，分别洗脱于50μL无菌去离子水，各取4μL，两者混合，用T4 DNA连接酶将两者连接起来。

(2)重组质粒的克隆

连接反应产物直接通过化学转化方法进入E.coli TOP10感受态细胞，在LB平板(含氨苄青霉素100μg/mL)上于37℃培养至单克隆形成。随机挑选11个克隆，用引物Chi-5F和Chi-3R进行扩增鉴定。电泳结果如图2所示，其中8个克隆应含有chi插入片段(该片段DNA大小约为4500bp)，取第2号克隆的PCR产物进行测序验证，结果显示与设计一致，此克隆命名为pUC19-ArmGm-chi。

四、打靶质粒pCVD442-ArmGm-chi和供体菌β2155/pCVD442-ArmGm-chi的构建

大量制备pUC19-ArmGm-chi质粒，用Xba I限制性内切酶将打靶片段从pUC19-ArmGm-chi质粒上切割下来，再克隆入自杀质粒pCVD442，得到打靶质粒pCVD442-ArmGm-chi。具体方法如下：

(1)接合用自杀质粒的构建

大量制备pUC19-ArmGm-chi质粒，提取该质粒的DNA，用Xba I限制性内切酶在37℃下分别对pCVD442自杀质粒和pUC19-ArmGm-chi质粒酶切2h后，加入FastAP去磷酸化酶，继续于37℃反应1h，而后分别进行电泳分离和凝胶纯化，并分别洗脱于50μL无菌去离子水，各取4μL，用T4 DNA连接酶将两者连接起来。连接反应产物直接通过化学转化方法进入E.coliDH5αλπ感受态细胞，在LB平板(含氨苄青霉素50μg/mL和庆大霉素25μg/mL)上于37℃培养至单克隆形成。在双抗性平板上生长的克隆含有完整打靶片段ArmGm-chi。随机挑选1个克隆制备质粒，此克隆用于后续的接合打靶实验，命名为pCVD442-ArmGm-chi。

(2)接合用供体菌的构建

pCVD442-ArmGm-chi通过电转化的方法转入E.coliβ2155，在LB平板(含氨苄青霉素50μg/mL和庆大霉素25μg/mL和0.5mM二氨基庚二酸)上于37℃培养至单克隆形成。这些克隆可作为供体菌用于后续的接合打靶实验，命名为β2155/pCVD442-ArmGm-chi。

五、重组工程菌的构建

通过接合反应将打靶质粒转移到荧光假单胞菌ZX进行打靶实验，在庆大霉素平板上筛选基因组插入chi的阳性克隆。具体方法如下：

(1)在TSB平板上划线接种荧光假单胞菌ZX，30℃培养至单克隆形成。挑单克隆入3mL TSB中，30℃、220r/min恒温振荡培养过夜；

(2)挑β2155/pCVD442-ArmGm-chi单克隆入3mL LB(含氨苄青霉素50μg/mL，庆大霉素25μg/mL和0.5mM二氨基庚二酸)，37℃、220r/min恒温振荡培养过夜；

(3)取500μL供体菌β2155/pCVD442-ArmGm-chi菌液与500μL受体菌(荧光假单胞菌ZX)菌液混合进行接合实验；

(4)分别取20、100、500μL接合后菌液涂布于含有庆大霉素(50μg/mL)的TSB平板，30℃培养数日，形成的克隆即为重组工程菌。

(5)用无菌牙签挑取单菌落，移入5mL NB培养液中，30℃、220r/min恒温振荡培养12h，将培养液移入无菌离心管中，6000r/min，离心10min，倒去上清，收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次，最后加入无菌水重悬，并用细菌浊度仪调节其浓度至0.33MCF(约为1～10⁸CFU/mL)，记为菌悬液；穿刺接种菌悬液于几丁质酶鉴别培养基上，30℃恒温培养3～5d，菌落周围产生透明圈，即表明重组菌能分泌胞外几丁质酶，重组工程菌构建成功。

六、重组工程菌产生的几丁质酶活性测定

按步骤“五、重组工程菌的构建”中的步骤(5)的方法制备重组工程菌菌悬液，按体积分数1％接种量接种菌悬液于NB培养液中，30℃、220r/min恒温振荡培养12h，6000r/min，离心10min，上清液即为粗酶液，而后用几丁质酶活性检测试剂盒(使用方法参照试剂盒说明书)测定几丁质酶活性。酶活性定义为：37℃下每mL发酵液每小时分解胶状几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量为一个酶活性单位。测定结果显示，发酵液酶活高达55.5U/mL。

七、重组工程菌对采后锦橙果实病害的防治效果

(1)锦橙果实达到商业成熟度后，采摘自重庆市北碚区歇马镇的有机果园，采后立即运回实验室，自然风预冷后，挑选均匀一致的健果，先用1％的次氯酸钠溶液浸泡消毒2min，而后自然晾干，随机分组备用。

(2)按步骤“五、重组工程菌的构建”中的步骤(5)的方法制备原始ZX菌株和重组工程菌的菌悬液，用灭菌不锈钢钉在果实赤道四侧各刺一个5mm(宽)×4mm(深)的孔，先分别接种20μL原始菌株和重组工程菌株菌悬液，2h后接种同等体积的病原菌孢子悬浮液，其中，Penicillium italicum孢子浓度为1×10⁴spores/mL，Penicillium digitatum孢子浓度为5×10³spores/mL，以无菌水作对照，逐果袋(聚乙烯保鲜袋)封，20℃、90％相对湿度恒温恒湿培养8d后，测定果实的发病率和病斑直径；每个处理30个果实，整个试验重复3次。

(3)结果如图3所示，P.fluorescens ZX菌悬液对采后锦橙青霉病(病原菌为Penicillium italicum)和绿霉病(病原菌为Penicillium digitatum)具有显著抑制作用(P＜0.05)，有效减缓了采后锦橙的病害进程。而重组工程菌的生防效力较原始菌株ZX显著提高(P＜0.05)，接种病原菌培养8d后，重组工程菌处理组的果实，青霉病和绿霉病发病率分别只有32％和30％，较原始菌株病害发生率分别降低了30％和25％；同时重组工程菌处理后的果实，病斑直径也较原始菌株处理组显著降低(P＜0.05)。

序列表

<110> 西南大学

<120> 表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌及其构建方法和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcgacccgg gtgtttatat atccagtatt tgcaggtctg cgcgctcatg aaccgaaaat 60

gagtgaaaaa tgggcctgtg gcaaaaaaaa gccactccgt taggttgagg tcctctcctt 120

caagaaagga gagttcttaa tcaaatcaat ggagtcacaa catgaacaaa ccacaaaccc 180

agacacctct tcgccatggt cgtgtcacat ccccttccag ccgtggcgca gtcgccgtgg 240

atctcggcct gctggagacc tggcaggtca atgaaatgga aggcggcaag aacttcccgg 300

cactgacggc cggtgcgttc ccggcgcctt atcaaaccga cagtgatagc gtcacccctc 360

ccgccgacgg ctttatcctc agcggtggca agaccgatgc ccgtgactgc attaacttca 420

cccacgagga aatggccaag aaacttggcc gcgccttcac ctggccgttg ctcaatgtcg 480

agccgggtca gaccttcaag gtcacctggg catacaccgc gccgcacacc acccgtggct 540

atcgctggct gatcaccaag gatggctggg atccgaaaca gcgcatcacc cgcgcacagc 600

tggaagccca gccgttcgct gaagacttct atgcccaggt gccgtactac agccatgcag 660

gcgaactgaa ggccaaggtc gatcatgaag tgaaactgcc gacccacaaa aagggccagc 720

atgtgattgt gttgatgtgg atcgtcgcca acaccggcaa cgccttctat caagccttcg 780

atgtggactt caaataagcc cgcaccgtta aacccacacg ttctgaagga ttagaacatg 840

tcaaagattg actttacctc actgcaatcg ccgctcaacg atgccgcttc gctgatgccg 900

agcattgccg gcaaaaagat cctcatgggc ttctggcata actggcctgc cggcccgagc 960

gatggctacc agcgtggcca gttcgccaat atcagcctgg cggatgtccc aaaggattac 1020

aacgtggtgg ccgtggcctt catgaagggc aacggtatcc caaccttcaa accgtacaac 1080

ctgtccgatg ccgagtttcg tcgccaggtg ggcgtgctga acagccaggg cagggcggtg 1140

ctgatttccc ttggcggcgc cgatgcacac atcgaactgc ataaaggcaa tgaacagcca 1200

ctggccagcg aaattatccg cctagtggaa acctatggct ttgatggcct ggatatcgat 1260

cttgaacaga gcgcgattga tttcgccgac aacaagactg tcctgcccgc cgccttgaag 1320

ctggtcaagg accactacgc ggctcaaggc aaacacttca tcatcagcat ggcgccggag 1380

tttccgtacc tcaccaccgc cggcaaatac gtcggttaca tccaggcgct ggaaggctat 1440

tacgacttca tcgccccgca gtattacaac cagggtggcg acggcatctg ggtgcaggag 1500

gtcaacagcg gcaacggcgc ctggattgct cagaacaacg acgcgatgaa ggaggacttt 1560

ctgttttacc tcaccgaaag tctagtgagc ggaacgcgcg ggtttaccaa aatcccggca 1620

gacaagttcg tcattggcct gcccgcgaac gtcgatgcgg ctgccaccgg ttatgtgatc 1680

aacccgacag ccgtgaccaa tacattcaag cgtttgcacg acaaaggatt gtcgatcaag 1740

ggcctgatga cctggtcggt gaattgggac aacgggatca gcaaagacca tgtgccctac 1800

aactgggaat tcagccgccg ttatgggccg atgatcaatg gcactgctct ctctggcctg 1860

gaacaggatg cggcggatct ggaggtcgcc aatcggcagt agcgcaaaag gggcctctgg 1920

cagacgtgcc agaggtcaaa ccgctaagct tctgatctga ctaaaatccg atgcctgttt 1980

gggcatcgga ttttttgcgt cacgctcaca ttgcgctgag cgttcctcaa accgagcccg 2040

ggtcgac 2047

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atatctagag tgctggatct gtgcgaggag taa 33

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgtcttgg ctttgcaggg ctg 23

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgtgcactt acatttaagt gggcacc 27

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatctagag gtcgagattg ggagaagaag tcatgc 36

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagccctgca aagccaagac atgatatcag aaatgcctcg acttc 45

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtgcccact taaatgtaag tgcacacttg tgacaattta ccgaacaac 49

Claims (8)

1.一种表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌，其特征在于，是将如SEQ ID NO:1所示的几丁质酶编码基因运用同源重组技术导入荧光假单胞菌菌株ZX得到的重组工程菌，菌株ZX在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.18755。

2.一种如权利要求1的表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、pUC19-ArmGm质粒的构建：(1)扩增重组手臂：提取荧光假单胞菌菌株ZX的总DNA，以总DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到chi基因片段；(2)扩增庆大霉素抗性基因；(3)将步骤(1)、(2)中得到的扩增片段做融合PCR，得到融合PCR产物；(4)用限制性内切酶酶切载体pUC19，将酶切产物与融合PCR产物用连接酶连接起来，连接反应产物转入大肠杆菌进行克隆，得到质粒pUC19-ArmGm；

二、重组质粒pUC19-ArmGm-chi的构建：(1)目的片段的酶切和连接：将如SEQ ID NO:1所示的chi基因合成后克隆入中间质粒得到重组中间质粒，分别利用限制性内切酶对重组中间质粒、质粒pUC19-ArmGm进行酶切，将两个酶切产物用连接酶连接起来得到重组质粒；(2)重组质粒的克隆：连接反应产物转入大肠杆菌进行克隆，挑取阳性克隆，得到质粒pUC19-ArmGm-chi；

三、打靶质粒和供体菌的构建：用限制性内切酶将打靶片段从pUC19-Arm-Gm-chi质粒上切割下来，再克隆入自杀质粒，得到打靶质粒；将打靶质粒转入大肠杆菌克隆，筛选阳性克隆，得到供体菌；

四、构建重组工程菌：利用供体菌通过接合反应将打靶质粒转移到荧光假单胞菌ZX进行打靶实验，筛选基因组插入chi的阳性克隆，即得到重组工程菌。

3.如权利要求2所述的表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌的构建方法，其特征在于，步骤一中chi基因的扩增引物对为Chi-5F/Chi-5R、Chi-3F/Chi-3R，引物序列为：

Chi-5F：5’ATATCTAGAGTGCTGGATCTGTGCGAGGAGTAA3’，

Chi-5R：5’CATGTCTTGGCTTTGCAGGGCTG3’，

Chi-3F：5’GTGTGCACTTACATTTAAGTGGGCACC3’，

Chi-3R：5’ATATCTAGAGGTCGAGATTGGGAGAAGAAGTCATGC3’。

4.如权利要求2所述的表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌的构建方法，其特征在于，步骤一中扩增庆大霉素抗性基因是以pJQ200SK质粒为模板，用引物Chi-GmF和Chi-GmR扩增得到，引物序列为：

Chi-GmF：

5’CAGCCCTGCAAAGCCAAGACATGATATCAGAAATGCCTCGACTTC3’，Chi-GmR：

5’GGTGCCCACTTAAATGTAAGTGCACACTTGTGACAATTTACCGAACAAC3’。

5.如权利要求2所述的表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌的构建方法，其特征在于，步骤一中用限制性内切酶Sma I酶切pUC19载体；步骤二中的中间质粒为pET28a，酶切pUC19-ArmGm的限制性内切酶为EcoR V，酶切重组中间质粒的限制性内切酶为Sma I。

6.如权利要求2所述的表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌的构建方法，其特征在于，步骤三中用XbaI限制性内切酶将打靶片段从pUC19-ArmGm-chi质粒上切割下来，自杀质粒为pCVD442，克隆用大肠杆菌为E.coliβ2155。

7.如权利要求1所述的表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌在防治植物病害中的应用。

8.如权利要求7所述的表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌在防治植物病害中的应用，其特征在于，所述植物病害是指由病原真菌引起的植物病害。

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