CN102586282B - 耐辐射异常球菌R1 lea-like基因培育抗干旱植物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明发现耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的lea-like基因(DR1172)具有增强原核生物及植物的抗逆能力。本发明构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证明，lea-like基因(DR1172)在原核宿主细胞和油菜中表达后，均能增强其干旱抗性。
Description
技术领域
本发明涉及耐辐射异常球菌R1(Deinococcus radiodurans R1)lea-like基因的新功能，具体涉及该基因在增强植物对干旱胁迫抗性方面的应用。
背景技术
农作物最常遭受的非生物环境胁迫是缺水，干旱对农作物造成的损失在所有非生物胁迫中占首位(Dracup et al.，1998)。耐辐射异常球菌R1(D.radiodurans R1)因对长期的干燥和强氧化胁迫具有极强的抗性，而成为研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株，也可作为一个研究高等植物抗干旱的模式物种(Battista et al.，2001)。D.radiodurans R1含有4个与植物干旱抗性相关的蛋白，其中lea-like基因DR1172编码的蛋白属于LEA 3家族成员，与植物耐脱水性密切相关(Makarova，et al.，2001)。
尽管耐辐射菌株与干旱胁迫抗性在进化上可能具有协同性，但目前未见耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的lea-like基因(DR1172，GeneID：1797273)在增强植物干旱抗性方面的功能的研究报道。
发明内容
本发明的目的是从D.radiodurans R1基因组中发现能够增强植物对干旱的抗性基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得抗干旱的能力。
本发明通过如下研究发现，Deinococcus radiodurans R1的lea-like基因(DR1172)具有抗干旱胁迫的功能，可用于培育抗旱性状的植物：
1、获得含有D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)的重组工程菌株
1)通过PCR从D.radiodurans R1(DSM 20539)菌株基因组扩增出D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)，基因序列号为：GeneID：1797273。其大小为897bp，该基因编码一个27.8kDa的蛋白(为类胚胎发育晚期丰富蛋白)，含298个氨基酸，，将其克隆于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整lea-like基因的重组质粒pGEMT-lea；
2)将基因(DR1172)连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整lea-like基因(DR1172)重组质粒pRADZ3-lea G；
3)将导入lea-like基因(DR1172)的重组质粒pRADZ3-lea G转入受体大肠杆菌JM109中，获得工程菌株JM-lea(详见实施例1)；
2、含有D.radiodurans R1lea-like基因工程菌株的干旱抗性实验
实验证实，经3M山梨醇(Sorbitol)冲击后，含有D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)的JM-lea重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见实施例2及图4)。该工程菌株具有耐受3M山梨醇冲击的能力(因Sorbitol具有吸湿性，高浓度的Sorbitol溶液可以模拟干旱的环境)。
此实验表明：D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)具有增强原核生物抗干旱的能力。
3、lea-like基因(DR1172)在油菜中表达及转基因植株的干旱抗性鉴定
1)将D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)连接到植物表达载体pBI121中，构建具有lea-like基因(DR1172)的重组质粒pBI121-lea；
2)将pBI121-lea重组质粒转化油菜中，获得了能够抗干旱胁迫的转基因油菜植株；
此实验表明：D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)具有培育抗干旱植物的用途(见实施例3及图5-8)。
附图说明：
图1是含有D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)序列的PCR产物验证电泳图谱；
图2是含有D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)及groEL启动子的原核表达载体的构建验证电泳图谱；
图3是在高浓度(3M)山梨醇冲击前的含有空载体和含有D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况的菌落照片，其中：
a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；
b是含有D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)表达载体的大肠杆菌重组菌株；
图4是含有D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)的原核表达载体及空载体的大肠杆菌(E.coli)在含3M山梨醇培养基中的生长情况的菌落照片，图中的菌株如下：
a是含有空表达载体的大肠杆菌JM109菌株；
b是含有D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)表达载体的大肠杆菌重组菌株。
图5是干早胁迫16天时转lea-like基因(DR1172)油菜的生长状态照片。
图6是干早胁迫16天时非转基因油菜的生长状态照片。
图7是非转基因油菜和转lea-like基因(DR1172)油菜干旱处理28天复水前的生长情况的照片；
盆中左边是转lea-like基因(DR1172)油菜植株；右边是非转基因油菜植株。
图8是非转基因油菜和转lea-like基因(DR1172)油菜干旱处理28天复水后的生长情况的照片；
盆中左边是转lea-like基因(DR1172)油菜植株；右边是非转基因油菜植株。
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所举的质粒、菌株来源如下：
克隆载体pGEMT-easy：为Promrga公司市售产品；
穿梭质粒pRADZ3：为本实验室保存；
植物表达载体pBI121：为Clontech公司市售产品；
大肠杆菌JM 109：为北京全式金公司市售产品。根癌农杆菌EHA 105由本实验室保存。
实施例1D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)序列在大肠杆菌中的表达
根据已公布的D.radiodurans R1基因组中的lea-like基因(DR1172)序列设计1对PCR特异性引物：
Up 5′ATTAACTAGT CGCAGCGTAGGCTCCTGACA 3
Down 5′ACGCCATATG ACTCAGTTCTTGCGGGTGTT 3
通过PCR方法从D.radiodurans R1基因组DNA中扩增出目的基因序列。反应条件：94℃10min，[94℃60sec，55℃30sec，72℃60sec]30个循环，72℃10min。PCR产物经胶回收后，克隆于载体pGEMT-easy上，命名为pGEMT-lea，并测序验证；然后通过 SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的lea-like基因(DR1172)及含有启动子groEL的pRADZ3载体，将lea-like基因(DR1172)连接于pRAD Z3载体上，构建大肠杆菌表达载体pRADZ3-lea G，将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图1，2)，将该菌株命名为JM-lea。
将含有pRADZ3空质粒的E.coli JM109命名为JM-Z3。
实施例2含D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)重组菌株的干旱抗性实验
一、实验方法
1、将实施例1中获得的2个重组的大肠杆菌分别接种于20mL LB液体培养基(含Amp抗生素)中，摇瓶过夜培养后(37℃)，再转接于100mL的LB液体培养基中，尽量保持接种量的一致，培养至OD600约0.5左右(尽量保持OD600值一致)。
2、取10mL的菌液离心后，在等体积的3M山梨醇溶液中冲击2h，每个样品立即用无菌去离子水倍比稀释至10-4，取10μL点在LB固体培养基表面，经37℃培养16h，观察菌落形成情况并照相(3M山梨醇为高渗溶液，可模拟干旱胁迫)。
二、实验结果
图3显示，3M山梨醇溶液冲击前，含有D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)的JM-lea菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致；3M山梨醇溶液冲击后，含有D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)的JM-lea重组菌株生长状况良好，菌落数多于只含空质粒的JM-Z3菌株(见图4)。
三、实验结论
D.radiodurans R1lea-like基因(DR1172)增强了原核生物抗干旱的能力。
实施例3lea-like基因(DR1172)在油菜中表达及转基因植株的干旱抗性鉴定
(一)农杆菌介导转化油菜实验
1.根癌农杆菌EHA105感受态的制备
1)挑取单菌落，接种于5mL YEB液体培养基(含利福平Rif 50mg/L)，28℃，250rpm振荡培养过夜；
2)取2mL菌液，加入50mL YEB液体培养基(含Rif 50mg/L)中，28℃，250rpm振荡培养至OD600约0.6左右；
3)将菌液转至50mL无菌离心管中，冰浴30min，5000×g离心5min；
4)弃上清，沉淀用2mL 20mM CaCl2重悬，每份100μL分装到1.5mL离心管中，液氮中保存备用。
2.重组质粒DNA转入农杆菌
1)将约1μg的pBI121-lea质粒DNA分别加入到100μLEHA105感受态细胞中，混匀，冰浴5min；
2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37℃水浴中温浴5min；
3)加入1mL YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm复苏4～5h；
4)取适量菌液涂布到含利福平(Rif)50mg/L和卡那霉素(Kan)100mg/L的YEB固体培养基上，置28℃培养24～48h。
3.农杆菌质粒DNA的提取
1)挑取菌落于含利福平(Rif)50mg/L和卡那霉素(Kan)100mg/L的YEB液体培养基中(YEB：胰蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.5g/L)，28℃，250rpm振荡培养20h；
2)取1.5mL菌液离心后，弃上清，用STE溶液(Tris-HCI 10mM pH8.0，NaCl 10mM，EDTA 10mM pH 8.0)洗涤2次，弃上清，加入预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8.0，10mM EDTA pH 8.0，RNase A 100μg/mL)300μL，用移液器反复抽吸混匀，室温静置10min；
3)加入新鲜配置的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)600μL，上下颠倒几次混匀；
4)加入预冷的溶液III(5M乙酸钾pH 5.2，冰醋酸11.5mL，加水至100mL)450μL，充分混匀，冰浴5min，4℃12000×g离心5min，上清加入0.6倍体积的异丙醇沉淀；
5)沉淀加50μL TE(Tris-HCl 10mmol/L，1mmol/L EDTA，pH 8.0)溶解后，经PCR、Bam HI、Sac I双酶切验证。
4.油菜无菌苗的准备及农杆菌介导的lea-like基因(DR1172)遗传转化
1)油菜无菌苗的培养
甘蓝型油菜(Brassica napus L.)(84100-18)种子在超净工作台上用灭菌水浸泡10min，10％的NaClO灭菌12min，再用0.1％的升汞溶液消毒7-8min，用灭菌水洗3-5遍，并把灭菌的油菜种子均匀地摆放在无激素的预培养基上(7.5％琼脂)。光照培养，4-5d龄油菜幼苗最适于遗传转化。
2)预培养
用75％的酒精和高温消毒灭菌的剪刀剪掉子叶和生长点，剪取油菜无菌苗紧邻生长点下约0.5cm长的下胚轴，置于预培养基(MS+6-BA 2mg/L+2，4-D 1mg/L+AgNO32.5mg/L+AS 19.62mg/L)上，光照预培养2d。
3)农杆菌的培养
在50mL LB液体培养基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入0.1mL lea-EHA 105菌液，28℃下220rpm振荡培养16h左右，室温下4000×g离心10min，弃上清液，菌体用灭菌的MS液体培养基(含AS 100μmol/L)悬浮，稀释到原体积的5-20倍，在28℃下220rpm振荡培养1h，使菌液的OD600达0.5左右。
4)共培养
把预培养2d的下胚轴放入菌液中浸染1min，用药勺捞出下胚轴，放在灭菌的吸水纸上，吸干下胚轴上的多余菌液，再放到覆盖有灭菌滤纸的预培养基上，用封口膜封好培养皿，25℃左右，于暗处共培养约2d(暗培养)。
5)诱导培养
把共培养2d的下胚轴放到诱导培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgNO32.5mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25℃左右光照培养，每2周继代1次，直至长出膨大的愈伤组织。
6)选择培养
把膨大的愈伤组织转移到筛选培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgNO32.5mg/L+Kan 100mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25℃左右光照培养，每2周继代1次，直至长出苗。
7)生根培养
当幼芽长到1-2cm高时，把它们从愈伤组织上分离，转移到生根培养基上(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)进行生根培养。在抗生素筛选条件下，约87％的芽在2周后形成根。
8)炼苗和移栽
生根后的幼苗长到5-6cm高时，半敞开培养瓶盖子，进行炼苗；待幼苗适应外界环境以后，转移到室内灭菌的蛭石中栽种培养，并用1/2MS培养液浇灌。当幼苗生长至7-9cm时，将幼苗移植到泥土中生长，然后再进行下一步实验。
(二)含lea-like基因(DR1172)序列转基因油菜的抗旱性鉴定
1、实验目的
鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对干旱胁迫具有抗性，进一步对转基因植株进行抗旱性鉴定。
2、实验方法
对苗期的转基因油菜植株和非转基因油菜植株均分别一次性浇足营养液后不再浇水，并进行以下实验对比：
1)观察油菜植株的生长情况
从浇足营养液后的当天开始起算，28天内不再浇水及营养液；
第28天起恢复浇水，并在第28天当日浇足营养液，之后仅酌情浇水。
2)测定叶片含水量
从停止浇水第二天起，每隔一天测定叶片相对含水量(Relativewatercontent，)；
含水量的测定方法：从植株上取下约0.1g叶片后，立即称取鲜重(FW)，然后将叶片浸入去离子水中4h，取出用滤纸吸去表面水分，称取饱和鲜重(TW)，然后将叶片放入烘箱于70℃烘干至恒重，称取干重(DW)。
相对含水量(RWC)按下式计算：
RWC(％)＝(FW-DW)/(TW-DW)×100％。
3、实验结果
1)油菜植株的生长情况对比结果
干早胁迫第4天时，非转基因油菜在叶片已经开始萎蔫；转基因油菜叶片饱满，生长正常；
干旱胁迫第10天时，非转基因油菜失水严重，叶片萎蔫；转基因油菜依然正常生长；
干旱胁迫第16天时，非转基因油菜叶片萎蔫、变黄(见图5)；转基因油菜的叶片才开始萎蔫(见图6)；
干旱胁迫第28天时，非转基因油菜及转基因油菜叶片均萎蔫(见图7)；
28天恢复浇水后，非转基因油菜叶片枯黄、萎蔫，不能正常生长；而转lea-like基因(DR1172)的油菜迅速恢复生长，叶片变绿(见图8)。
表1转基因油菜和非转基因油菜对干旱胁迫的比较
2)叶片含水量测定结果
从以下表2可看出：在干早胁迫处理的28天中，非转基因油菜叶片相对含水量急剧下降，转lea-like基因(DR1172)油菜叶片失水速度明显比非转基因油菜缓慢，叶片相对含水量逐渐下降；
随着干旱处理时间的延长，转基因油菜与非转基因油菜相对含水量的差异逐渐明显；
在干早胁迫第28天时，非转基因油菜的叶片相对含水量降至35.67％，而转基因油菜的叶片相对含水量为72.98％，约为非转基因油菜含水量的2.05倍。
表2在干旱胁迫下转基因油菜和非转基因油菜叶片相对含水量比较
4、实验结论
上述所有结果均表明，所克隆的lea-like基因(DR1172)具有对干旱胁迫的抗性。
Claims (4)
1.Deinococcus radiodurans R1lea-like基因培育抗干旱油菜的用途，所述基因的编号和序列号为DR1172，GeneID:1797273。
2.含权利要求1所述Deinococcus radiodurans R1lea-like基因的重组质粒培育抗干旱油菜的用途。
3.权利要求2所述的重组质粒转化的根癌农杆菌EHA105培育抗干旱油菜的用途。
4.含权利要求1所述Deinococcus radiodurans R1lea-like基因的重组根癌农杆菌EHA105培育抗干旱油菜的用途。
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