CN108018305B - 一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法 - Google Patents

一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法。首先提供了一种构建伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫生防工程菌的方法，是将具有杀线虫活性的生物酶的编码基因转化入香蕉穿孔线虫伴生细菌构建得到工程菌。然后利用该工程菌防治香蕉穿孔线虫，实现了通过伴生细菌介导表达杀线虫蛋白酶来防治香蕉穿孔线虫的目的。本发明获得的经遗传改造的荧光假单胞菌工程菌遗传稳定性好、对香蕉穿孔线虫的防控效果显著，商业化生产难度低；把活体菌和菌体次生代谢产物这两类生防因子有效地结合起来，充分发挥活体菌不断自我扩繁和自动扩散的特性以及代谢产物高效杀虫的活性，是一种安全、高效、稳定和可持续防治植物寄生线虫新方法和新途径。

Description

一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治 方法
技术领域
本发明涉及防治香蕉穿孔线虫防治技术领域，更具体地，涉及一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法。
背景技术
香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）是一种迁移性内寄生植物病原线虫，寄主植物多达250多种，每年给热带、亚热带地区作物造成严重的经济损失，是全球最具毁灭性的10种植物病原线虫之一。
目前防治该线虫主要还是以化学杀线剂为主，而化学药剂的大量使用对环境、人畜、植物和其它有益生物造成极大的危害和其它负面影响，在许多国家和地区已被严格限制使用。生物防治手段具有环保、安全和可持续性等特点，研究和利用有效的生物防治方法防治香蕉穿孔线虫已倍受关注。
目前，以活菌体为主的线虫生防菌剂已有广泛的研究，部分生防菌剂如淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、穿刺巴氏杆菌（Pasteuria penetrans）和厚坦普可尼亚菌（Pochonia chamydosporium）已在生产中用于防治根结线虫和胞囊线虫等植物寄生线虫。但是活体菌受环境因素影响较大，在使用过程中存在防治效果不稳定甚至无效等问题。为了克服这一难题，人们现在更加关注以菌体次生代谢产物（如毒素、体壁降解酶以及蛋白抑制酶类等）的研发。但由于其次生代谢产物存在着成份复杂、体外容易降解、商业化生产难度大等问题限制了其在植物线虫防治中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，一方面以香蕉穿孔线虫发病蕉园的土壤样品为样本构建香蕉根际土壤微生物宏基因组Fosmid文库，并从中筛选出具有生防潜能的杀线虫蛋白酶基因pase4；另一方面从香蕉穿孔线虫多个种群中筛选了一株与香蕉穿孔线虫稳定伴生的荧光假单胞菌pf36，并将其作为遗传改良的目标菌，采用基因工程技术将获得的杀线虫蛋白酶基因导入其中并表达，利用目标菌与香蕉穿孔线虫的伴生关系，使杀线虫蛋白酶基因通过目标菌的介导抑制香蕉穿孔线虫生长繁殖，从而实现有效防治香蕉穿孔线虫的目的。
本发明的第一个目的是提供一种构建香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫生防工程菌的方法。
本发明的第二个目的是提供所述方法构建得到的香蕉穿孔线虫生防工程菌。
本发明的第三个目的是提供所述的香蕉穿孔线虫生防工程菌或其发酵液在防治香蕉穿孔线虫中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述的香蕉穿孔线虫生防工程菌或其发酵液在制备防治香蕉穿孔线虫的制剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种防治香蕉穿孔线虫的生防制剂。
本发明的第六个目的是提供一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法。
本为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种构建香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫生防工程菌的方法，是将具有杀线虫活性的生物酶的编码基因转化入香蕉穿孔线虫伴生细菌构建得到工程菌。
优选地，所述具有杀线虫活性的生物酶为蛋白酶PASE4，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述香蕉穿孔线虫伴生细菌为荧光假单胞菌pf36（Pseudomonas fluorescens pf36），该菌株于2017年11月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；保藏编号为GDMCC No：60278；保藏地址为中国广东省微生物研究所。
优选地，所述转化的方式为载体转化法或接合转座法。
优选地，载体转化法的具体操作方法为，使用如SEQ ID NO：2～3所示引物扩增蛋白酶PASE4的编码基因，经过酶切后连接到广宿主表达载体pBBR1MCS-2；
接合转座法的具体操作方法为，使用如SEQ ID NO：4～5所示引物扩增蛋白酶PASE4的编码基因，经过酶切后连接到载体pUTmini-Tn5，得到重组质粒，将重组质粒在辅助菌E. coli DH5α协助下转移到受体荧光假单胞菌pf36中，并将蛋白酶PASE4的编码基因整合到受体荧光假单胞菌pf36基因组中。
所述方法构建得到的香蕉穿孔线虫生防工程菌也在本发明的保护范围之内。
所述香蕉穿孔线虫生防工程菌或其发酵液在防治香蕉穿孔线虫中的应用也在本发明的保护范围之内。
所述香蕉穿孔线虫生防工程菌或其发酵液在制备防治香蕉穿孔线虫的制剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种含有上述香蕉穿孔线虫生防工程菌和/或其发酵液的防治香蕉穿孔线虫的生防制剂，也在本发明的保护范围之内。
一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法，首先利用上述方法构建得到香蕉穿孔线虫生防工程菌，然后利用该工程菌或其发酵液防治香蕉穿孔线虫。
优选地，是将所述蕉穿孔线虫生防工程菌接种至作物根际土壤，或将所述工程菌的发酵上清液接到作物根际土壤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明获得的经遗传改造的荧光假单胞菌遗传稳定性好、对香蕉穿孔线虫的防控效果显著，克服了传统的直接使用生防活体菌过程中，因受环境因素影响较大，存在防治效果不稳定甚至无效的问题。
（2）目前应用于生物防治的菌体次生代谢产物（如毒素、体壁降解酶以及蛋白抑制酶类等），由于成份复杂造成商业化生产难度大，同时还存在因体外容易降解而防效不稳定等问题，限制了其在植物线虫防治中的应用。本发明获得的经遗传改造的荧光假单胞菌则不存在这些问题。
（3）本发明获得的经遗传改造的荧光假单胞菌工程菌，把活体菌和菌体次生代谢产物这两类生防因子有效地结合起来，充分发挥活体菌不断自我扩繁和自动扩散的特性以及代谢产物高效杀虫的活性，是一种安全、高效、稳定和可持续防治植物寄生线虫新方法和新途径，具有重要的科学意义和应用前景。
附图说明
图1为遗传改造荧光假单胞菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36的筛选及检测。A和B为遗传改造荧光假单胞菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36在SMA平板上降解脱脂奶粉情况 (37℃，48h)，其中，a为导入重组质粒（pase4-MCS2）转化子p4MCS-pf36，b为空转化载体（pBBR1MCS-2）对照MCS-pf36，c为蛋白酶表达阳性接合子p4Tn5-pf36，d为空载体（pUTmini-Tn5）接合子对照Tn5-pf36；C为菌株p4MCS-pf36的重组质粒双酶切鉴定，M为DNA marker，1：重组质粒pase4-MCS2，2：pase4-MCS2经EcoR I、BamH I双酶切；D为菌株p4Tn5-pf36的pase4基因Southern杂交，1：阳性对照pase4基因的PCR产物，2：Kpn I酶切消化pf36基因组DNA，3：KpnI酶切消化p4Tn5-pf36基因组DNA。
图2为遗传改造荧光假单胞菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36发酵上清液对香蕉穿孔线虫的致死率和毒性；A为不同处理对线虫致死率测定（25℃，浸泡48h）， (n=5，p<0.05）；B为香蕉穿孔线虫浸泡于发酵上清液60 h后表现的毒性性状（25℃），其中，1：对照处理pf36，2：p4Tn5-pf36处理，3：p4MCS-pf36处理。
图3为不同处理的香蕉植株在接种香蕉穿孔线虫90 d后的长势；A：空白对照H2O；B：p4Tn5-pf36+香蕉穿孔线虫(RS)；C：pf36+RS，D：H2O+RS，E：MCS-pf36+RS；F：p4MCS-pf36+RS；G：Tn5-pf36+RS，H：LB+RS。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 蛋白酶pase4基因导入香蕉穿伴生细菌——荧光假单胞菌
1、转化方法
蛋白酶pase4基因分别通过载体转化和接合转座的方法导入目标菌荧光假单胞菌pf36。
蛋白酶pase4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
目标菌荧光假单胞菌pf36（分类命名为Pseudomonas fluorescens pf36）由发明人筛选得到，已于2017年11月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；保藏编号为GDMCCNo：60278；保藏地址为中国广东省微生物研究所。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
载体转化法
以实验室保存的连接有蛋白酶pase4基因的重组质粒pase4-pEASY为模板，使用如下引物扩增蛋白酶pase4基因。
上游引物M1（SEQ ID NO：2）：
5’-CGGAATTCAGGAGGTTGATATGAAAAAACATCAGGTCTC-3’
下横线为EcoR I酶切位点，波浪线为核糖体结合位点；
下游引物M2（SEQ ID NO：3）：
5’-GCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTC-3’
下横线为BamH I酶切位点，波浪线为6×His标签序列。
扩增产物与广宿主表达载体pBBR1MCS-2连接后得到重组质粒pase4-MCS2，并转化感受态pf36细胞，最后涂到含卡那霉素（Kan, 30 μg/mL）的SMA平板上筛选具有蛋白酶活性的转化子p4MCS-pf36。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
接合转座法
接合转座：参照Biomedal公司pUTmini-Tn5 Km Kit使用说明进行三亲本接合试验。
以实验室保存的连接有蛋白酶pase4基因的重组质粒pase4-pEASY为模板，使用如下引物扩增蛋白酶pase4。
上游引物T1（SEQ ID NO：4）：
5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGAAAAAACAT-3’
下横线为Not I酶切位点，波浪线为核糖体结合位点
下游引物T2（SEQ ID NO：5）：
5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCT-3’
下横线为Not I酶切位点，波浪线为6×His标签序列
扩增产物与载体pUTmini-Tn5（Biomedal）连接得到重组质粒pase4-Tn5，重组质粒pase4-Tn5在辅助菌E. coli DH5α（pRK2013, Biomedal）协助下转移到受体菌pf36，并通过Tn5的转座作用将pase4基因整合到pf36基因组中。最后通过含有Kan（30 μg/mL）和Cm（34 μg/mL）的SMA平板筛选具有蛋白酶活性的接合子p4Tn5-pf36。
2、结果
利用M1/M2引物扩增蛋白酶pase4基因，连接到载体pBBR1MCS-2得到重组质粒pase4-MCS2，经EcoR I和BamH I双酶切检验正确后转化感受态pf36细胞得到转化子p4MCS-pf36，将其接种到SMA平板上出现明显水解带，而空转化载体对照MCS-pf36并没有出现脱脂奶粉降解现象（图1中A）。提取p4MCS-pf36的重组质粒作双酶切（EcoR I和BamH I），得到一条约5 kb载体片段条带和一条约1.7 kb目的片段条带（图1中C），结果表明构建的重组质粒pase4-MCS2成功转化伴生细菌pf36，并且pase4基因在其中得到正确表达。利用T1/T2引物扩增蛋白酶pase4基因，连接载体pUTmini-Tn5得到重组质粒pase4-Tn5，经Not I酶切检验正确后转化E.coli DH5α（λpir）得到供体菌p4Tn5-DH5α。将供体菌p4Tn5-DH5α、辅助菌E.coli DH5α（pRK2013）和受体菌pf36混合孵育后得到接合子p4Tn5-pf36，将其接种到SMA平板上出现明显水解带，而空转化接合子Tn5-pf36并没有出现脱脂奶粉降解现象（图1 中B）。提取p4Tn5-pf36基因组DNA，经Southern杂交检测确定pase4基因以单拷贝插入到受体菌pf36基因组中（图1 中D）。说明蛋白酶pase4基因成功整合到pf36基因组中并得到正确表达。
实施例2 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36发酵上清液杀线虫生物活性测定
1、方法
将p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36分别接种于含有Kan（34 μg/mL）的LB培养基中，37℃，200 rpm培养48 h后，离心收集发酵上清液。试验共设置如下处理：p4MCS-pf36发酵上清液、MCS-pf36发酵上清液、p4Tn5-pf36发酵上清液、Tn5-pf36发酵上清液、pf36发酵上清液、LB+Kan和H2O，浸泡48 h后统计各处理液中线虫死亡率，每处理5重复。
2、结果
用p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36发酵上清液浸泡线虫48h的结果表明（图2中 A），p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36处理的线虫死亡率分别为63.9%和42.0%，两者间差异显著（p<0.05），并都显著（p<0.05）地高于其它处理。MCS-pf36、Tn5-pf36和pf36处理的线虫死亡率分别为12.7%、10.3%和12.3%，三者无显著（p>0.05）差异，但都显著（p< 0.05）高于LB+Kan和H2O处理。当浸泡时间为60 h时，p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36处理的线虫表现的毒性性状（图2中B）与用蛋白酶PASE4处理的相似，而在pf36对照处理中，线虫没有表现异常的变化。因此推断，pase4基因可以通过改造菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36介导表达，并实现对香蕉穿孔线虫的毒杀作用，且在相同的处理条件下，p4MCS-pf36比p4Tn5-pf36的杀线虫活性更强。
实施例3 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36对香蕉穿孔线虫防治效果及其对作物安全性测定
1、方法
供试香蕉穿孔线虫为从巴西蕉根际土壤中分离的种群，供试香蕉品种为大蕉（Musa paraolisiac），种植基质为沙土∶炭土∶有机土 = 1∶1∶2（121℃灭菌30 min），盆钵1.8 L塑料花盆（装基质土1.5 L）。试验共设置如下处理：p4MCS-pf36 +香蕉穿孔线虫（RS）、p4Tn5-pf36+RS、MCS-pf36+RS、Tn5-pf36+RS、pf36+RS、LB+RS、H2O+RS、p4MCS-pf36、p4Tn5-pf36、pf36和H2O。当香蕉苗长至5~6叶期时，需接菌的处理按菌液浓度为106 cfu/g（基质土）注入香蕉苗根际土壤中，接菌3 d后再接种香蕉穿孔线虫，接虫量为1000条（混合虫态）/株，接种方法参照Wang等（2016）。蕉株被接种线虫后在温室条件（25~32℃）生长90 d，统计各处理香蕉苗的株高、鲜重、根重、根内线虫数、基质线虫数及线虫繁殖率等指标，评估遗传改造菌对香蕉穿孔线虫的防治效果及其对香蕉作物的安全性。共进行2次试验，每次试验设置4个重复。
2、结果
盆栽试验结果表明，p4Tn5-pf36+RS处理的香蕉苗根内线虫数（每克）、基质土线虫数和总线虫数都显著（p<0.05）低于其它处理，而株高、茎&叶鲜重和根重均显著（p<0.05）大于其它接种RS的处理。
在另外的6个接种RS的处理中，p4MCS-pf36+RS处理的香蕉苗根内线虫数（每克）和总线虫数与其他5个处理差异均不显著（p>0.05），该处理的株高与pf36+RS处理株高差异不显著（p>0.05），但显著（p<0.05）高于其他4个处理，该处理的茎&叶鲜重和根重与MCS-pf36+RS、Tn5-pf36+RS、pf36+RS处理差异不显著（p>0.05），但显著（p<0.05）大于LB+RS和H2O+RS处理。因此，改造菌p4Tn5-pf36对香蕉穿孔线虫的防控效果最好，能显著（p<0.05）抑制香蕉穿孔线虫的繁殖数量，且植株长势较好（图3）；然而，p4MCS-pf36对香蕉穿孔线虫的防控效果并不明显。
此外，改造菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36对香蕉苗的安全性测定结果显示，p4Tn5-pf36处理与pf36、p4MCS-pf36和H2O处理相比，株高显著（p<0.05）最低，地上部和根部鲜重差异不显著（p>0.05），而pf36、p4MCS-pf36和H2O处理之间的株高、茎&叶鲜重和根重均无显著（p>0.05）差异；经p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36处理的植株没有表现出明显的受害症状，因此确定改造菌对香蕉作物安全。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1695
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
aaggaaaaaa gcggccgctt agtggtggtg gtggtggtgc t 41

Claims (7)

1.一种构建香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫生防工程菌的方法，其特征在于，是将具有杀线虫活性的生物酶的编码基因转化入香蕉穿孔线虫伴生细菌构建得到工程菌；
所述具有杀线虫活性的生物酶为蛋白酶PASE4，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；
所述香蕉穿孔线虫伴生细菌为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)pf36，该菌株于2017年11月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；保藏编号为GDMCC No：60278；
所述转化的方式为载体转化法或接合转座法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，载体转化法的具体操作方法为，使用如SEQID NO：2～3所示引物扩增蛋白酶PASE4的编码基因，经过酶切后连接到广宿主表达载体pBBR1MCS-2；
接合转座法的具体操作方法为，使用如SEQ ID NO：4～5所示引物扩增蛋白酶PASE4的编码基因，经过酶切后连接到载体pUTmini-Tn5，得到重组质粒，将重组质粒在辅助菌E.coli DH5α协助下转移到受体荧光假单胞菌pf36中，并将蛋白酶PASE4的编码基因整合到受体荧光假单胞菌pf36基因组中。
3.权利要求1或2所述方法构建得到的香蕉穿孔线虫生防工程菌。
4.权利要求3所述的香蕉穿孔线虫生防工程菌或其发酵液在防治香蕉穿孔线虫中的应用。
5.权利要求3所述的香蕉穿孔线虫生防工程菌或其发酵液在制备防治香蕉穿孔线虫的制剂中的应用。
6.一种防治香蕉穿孔线虫的生防制剂，其特征在于，含有权利要求3所述香蕉穿孔线虫生防工程菌和/或其发酵液。
7.一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法，其特征在于，利用权利要求3所述的香蕉穿孔线虫生防工程菌或其发酵液防治香蕉穿孔线虫。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109258695A (zh) * 2018-10-18 2019-01-25 江苏师范大学 绿针假单胞菌在防治线虫中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144066A (zh) * 2007-08-21 2008-03-19 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法
CN103289947A (zh) * 2013-06-25 2013-09-11 福建农林大学 一种杀松材线虫的工程菌及其应用
CN104593276A (zh) * 2014-12-09 2015-05-06 云南大学 一种具有杀线虫功能的刀孢轮枝霉基因工程菌株及其应用
CN107119000A (zh) * 2017-04-19 2017-09-01 山东大学 荧光假单胞菌突变菌株的筛选方法及其在生物防治中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144066A (zh) * 2007-08-21 2008-03-19 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法
CN103289947A (zh) * 2013-06-25 2013-09-11 福建农林大学 一种杀松材线虫的工程菌及其应用
CN104593276A (zh) * 2014-12-09 2015-05-06 云南大学 一种具有杀线虫功能的刀孢轮枝霉基因工程菌株及其应用
CN107119000A (zh) * 2017-04-19 2017-09-01 山东大学 荧光假单胞菌突变菌株的筛选方法及其在生物防治中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Community Diversity of Associated Bacteria of Radopholus similis;fen zheng等;《Plant Diseases and Pests》;20120820;第3卷(第2期);第33-37页 *
Management of Radopholus similis and Helicotylenchus multicinctus in Ratoon Banana Grown under High Density Planting Systems;N. Seenivasan;《INTERNATIONAL JOURNAL OF FRUIT SCIENCE》;20161122;第1-22页 *
表达荧光假单胞菌鞭毛蛋白工程菌的构建及其对黑松的毒性;李盛楠等;《青岛大学学报(工程技术版)》;20100625;第25卷(第2期);第35-40页 *
香蕉穿孔线虫防治研究进展;周春娜等;《中国热带农业》;20151210(第67期);第31-34页 *

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