CN102586283B - 耐辐射异常球菌R1 ytxH基因培育耐盐植物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明发现耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的ytxH基因(DR0105)具有提高原核生物及植物的抗逆能力。本发明构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证实，ytxH基因(DR0105)能够提高原核生物耐盐的能力；将该基因转入植物后获得的转基因植物也具有耐盐的能力。
Description
技术领域
本发明涉及耐辐射异常球菌R1(Deinococcus radiodurans R1)ytxH基因(DR0105GeneID：1799501)的新功能，具体涉及该基因在改良植物对盐胁迫抗性方面的应用。
背景技术
土壤盐渍化是一个世界性的资源问题和生态问题，越来越引起人们的重视。随着分子生物学的技术进步，使基因的定位、分离、转移成为现实，在提高农作物耐盐能力方面起着重要的作用。
耐辐射异常球菌R1(D.radiodurans R1)因具有对电离辐射、UV辐射、DNA损伤试剂及渗透胁迫等极强抗性，而成为研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株，也可作为一个研究高等植物耐盐的模式物种(Battista et al.，2001)。来源于D.radiodurans R1基因组中一个大质粒，其编码的蛋白与渗透胁迫抗性相关。ytxH基因(DR0105)编码的蛋白YtxH(含有40-50aa的保守区段)属于Lea76家族，与渗透胁迫相关。
但目前未见耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的ytxH基因(DR0105GeneID：1799501)在提高植物耐盐性方面的功能的研究报道。
发明内容
本发明的目的是从D.radiodurans R1基因组中发现能够提高植物对盐抗性的基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得耐盐的性状。
本发明通过如下研究发现，Deinococcus radiodurans R1的ytxH基因(DR0105GeneID：1799501)具有耐高渗和盐胁迫的功能，可用于培育耐盐性状的植物：
1、获得含有D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)的重组工程菌株
1)通过PCR从D.radiodurans R1(DSM 20539)菌株基因组扩增出D.radioduransR1ytxH基因(DR0105)，基因序列号为：GeneID：1799501。其大小为492bp，该基因编码163个氨基酸，将其克隆于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整ytxH基因(DR0105)的重组质粒pGEMT-ytxH；
2)将ytxH基因(DR0105)连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整ytxH基因重组质粒pRADZ3-ytxH G；
3)将导入ytxH基因(DR0105)的重组质粒pRADZ3-ytxH G转入受体大肠杆菌JM109中，获得工程菌株JM-ytxH(见实施例1)；
2、含有D.radiodurans R1ytxH基因工程菌株的耐盐实验
实验证实，经4M NaCl盐溶液冲击后，含有D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)的JM-ytxH重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见实施例2及图4)。该工程菌株具有耐受4M NaCl冲击的能力；
此实验表明：D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)具有提高原核生物耐盐的能力。
3、ytxH基因(DR0105)在油菜中表达及转基因植株的耐盐性鉴定
1)将D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)连接到植物表达载体pBI121中，构建具有ytxH基因(DR0105)的重组质粒pBI121-ytxH；
2)将pBI121-ytxH重组质粒转化油菜中，获得了能够耐受盐胁迫的转基因油菜植株；
此实验表明：D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)具有培育耐盐植物的用途(见实施例3及图5)。
附图说明：
图1是含有D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)序列的PCR产物的验证电泳图谱；
图2是含有D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)及groEL启动子的原核表达载体的构建验证电泳图谱；
图3是在盐冲击试验前的含有空载体和含有D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况的菌落照片，其中：
a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；
b是含有D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)表达载体的大肠杆菌重组菌株；
图4是含有D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)的原核表达载体及空载体的大肠杆菌(E.coli)在含4M NaCl培养基中的生长情况的菌落照片，图中的菌株如下：
a是含有空表达载体的大肠杆菌JM109菌株；
b是含有D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)表达载体的大肠杆菌重组菌株。
图5是在300mmol.L-1的NaCl培养基上转D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)油菜与非转基因油菜的耐盐试验结果比较。图中，从左至右，左起第1盆是非转基因油菜，第2-3盆是转入D.radiodurans R1ytxH基因的油菜。
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所举的质粒、菌株来源如下：
克隆载体pGEMT-easy：为Promrga公司市售产品；
穿梭质粒pRADZ3：为本实验室保存；
植物表达载体pBI121：为Clontech公司市售产品；
大肠杆菌JM 109：为北京全式金公司市售产品。农杆菌EHA 105由本实验室保存
实施例1D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)在大肠杆菌中的表达
根据已公布的D.radiodurans R1基因组中的DR_0105基因序列设计1对PCR特异性引物，从D.radiodurans R1基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列：
Up 5′ATTA 
TCGCACGTGGGTGATGAGGC 3′；
Down 5′ACGC 
AGGCGATCAGTCCTGGTTTT 3′。
其中黑斜体部分是酶切位点。
通过PCR方法从D.radiodurans R1的基因组中扩增出目的基因序列，反应条件为：94℃10min，[94℃60sec，55℃30sec，72℃60sec]30个循环，72℃10min，PCR产物经胶回收后，克隆于载体pGEMT-easy上，命名为pGEMT-ytxH，并测序验证克隆基因正确；然后通过SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的ytxH基因及含有启动子groEL的pRADZ3载体，将ytxH基因连接于pRADZ3载体上，构建大肠杆菌表达载体 pRADZ3-ytxH G，将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图1，2)，将该菌株命名为JM-ytxH。
将含有pRADZ3空质粒的E.coli JM109命名为JM-Z3。
实施例2含D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)重组菌株的耐盐实验
一、实验方法
1、将实施例1中获得的2个重组的大肠杆菌分别接种于20mL LB液体培养基(含Amp抗生素)中，摇瓶过夜培养后(37℃)，再转接于100mL的LB液体培养基中，尽量保持接种量的一致，培养至OD600约为0.5。
2、取10mL的菌液离心后，在等体积的4M NaCl盐溶液里冲击2h，每个样品立即用无菌去离子水倍比稀释至10-4，取10μL点在LB固体培养基表面，经37℃培养16h，观察菌落形成情况并照相。
二、实验结果
图3显示，4M NaCl盐溶液冲击前前含有D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)的JM-ytxH菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致；4M NaCl盐溶液冲击后，含有D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)的JM-ytxH菌株生长状况良好，菌落数明显高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见图4)。
三、结论
D.radiodurans R1ytxH基因(DR0105)提高了原核生物耐盐的能力。
实施例3ytxH基因(DR0105)在油菜中表达及转基因植株的耐盐性鉴定
(一)农杆菌介导转化油菜实验
1.根癌农杆菌EHA105感受态的制备
1)挑取单菌落，接种于5mL YEB液体培养基(含利福平Rif 50mg/L)，28℃，250rpm振荡培养过夜；
2)取2mL菌液，加入50mL YEB液体培养基(含Rif 50mg/L)中，28℃，250rpm振荡培养至OD600≈0.6；
3)将菌液转至50mL无菌离心管中，冰浴30min，5000×g离心5min；
4)弃上清，用2mL 20mM CaCl2重悬沉淀，每份100μL分装到1.5mL离心管中， 液氮中保存备用。
2.重组质粒DNA转入农杆菌
1)将约1μg的pBI-ytxH质粒DNA分别加入到100μLEHA105感受态细胞中，混匀，冰浴5min；
2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37℃水浴中温浴5min；
3)加入1mL YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm复苏4～5h；
4)取适量菌液涂布到含利福平(Rif)50mg/L和卡那霉素(Kan)100mg/L的YEB固体培养基上，置28℃培养24～48h。
3.农杆菌的质粒的提取
1)挑取菌落于含利福平(Rif)50mg/L和卡那霉素(Kan)100mg/L的YEB液体培养基中(YEB：胰蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.5g/L)，28℃，250rpm振荡培养20h；
2)取1.5mL菌液离心后，弃上清，用STE溶液(Tris-HCI 10mM pH8.0，NaCl 10mM，EDTA 10mM pH 8.0)洗涤2次，弃上清，加入预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8.0，10mM EDTA pH 8.0，RNase A 100μg/mL)300μL，用移液器反复抽吸混匀，室温静置10min；
3)加入新鲜配置的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)600μL，上下颠倒几次混匀；
4)加入预冷的溶液III(5M乙酸钾pH 5.2，冰醋酸11.5mL，加水至100mL)450μL，充分混匀，冰浴5min，4℃12000×g离心5min，取上清用0.6倍体积的异丙醇沉淀；
5)沉淀用适量TE(Tris-HCl 10mmol/L，1mmol/LEDTA，pH 8.0)溶解后，经PCR、Bam HI、Sac I双酶切验证。
4.油菜无菌苗的准备及农杆菌介导的ytxH基因(DR0105)遗传转化
1)油菜无菌苗的培养
甘蓝型油菜(Brassicanapus L.)(84100-18)种子在超净工作台上用灭菌水浸泡10min，10％的NaClO灭菌12min，再用0.1％的升汞溶液消毒7-8min，用灭菌水洗3-5遍，并把灭菌的油菜种子均匀地摆放在无激素的预培养基上(7.5％琼脂)。光照培养，4-5d龄油菜幼苗最适于遗传转化。
2)预培养
用75％的酒精和高温消毒灭菌的剪刀剪掉子叶和生长点，剪取油菜无菌苗紧邻生长点下约0.5cm长的下胚轴，置于预培养基(MS+6-BA 2mg/L+2，4-D 1mg/L+AgNO32.5mg/L+AS 19.62mg/L)上，光照预培养2d。
3)农杆菌的培养
在50mL LB液体培养基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入0.1mLytxH-EHA 105菌液，28℃下220rpm振荡培养16h左右，室温下4000×g离心10min，弃上清液，菌体用灭菌的MS液体培养基(含AS 100μmol/L)悬浮，稀释到原体积的5-20倍，在28℃下220rpm振荡培养1h，使菌液的OD600达0.5左右。
4)共培养
把预培养2d的下胚轴放入菌液中浸染1min，用药勺捞出下胚轴，放在灭菌的吸水纸上，吸干下胚轴上的多余菌液，再放到覆盖有灭菌滤纸的预培养基上，用封口膜封好培养皿，25℃左右，于暗处共培养约2d(暗培养)。
5)诱导培养
把共培养2d的下胚轴放到诱导培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgNO32.5mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25℃左右光照培养，每2周继代1次，直至长出膨大的愈伤组织。
6)选择培养
把膨大的愈伤组织转移到到筛选培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgNO32.5mg/L+Kan 100mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25℃左右光照培养，每2周继代1次，直至长出苗。
7)生根培养
当幼芽长到1-2cm高时，把它们从愈伤组织上分离，转移到生根培养基上(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)进行生根培养。在抗生素筛选条件下，约87％的芽在2周后形成根。
8)炼苗和移栽
生根后的幼苗长到5-6cm高时，半敞开培养瓶盖子，进行炼苗；待幼苗适应外界环境以后，转移到室内灭菌的蛭石中栽种培养，并用1/2MS培养液浇灌。当幼苗生长至7-9cm时，将幼苗移植到泥土中生长，然后再进行下一步实验。
(二)含ytxH基因(DR0105)序列转基因油菜的耐盐性鉴定实验
1、实验目的
鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对盐胁迫具有抗性，进一步对转基因植株进行耐盐性鉴定。
2、实验方法
采用不同的NaCl浓度(0、50、100、150、200、250和300mmol.L-1NaCl)分别对转基因油菜植株和非转基因油菜植株进行生长情况的观察。
3、实验结果
在没有NaCl处理的情况下，转基因油菜和非转基因油菜的生长状况没有明显的差异；
在添加50mmol.L-1NaCl的情况下，非转基因油菜仍然能保持生长，但生长的速率比转基因油菜要缓慢一些。表明低盐条件下，野生型植株生长已明显受到抑制；
当NaCl的浓度增加到100和150mmol.L-1时，非转基因的油菜叶片最初变黄、接着叶片逐渐萎蔫，20d后全部死亡；
当NaCl浓度为200mmol.L-1时，非转基因的油菜叶片迅速发黄、叶片萎焉，幼叶几乎停止生长，并向叶背面翻卷，由原来的绿色变浅绿，大约在15d后死亡；
当NaCl浓度增加到250和300mmol.L-1，非转基因油菜苗均在2d内开始发黄，7-8d后几乎全部死亡，而转基因油菜均能够存活5周以上。从图5可知转基因油菜可在300mmol.L-1的NaCl培养基上正常生长，非转基因油菜在300mmol.L-1的NaCl培养基上干枯死亡。结果证明，该基因对盐的胁迫确有抗性。
而在上述各种NaCl浓度下，转入ytxH基因(DR0105)的油菜均能正常生长。
上述实验结果见表1：
表1转基因油菜和非转基因油菜对盐胁迫的比较
4、实验结论
上述结果表明，所克隆的ytxH基因(DR0105)的功能与植物对盐的耐受性有关，而且在油菜中超表达，植株能最大耐受300mmol.L-1的NaCl。
Claims (7)
1.Deinococcus radiodurans RlytxH基因培育耐盐植物的用途，所述基因的编号和序列号为DR0105，GeneID:1799501。
2.含Deinococcus radiodurans R1ytxH基因的重组质粒培育耐盐植物的用途，所述基因的编号和序列号为DR0105，GeneID:1799501。
3.权利要求2所述的用途，所述重组质粒是能在大肠杆菌表达的质粒。
4.权利要求2所述的用途，所述重组质粒是能在植物中表达的质粒。
5.权利要求2所述的用途，所述重组质粒转化的宿主细胞培育耐盐植物的用途。
6.权利要求5所述的用途，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
7.权利要求1或2所述的用途，所述植物是油菜。
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