CN104031924A - 水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1及应用 - Google Patents

Abstract

一种水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1及应用。该水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1是具有下述核苷酸序列之一：(a)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列；(b)编码序列表中SEQ ID No:2蛋白序列的多核苷酸。在水稻在干扰表达该基因，可以提高水稻对耐干旱胁迫和/或耐高盐胁迫的抗性。利用本发明的水稻MYB转录因子基因OsMYB1R1可培育出耐干旱胁迫和/或耐高盐胁迫的水稻品种。

Description

水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1的分离克隆、功能验证和应用。

背景技术

水稻作为一种重要的农作物，是世界半数以上人口的主食。水稻在整个生长周期里都难以避免各种恶劣外界环境的影响。其中各种非生物逆境诸如干旱和高盐胁迫影响水稻的生长发育，导致水稻产量和品质受到严重的影响。对水稻非生物逆境响应相关基因及其作用机理，以及非生物逆境响应信号网络的研究有助于了解植物对非生物逆境的响应机制，并指导进行水稻等粮食作物的遗传改良，保证粮食作物的稳产高产。为培育耐逆水稻新品系，人们通过利用基因工程手段和生物学技术研究水稻非生物胁迫应答过程中关键的调节基因和重要的功能基因来提高植物的抗逆性。

MYB转录因子家族是一类数量庞大，通过植物体内多种信号网络参与各种生理生化反应的基因家族。已有研究表明，MYB转录因子基因主要在植物的发育、次级代谢产物的合成、植物激素信号转导中起着重要的作用。同时，MYB转录因子是也是众多参与逆境响应的转录因子家族中的一员，已经被研究发现参与了多种非生物逆境的响应。鉴于目前水稻中对MYB转录因子的研究相对匮乏，对水稻MYB转录因子基因的功能发掘与开发利用将对培育新型抗逆水稻品种，提高水稻产量具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1及其编码蛋白，以用于提高水稻的抗逆性能。

本发明所提供的水稻耐逆性相关MYB转录因子基因，名称为OsMYB1R1，来源于水稻粳稻品种日本晴(Oryza sativa ssp.japonica)，该基因在水稻基因组数据库TIGR中的编号为LOC_Os04g49450，编码一个含MYB相似结构域的MYB转录因子，该基因的CDS全长1392bp，编码463aa的蛋白。到目前还没有任何关于OsMYB1R1基因功能的研究报道。本发明所述基因是具有下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ ID No：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸。

序列表中SEQ ID No：1的DNA序列由2016个碱基组成，该序列编码SEQ IDNo：3的核苷酸序列。

含有本发明OsMYB1R1基因的表达载体、转基因细胞系及寄主菌均属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种培育植物非生物逆境抗性的方法，该方法是将所述的耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1构建RNAi干扰载体导入植物细胞或组织，以培育得到抗逆性(耐干旱和/或耐高盐)改良的植株。用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。利用任意一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的OsMYB1R1基因在植物中干扰表达表现出耐逆特征。

携带有本发明OsMYB1R1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射以及电穿孔等常规生物技术方法转入植物细胞或组织，并培育出对非生物逆境如干旱、盐等耐受力增强的转基因植物。被转化的植物寄主可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也适用于烟草、大豆等双子叶植。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为OsMYB1R1超量表达载体示意图。

图2为OsMYB1R1RNAi干扰表达载体示意图。

图3为OsMYB1R1转基因水稻的RT-PCR检测。

其中：A为OsMYB1R1超量表达株系OE-4、OE-5的RT-PCR检测；B为OsMYB1R1RNAi干扰表达株系RNAi-1、RNAi-2、RNAi-5及RNAi-8的RT-PCR检测。

图4为干旱逆境下OsMYB1R1超量表达水稻幼苗OE-4、OE-5及RNAi干扰水稻幼苗RNAi-1、RNAi-8的生长状况。

其中：A为干旱处理前；B为干旱处理后；C为干旱处理并复水后；皆以野生型日本晴作为对照。

图5为高盐(175mmol/L NaCl溶液)逆境下OsMYB1R1过表达水稻幼苗OE和RNAi干扰水稻幼苗的生长状况。

其中：A为高盐处理前；B为高盐处理后；C为高盐处理并复水后；皆以野生型日本晴作为对照。

图6为不同浓度甘露醇(mannitol)处理后OsMYB1R1超量表达和RNAi干扰水稻幼苗的生长状况。

其中：A为1周龄幼苗在含不同浓度甘露醇的培养基上的生长情况；B为1周龄幼苗在含不同浓度甘露醇的培养基上生长7天后苗高的统计结果；C为1周龄幼苗在含不同浓度甘露醇的培养基上生长7天后根长的统计结果。

图7为孕穗期OsMYB1R1超量表达和RNAi干扰水稻植株干旱处理实验。

其中：A、B、C分别为孕穗期的WT日本晴对照和OsMYB1R1超量表达水稻植株OE在干旱处理前、干旱处理后以及干旱处理并复水后的水稻植株生长状态；

D、E、F分别为孕穗期的日本晴对照WT和OsMYB1R1RNAi干扰水稻植株在干旱处理前、干旱处理后以及干旱处理并复水后的水稻植株生长状态。

图8为孕穗期OsMYB1R1超量表达和RNAi干扰水稻植株在干旱处理后的各种生理生化指标的分析。

其中：A表示MDA含量；B表示脯氨酸含量；C表示相对电导率。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、OsMYB1R1基因超表达植株的获得

为了能更好地阐明OsMYB1R1基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达和干扰表达，从转基因植株的表型来进行OsMYB1R1基因的功能验证。

一、水稻MYB转录因子编码基因基因OsMYB1R1的获得

本发明的水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1基因是从微陈列(Microarray)分析的结果发现的一个受干旱诱导的基因(Os04g49450)，利用BLAST程序发现它与拟南芥中MYB转录因子基因具有同源性，于是命名为OsMYB1R1。根据水稻基因组数据库已公布的Os04g49450序列，设计引物(P1，5’-CGGGATCCTCGATTCAAGTCTGGAGATGG-3’(如SEQ ID No.4所示)，斜体碱基为BamHI酶切位点；P2，5’-GCTCTAGAGCAAGCATCTATAGTTGCAGTGAT-3’(如SEQ ID No.5所示)，斜体碱基为XbaI酶切位点)扩增OsMYB1R1基因的蛋白编码区(SEQ ID No.3)，用于进一步研究。提取两周苗龄的野生型水稻日本晴的幼苗总RNA反转录得到第一链cDNA。以第一链cDNA为模板，用P1和P2进行PCR扩增。克隆PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，60℃30sec；72℃1min，28个循环；72℃延伸10min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段。将该回收片段与载体pGEM-T Easy连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到了OsMYB1R1基因的蛋白编码区，OsMYB1R1基因的蛋白编码区序列如SEQ IDNo.3所示，由1392个脱氧核糖核苷酸组成，编码SEQ ID No.2所示的蛋白。

二、OsMYB1R1基因超量表达载体的构建

1.用限制性内切酶BamH I和Xba I双酶切含CAMV35S启动子pCAMBIA-1301-multi载体和以引物P1：5’-CGGGATCCTCGATTCAAGTCTGGAGATGG-3’(如SEQ ID No.6所示)和P2：5’-GCTCTAGAGCAAGCATCTATAGTTGCAGTGAT-3’(如SEQ ID No.7所示)(含有BamH I识别位点GGATCC和Xba I识别位点TCTAGA)进行PCR扩增得到的OsMYB1R1基因，用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在LB平板上筛选具有卡那霉素抗性的菌落，提取质粒进行双酶切鉴定得到阳性植物表达载体，结果如图1所示。

三、OsMYB1R1基因RNAi干扰载体的构建

从质粒pBI121上以引物5’-ATGGATCCGATATCTACCCGCTTCGCGTCG-3’(如SEQ ID No.8所示)和5’-GGGAATTCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3’(如SEQID No.9所示)扩增约500bp GUS片段连接在pBluescriptⅡSK(-)上构建一个中间载体pBGUS，再以引物5’-CGGGATCCTGCAAACTGTGGCAGACATG-3’(如SEQID No.10所示)和5’-GCCCTCGAGCATTTCATCTTCGTTTCTGTTTCC-3’(如SEQ IDNo.11所示)进行RNAi片段的扩增，电泳检测，DNA纯化回收后的RNAi片段以正向和反向分别连接在中间载体pBGUS的GUS片段的两端，最后将Antisense-GUS-sense作为一个整体切下并连接到p1300M构建成RNAi载体。结果如图2所示。

四、OsMYB1R1基因转基因水稻的获得

将OsMYB1R1过表达和RNAi干扰载体用热激转化的方法分别转入农杆菌菌株EHA105中。用含OsMYB1R1过表达和RNAi干扰载体的农杆菌分别转化水稻品种“日本晴”，经过预培养、浸染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗、移栽，得到转基因植株。具体转化方法如下：

1.将健康成熟的“日本晴”水稻种子去壳后用75％的乙醇消毒1min，倒掉乙醇后用0.1％的HgCl2灭菌15-30min，用无菌水洗涤3-4次，并用无菌吸水纸吸干水分。将种子接种于NB(或N6)愈伤组织诱导培养基(含3.0mg/L2,4-D)上，32℃光照培养7-10d。将愈伤组织转入继代培养基NB(或N6)中继代4d进行共培养。

2.从-80℃的超低温冰箱中取出含有目的植物表达载体的农杆菌菌种EHA105，在含50mg/L利福平(Rif)和50mg/L卡那霉素(Kan)的AB固体培养基上划线，28℃暗培养2-3d至长出菌落。浸染时从AB固体培养基上刮取适量菌体，用AAM液体培养基(含100μmol/L乙酰丁香酮，50mg/L Rif和50mg/L Kan)稀释菌体浓度至OD₆₀₀≈0.1左右。选取生长旺盛的米黄色胚性愈伤组织在菌液中浸染5min，期间不时摇动。将浸染后的愈伤组织转移到铺有无菌滤纸的N₆-AS(含100μmol/L乙酰丁香酮)共培培养基上，于25℃暗培养2-3d。

3.共培养后的愈伤组织用无菌水洗涤至水清澈，期间应轻柔的摇动。最后一次用含400mg/L头孢霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡愈伤组织30min后置于无菌吸水纸上吸去表面水分。

4.愈伤组织转移至选择培养基上，于超净工作台内吹1-2h后置于32℃光照培养箱中持续光照培养2-3周。待抗性愈伤组织长出后，将其转移至预分化培养基上，25℃暗培养2-3周；若愈伤质量好，预分化步骤可省，直接转移至分化培养基中。

5.从预分化培养基中转移白色紧实的愈伤组织至分化培养基上，于温室中每天14h光照培养，2-3周后可见愈伤组织上长出绿点，并逐渐长出绿芽；将分化出的小苗转移至生根培养基上培养两周。

6.待水稻小苗长至三角瓶顶部时，打开封口膜，炼苗3-5d，移出培养瓶，至室外盆栽。待生长一段时间后移至大田种植。

其中，水稻转化涉及的培养基如表1所示：

表1 水稻转化涉及的培养基

实施例2、OsMYB1R1基因超量表达和干扰表达转基因水稻的分子检测

本发明OsMYB1R1基因超量表达和干扰表达转基因水稻的分子检测采用RT-PCR法进行。

选取经潮霉素筛选的抗性移栽成活植株，每株剪取1-2片叶，采用Invitrogen公司Trizol试剂抽提方法稍作修改提取水稻总RNA，总RNA经Fermentas公司的DNase I除去残留的基因组DNA后用Toyobo公司的逆转录试剂盒(Rever Tra Ace Kit)合成cDNA第一链，步骤参照说明书进行。以水稻Actin肌动蛋白基因RAc1为内标，进行RT-PCR分析。Actin引物序列如下：

RAc1Fw5’-CTTCAACACCCCTGCTATG-3’(如SEQ ID No.12所示)

RAc1Rv5’-TCCATCAGGAAGCTCGTAG-3’(如SEQ ID No.13所示)

选择OsMYB1R1特异性片段进行检测，引物序列如下：

OsMYB1R1Fw5’-ATTTGGCAAGAGGGTTATGGTG-3’(如SEQ ID No.14所示)，

OsMYB1R1Rv5’-ACACTCGGGTCCAAGGTTGA-3’(如SEQ ID No.15所示)；

反应参数：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，过表达检测使用28个循环，RNAi干扰使用35个循环；72℃10min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，重复3次。

结果如图3所示，与未转基因植株相比，OsMYB1R1在部分转基因植株中得到不同表达程度的表达差异，其中OE-4、5为超量表达株系，RNAi-1、2、5和8为RNAi干扰株系，用于进一步表型鉴定。

在实施例2结果前提下，本发明首先对OsMYB1R1基因超量表达和干扰表达转基因植物T₂代植物进行了纯合体筛选。具体步骤如下：每个株系选取30粒种子去壳，75％乙醇表面消毒1min，0.1％氯化汞处理15min，灭菌水清洗数次，用无菌镊子播种在含潮霉素的1/2MS(Murashige & Skong)培养基平皿上进行筛选，野生型日本晴作为对照，培养条件为28℃，持续光照强度为6000-7000Lux，12h光照/12h黑暗。取分子检测和潮霉素筛选结果一致的株系用于进一步的表型鉴定。

实施例3、OsMYB1R1超量表达和RNAi干扰水稻幼苗的耐旱性实验

本发明将OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰和野生型水稻种子接种于1/2MS培养基上发芽，转基因种子培养基添加潮霉素。发芽7天后，选取长势一致的幼苗移栽至营养土中。每盆分别种植12株野生型、两个超量表达株系和两个RNAi干扰株系，每个株系12株。置于人工气候箱中培养，条件设置为14小时光照强度7000lux光照，30℃，10小时黑暗26℃，相对湿度75％。2周后断水进行干旱处理，等到土壤含水量低于20％时进行复水，拍照观察复水前后幼苗生长状况的差异。

从图4中可知，在干旱处理7天后，见图4B，无论是OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰水稻还是野生型水稻幼苗都出现了叶片卷曲和萎蔫等明显缺水的表现。但是三者叶片卷曲萎蔫的程度有一定的不同：OsMYB1R1过表达幼苗叶片已经完全卷曲，野生型幼苗中大部分叶片发生卷曲，而OsMYB1R1RNA干扰幼苗有较多的幼苗叶片仍保持正常状态。复水5天后，见图4C，OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰水稻和野生型水稻幼苗恢复的情况则完全不同。OsMYB1R1超量表达幼苗绝大部分死亡，OsMYB1R1RNAi干扰幼苗则大部分存活，而野生型幼苗成活率介入前两者之间，有少数植株存活，三种幼苗复水后的表型差距极为明显。实验证明OsMYB1R1基因表达量的升高降低了水稻幼苗对干旱胁迫的耐受性，而OsMYB1R1基因表达量的降低则使水稻幼苗对干旱胁迫的耐受能力增强，OsMYB1R1基因对干旱胁迫的耐受性表现为负调控。

实施例4、OsMYB1R1超量表达和RNAi干扰水稻幼苗的耐盐性实验

本发明将OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰和野生型水稻种子接种于1/2MS培养基上发芽，转基因种子培养基添加潮霉素。将发芽1周后幼苗移入1/2MS培养液中培养。培养1周后，把培养液更换为含有150mmol/L、175mmol/L和200mmol/L NaCl培养液进行培养，每日更换一次。拍照观察不同基因型的幼苗之间生长状态的差异并检测相应的生理生化指标。

实验发现OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰水稻和野生型幼苗在150mmol/LNaCl溶液处理30小时后，再在正常培养条件下恢复培养一周时间，其表型和生长状况都没有表现出明显的差异。而在200mmol/L NaCl溶液处理下，OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰水稻和野生型三种幼苗迅速萎蔫并枯死，且萎蔫速度和过程差别不大。而在175mmol/L NaCl溶液处理后，OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰水稻和野生型三种幼苗表现出显著差异。图5为野生型、OE-5和RNAi-8三种幼苗在175mmol/L NaCl溶液处理前后的图片。从图中可知，175mmol/L NaCl溶液处理30小时后，见图5B，OsMYB1R1超量表达幼苗出现了明显的萎蔫现象，而野生型幼苗叶片大部分出现萎蔫现象，而OsMYB1R1RNAi干扰幼苗则还有较多的叶片保持绿色舒展的状态，未出现明显的卷曲萎蔫现象。盐处理48小时后，倒掉含NaCl的培养液，换成普通培养液进行恢复培养。实验发现恢复培养2天后，OsMYB1R超量表达幼苗基本死亡，野生型幼苗则部分能恢复到正常生长状态，另一部分则萎蔫并死亡，见图5C。而OsMYB1R1RNAi干扰幼苗则大部分能恢复到正常生长状态。OsMYB1R1转基因水稻幼苗的耐盐性实验结果表明，OsMYB1R1基因表达量的升高降低了水稻幼苗对高盐胁迫的耐受性，而OsMYB1R1基因表达量的降低则使水稻幼苗对高盐胁迫的耐受能力增强，OsMYB1R1基因对高盐胁迫的耐受性也表现为负调控。

实施例5、OsMYB1R1超量表达和RNAi干扰水稻幼苗甘露醇模拟干旱实验

本发明将OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰和野生型种子去颖壳，灭菌处理之后，接种于锥形瓶内的1/2MS固体培养基上，转基因种子的培养基中添加潮霉素以筛选阳性的转基因种子。接种1周后取长势一致的幼苗在无菌工作台上分别移入含有0、200mmol/L和250mmol/L甘露醇的1/2MS固体培养基上继续培养。1周后，测量不同基因型幼苗的根长和苗高并拍照。

如图6所示，OsMYB1R1超量表达幼苗受到甘露醇模拟的干旱环境影响最大，其次是野生型幼苗，受影响最小的是RNAi干扰的幼苗，见图6A。该实验同时从苗高(见图6B)和根长(见图6C)方面的差异再次证明了OsMYB1R1基因对干旱胁迫的负调控作用。

实施例6、孕穗期OsMYB1R1超量表达和RNAi干扰水稻对干旱逆境的响应

孕穗期是水稻生长周期中最关键的时期。作为一种主要粮食作物，水稻的产量和品质显得格外重要。而孕穗期和开花期受到逆境影响会明显降低水稻的产量和品质，所以水稻在孕穗期和开花期这两个时期对外界环境的变化尤为敏感。为了解孕穗期OsMYB1R1转水稻对干旱胁迫的影响，本实验将转基因材料按常规方法种植于大田，观察大田中水稻植株剑叶的出现，在大田中选取长势一致的正值孕穗期水稻植株，移入塑料盆中，尽量保证植株的完整性。每盆放入OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰和野生型植株各1株。培养2天，待植株适应新的环境后，将其放置在接近大田自然环境的地带进行干旱处理。每天对盆中土壤的水分含量进行测定。以土壤水分含量20％为干旱处理终点对植株进行复水。处理的过程中拍照并观察植株的表性变化(见图7)，并测定相关生理生化指标。

干旱处理5天后，如图7B和图7E中我们发现不同转基因水稻叶片的卷曲程度有一定的不同：相对于野生型植株，OsMYB1R1超量表达植株的叶片卷曲得更加厉害，而RNA干扰植株的叶片则大部分保持舒展状态。复水7天后，观察到因干旱而萎焉的叶片已经发黄枯死。见图7C，干旱处理并恢复培养后，超量表达植株叶片大部分变黄枯死，而野生型植株的绿色叶片比同一盆中的超量表达植株明显要多。而图7F中RNAi干扰植株的绿色叶片要比野生型的多，生长状况也更好。以上实验结果证实了水稻孕穗期OsMYB1R1基因的超量表达也降低了植株对干旱的耐受性，而表达量降低能提高植株在孕穗期期的耐旱性，OsMYB1R1基因对干旱胁迫的耐受性表现为负调控。

实施例7、OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰和野生型水稻植株干旱处理后，MDA、脯氨酸(Proline)含量和相对电导率发生变化

MDA含量和相对电导率指标与细胞膜损伤有关，它们数值的增加说明细胞特别是细胞膜受胁迫损伤程度的增加。而脯氨酸在细胞内积累能提高植物的耐旱性。本实施案例中将OsMYB1R1超量表达、RNAi干扰和野生型水稻幼苗和孕穗期水稻植株干旱处理后，水稻幼苗和叶片细胞中MDA含量、相对电导率的变化速率和脯氨酸含量都有明显的不同，见图8。图中显示，幼苗期干旱胁迫处理后，OsMYB1R1超量表达幼苗的MDA含量(见图8A)和相对电导率(见图8C)相对于野生型有明显的增高，RNAi干扰幼苗这两项指标则增加的最少。见图8B，三种植株中脯氨酸在细胞内的积累则是超量表达植株游离脯氨酸增加量最少，而RNAi干扰植株细胞中游离脯氨酸的积累最多。孕穗期水稻植株干旱胁迫处理后，得到的MDA含量、游离脯氨酸含量和相对电导率的变化与幼苗期处理的结果类似，以上实验结果说明在干旱胁迫下，OsMYB1R1超量表达植株细胞膜损伤程度较高，脯氨酸在细胞内积累较少，表现出对干旱胁迫的敏感性；而OsMYB1R1RNAi干扰水稻植株的细胞膜损伤程度较低，脯氨酸在细胞内积累较多，表现出对干旱胁迫的耐受性。从生理生化方面证明并解释了在水稻幼苗期OsMYB1R1对干旱胁迫的负调控作用。

Claims (3)

1.一种水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1在提高水稻耐干旱和/或耐高盐抗性中的应用，该基因的DNA序列如序列表SEQ ID No:1所示。

2.一种水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1在提高水稻耐干旱和/或耐高盐抗性中的应用，该基因编码的蛋白序列如序列表SEQ ID No:2所示。

3.一种培育耐干旱和/耐高盐水稻的方法，其特征在于，该方法是将水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1构建RNAi干扰载体导入水稻细胞或组织，再将被转化的水稻细胞或组织培育成水稻，通过基因表达分析筛选干扰表达水稻，得到耐干旱和/或耐高盐水稻。