CN102433346A - 水稻抗逆性相关热激蛋白基因OsHsp23.7及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻抗逆性相关热激蛋白基因OsHsp23.7如SEQ IDNo：1所示，及含有该水稻热激蛋白编码基因OsHsp23.7的重组表达载体，以及将该重组表达载体导入植物细胞，得到的抗逆性增强的转基因植株。本发明的水稻热激蛋白基因OsHsp23.7及其编码蛋白可用于培育抗逆植物，特别是培育耐干旱和/或耐盐水稻。

Description

水稻抗逆性相关热激蛋白基因OsHsp23.7及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及一种植物热激蛋白基因及其编码蛋白与应用，具体涉及一个水稻热激蛋白基因的分离克隆、功能验证和应用。

背景技术

各种非生物逆境诸如干旱和高盐胁迫对植物的生长发育有重要影响，严重时导致农作物大量减产。研究表明，热激蛋白(Heat shock proteins，Hsps)尤其是sHsp通过在逆境胁迫下维护蛋白的功能结构、阻止非天然蛋白的集聚、重新折叠变性蛋白以恢复其功能结构以及清除有潜在危害的变性蛋白或通过维护膜的稳定性，提高植物对干旱、病虫、低温逆境等胁迫的耐受作用。水稻作为重要的粮食作物之一，提高其耐逆性具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种水稻抗逆性相关热激蛋白基因OsHsp23.7及其编码蛋白与应用。

本发明所提供的水稻热激蛋白基因，名称为OsHsp23.7，来源于水稻粳稻品种日本晴(Oryza sativa ssp.japonica)，该基因在水稻基因组数据库TIGR中的编号为Os12g0569700，该基因的CDS全长630bp，编码215aa的蛋白。到目前还没有任何关于OsHsp23.7基因功能的研究报道。本发明所述基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ ID No：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加由1)衍生的核苷酸。

序列表中SEQ ID No：1的DNA序列由1003个碱基组成，该序列编码SEQ IDNo：3的核苷酸序列。

与水稻抗逆性相关的水稻热激蛋白基因的编码蛋白OsHsp23.7是具有序列表中SEQ ID No：2的氨基酸序列的蛋白质，该序列为由215个氨基酸组成的蛋白质。

含有本发明OsHsp23.7基因的表达载体、转基因细胞系及寄主菌均属于本发明的保护范围。

本发明所提供的改良植物抗逆性的方法，是将所述与抗逆性相关基因OsHsp23.7构建过表达载体导入植物组织或细胞，改良植物的抗逆性。用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。利用任意一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的OsHsp23.7基因在植物中超量表达表现出耐逆特征。

本发明的基因在构建到植物表达载体上时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子，也可使用增强子。

携带有本发明OsHsp23.7基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射以及电穿孔等常规生物技术方法转入植物细胞，并培育出对非生物逆境如干旱、盐等耐受力增强的转基因植物。被转化的植物寄主可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也适用于烟草、大豆等双子叶植物，培育抗逆的植物品种。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为OsHsp23.7基因超量表达载体pCMBIA1301M-OsHsp23.7示意图。

图2A为OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻的DNA检测。

图2B为OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻的RT-PCR检测。

图3为OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻在干旱胁迫下的生长状况和存活率。

其中：A为干旱处理前，OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻与野生型的比较；B为暴露于空气中干旱处理9.5h后，OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻与野生型(WT)的比较；C为暴露于空气中干旱处理9.5h后再复水10d，OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻与野生型的比较；D为暴露于空气中干旱处理9.5h后再复水10d，OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻与野生型成活率统计(n＝25)。

图4为OsHsp23.7基因超量表达转基因植物在高盐胁迫下的生长状况和存活率。

其中：A为高盐处理前，OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻与野生型的比较；B为高盐处理24h后，OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻与野生型的比较；C为高盐处理24h后再复水10d，OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻与野生型的比较；D为高盐处理24h后再复水10d，OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻与野生型成活率统计(n＝25)。

图5为OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻在干旱和高盐逆境下相对电导率的变化。

图6为OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻在干旱和高盐逆境下丙二醛含量的变化。

图7为OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻在干旱和高盐逆境下脯氨酸含量的变化。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、OsHsp23.7基因超量表达植株的获得

为了能更好地阐明OsHsp23.7基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达，从转基因植株的表型来进行OsHsp23.7基因的功能验证。

一、OsHsp23.7基因过表达载体pCAMBIA1301M-OsHsp23.7的构建

将OsHsp23.7全长cDNA(SEQ ID No：3)序列经PCR扩增后定向克隆到pCAMBIA1301M载体CAMV35S启动子下游，用于构建水稻pCAMBIA1301M-OsHsp23.7超量表达的植物双元表达载体。所用引物序列为P1：5’-CGGGATCCATGAGCCTACTGCTGCT-3’和P2：5’-AACTGCAGTCGTACACCTGGATCAACA-3’(含有BamH I识别位点GGATCC和Pst I识别位点CTGCAG)。经冻融法转入农杆菌DH5α中后，在LB平板上筛选具有卡那霉素抗性的菌落，提取质粒进行双酶切鉴定得到阳性植物表达载体pCAMBIA1301M-OsHsp23.7。

二、OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻的获得

将pCAMBIA1301M-OsHsp23.7用热激转化的方法转入农杆菌菌株EHA105中。用含pCAMBIA1301M-OsHsp23.7的农杆菌转化水稻品种“日本晴”，经过预培养、浸染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽，得到转基因植株。具体转化方法如下：

1.将健康成熟的“日本晴”水稻种子去壳后用75％的乙醇消毒1min，倒掉乙醇后用0.1％的HgCl₂灭菌15-30min，用无菌水洗涤3-4次，并用无菌吸水纸吸干水分。将种子接种于NB(或N6)愈伤组织诱导培养基(含3.0mg/L 2，4-D)上，32℃光照培养7-10d。将愈伤组织转入继代培养基NB(或N6)中继代4d进行共培养。

2.从-80℃的超低温冰箱中取出含有目的植物表达载体的农杆菌菌种EHA105，在含50mg/L利福平(Rif)和50mg/L卡那霉素(Kan)的AB固体培养基上划线，28℃暗培养2-3d至长出菌落。浸染时从AB固体培养基上刮取适量菌体，用AAM液体培养基(含100μmol/L乙酰丁香酮，50mg/LRif和50mg/LKan)稀释菌体浓度至OD₆₀₀≈0.1左右。选取生长旺盛的米黄色胚性愈伤组织在菌液中浸染5min，期间不时摇动。将浸染后的愈伤组织转移到铺有无菌滤纸的N₆-AS(含100μmol/L乙酰丁香酮)共培培养基上，于25℃暗培养2-3d。

3.(1)共培养后的愈伤组织用无菌水洗涤至水清澈，期间应轻柔的摇动。最后一次用含400mg/L头孢霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡愈伤组织30min后置于无菌吸水纸上吸去表面水分。

(2)愈伤组织转移至选择培养基上，于超净工作台内吹1-2h后置于32℃光照培养箱中持续光照培养2-3周。待抗性愈伤组织长出后，将其转移至预分化培养基上，25℃暗培养2-3周；若愈伤质量好，预分化步骤可省，直接转移至分化培养基中。

(3)从预分化培养基中转移白色紧实的愈伤组织至分化培养基上，于温室中每天14h光照培养，2-3周后可见愈伤组织上长出绿点，并逐渐长出绿芽；将分化出的小苗转移至生根培养基上培养两周。

(4)待水稻小苗长至三角瓶顶部时，打开封口膜，炼苗3～5d，移出培养瓶，洗去根上的培养基，移至室外盆栽。待生长一段时间后移至大田种植。

其中，水稻转化涉及的培养基如表1所示：

表1水稻转化涉及的培养基

实施例2、OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻的分子检测

本发明OsHsp23.7基因超量表达转基因分子检测采用PCR和RT-PCR法进行。

2.1OsHsp23.7基因超量表达转基因植株DNA的PCR分子检测

1)用CTAB法提取水稻基因组DNA：

(a)取适量幼嫩叶片，置于1.5ml离心管中，液氮速冻后用配套的塑料研磨棒研磨，加600μl 65℃预热的2×CTAB；

(b)65℃水浴15min，其间上下颠倒数次；

(c)加入600μl氯仿/异戊醇(V：V/24：1)轻轻晃动充分混合。

(d)室温下12000r/min离心10min；

(e)取500μl上清于一新1.5ml离心管，加入预冷的无水乙醇1ml混匀放置20℃30min；

(f)室温下12000r/min离心10min，去上清，用75％乙醇洗涤沉淀，室温自然晾干；

(g)加入100μl TE溶解。

2)OsHsp23.7基因超量表达转基因植株的PCR鉴定

取具有潮霉素抗性的OsHsp23.7基因超量表达转基因植株基因组DNA100ng，以引物35SF：5′-CGCACAATCCCACTATCCTT-3′和OsHSP23.7 Rv5’-AGTCGTACACCTGGATCAACA-3’进行PCR扩增鉴定，同时设置过表达质粒为阳性对照，未转基因植株基因组DNA为阴性对照。结果如图2A所示，转基因阳性植株都能扩增出全长约920bp的DNA片段，质粒对照也能扩出相同全长DNA片段。

2.2OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻的RT-PCR检测

选取经潮霉素筛选的抗性移栽成活植株，每株剪取1-2片叶，采用Invitrogen公司Trizol试剂抽提方法稍作修改提取水稻总RNA，总RNA经Fermentas公司的DNase I除去残留的基因组DNA后用Toyobo公司的逆转录试剂盒(ReverTra Ace Kit)合成cDNA第一链，步骤参照说明书进行。以水稻Actin肌动蛋白基因RAc1为内标，进行RT-PCR分析。

Actin引物序列如下：

RAc1 Fw 5’-CTTCAACACCCCTGCTATG-3’

RAc1 Rv 5’-TCCATCAGGAAGCTCGTAG-3’

选择OsHSP23.7特异性片段进行检测，引物序列如下：

OsHSP23.7Fw 5’-GCACGATGTTCATCCTTGTT-3’

OsHSP23.7Rv5’-GGACCTTGATGGTGTTTGT-3’

反应参数：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，28个循环；72℃10min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，重复3次。

结果如图2B所示，与未转基因植株相比，OsHsp23.7在部分转基因植株中得到不同表达程度的增强表达，其中1、5、21号转基因植株获得强表达，用于进一步表型鉴定。

在实施例2结果前提下，本发明首先对OsHsp23.7基因超量表达转基因植物T2代植物进行了纯合体筛选。具体步骤如下：每个株系选取30粒种子去壳，75％乙醇表面消毒1min，0.1％氯化汞处理15min，灭菌水清洗数次，用无菌镊子播种在含潮霉素的1/2MS(Murashige&Skong)培养基平皿上进行筛选，野生型日本晴作为对照，培养条件为28℃，持续光照强度为6000-7000Lux，12h光照/12h黑暗。取分子检测和潮霉素筛选结果一致的株系用于进一步的表型鉴定。

实施例3、OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻对干旱处理的反应

本发明选取实施例2中得到的三条独立的超量表达转基因纯合水稻用于表型筛选。取纯合转基因株系(1、5、21号)种子和野生型日本晴种子在培养基中发芽1周后移入1/2Hoagland液体培养基再培养2周，将幼苗从培养液中取出并用吸水纸吸干根部表面水分，暴露于空气中(25±1℃，相对湿度40±5％)干旱处理9.5h，再移入1/2Hoagland液体培养基中恢复培养10d。

暴露于空气中干旱处理9.5h后，如图3B所示，OsHsp23.7超表达植株和对照野生型大多数叶片萎焉，出现严重的干旱胁迫表型。

暴露于空气中干旱处理9.5h后再复水10d，如图3C所示，大部分野生型植株的叶片完全卷曲、萎焉，甚至枯死，而大多数OsHsp23.7超表达植株仍呈绿色。

植物在干旱后的复水能力也是抗旱的一个重要指标。暴露于空气中干旱处理9.5h后再复水10d，存活率统计结果如图3D所示，OsHsp23.7超表达植株的存活率在30％(37％-47％)以上，而野生型存活率只有10％。

干旱及复水实验表明，OsHsp23.7超量表达增强了植物的耐旱性，结果证实OsHsp23.7在植物对干旱的响应中起了重要的作用。

实施例4、OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻对高盐处理的反应

本发明选取实施例2中得到的三条独立的超量表达转基因纯合水稻用于表型筛选。取纯合转基因株系(1、5、21号)种子和野生型日本晴种子在培养基中发芽1周后移入1/2Hoagland液体培养基再培养2周，将苗子从培养液中取出并用吸水纸吸干根部表面水分，置于含200mmol/L NaCl的1/2Hoagland液体培养基中处理24h，用水冲洗根部，再移入1/2Hoagland液体培养基中恢复培养10天。

高盐处理24h后，如图4B所示，野生型植株几乎全部萎焉，而OsHsp23.7超表达转基因水稻还可见伸展的绿叶。

高盐处理24h后再复水10d，如图4C所示，大部分野生型植株的叶片完全卷曲、萎焉，甚至枯死，而大部分OsHsp23.7超表达转基因水稻植株除叶尖枯萎外生长良好。

高盐处理24h后再复水10d，存活率统计结果如图4D所示，OsHsp23.7超表达植株的存活率在60％以上(62％-75％)，而野生型存活率只有10％。

高盐及恢复实验表明，OsHsp23.7超量表达增强了植物的耐盐性，结果证实OsHsp23.7基因在植物对高盐的响应中起了重要的作用。

实施例5、OsHsp23.7基因超量表达转基因水稻在干旱和高盐逆境下生理生化指标的变化

本发明选取实施例2中得到的三条独立的超量表达转基因纯合水稻用于生理生化指标检测。

取纯合转基因株系(1、5、21号)种子和野生型(WT)日本晴种子在培养基中发芽1周后移栽至土盆中，每盆加入等量土(腐殖土∶蛭石＝1∶1)和等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致。每盆分别种植18株左右转基因和野生型对照，置于人工气候箱培养。3周后用20％PEG6000和200mmol/L NaCl溶液代替水浇灌，处理3天，取叶片按常规方法进行细胞质膜稳定性(相对电导率)、丙二醛(MDA)含量和脯氨酸含量的测定，试验设三次重复。

细胞质膜是细胞与环境之间的界面，各种逆境对细胞的影响首先作用于质膜。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透过性能力。当植物受到逆境影响时，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，选择透性下降甚至丧失，从而使细胞内的电解质与某些小分子有机物质外渗，以至于植物细胞浸提液的电导率增大。

3周龄幼苗用20％PEG-6000和200mmol/L NaCl溶液浇灌处理3天后，如图5所示：OsHsp23.7超表达植株电导率均低于WT，而处理前两者没有明显差异，说明在干旱和高盐逆境下，OsHsp23.7超表达植株的细胞膜具有较高的稳定性，其细胞内含物渗出量少。

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的产物，MDA在体内积累，对膜和细胞造成进一步的伤害。3周龄幼苗用20％PEG-6000和200mmol/L NaCl溶液浇灌处理3天后，如图6所示：OsHsp23.7超表达植株电导率均低于WT，而处理前两者没有明显差异，说明在干旱和高盐逆境下，OsHsp23.7超表达植株的膜脂过氧化程度较低，细胞的质膜损坏较轻。而OsHsp23.7超表达植株中脯氨酸含量增加的程度显著高于WT中的(图7)。这意味着在干旱和高盐胁迫下，OsHsp23.7超表达植株具有更高的渗透调节能力。

Claims (5)

1.一种水稻热激蛋白基因OsHsp23.7在培育抗逆性水稻中的应用，该水稻热激蛋白基因OsHsp23.7的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，其编码蛋白序列SEQ ID No：2。

2.含有水稻热激蛋白基因OsHsp23.7的重组表达载体，是在pCAMBIA1301M载体的多克隆位点插入SEQ ID No：3所示基因得到的重组表达载体pCAMBIA1301M-OsHsp23.7。

3.含有水稻热激蛋白编码基因OsHsp23.7的转基因细胞系或宿主菌。

4.一种培育抗逆水稻的方法，是将权利要求2所述的重组表达载体导入水稻细胞中，得到抗逆水稻。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述抗逆水稻是抗干旱和/或抗高盐水稻。

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