CN102791729A

CN102791729A - 用于作物改良的成花诱导剂的分子工程

Info

Publication number: CN102791729A
Application number: CN2011800123241A
Authority: CN
Inventors: 洪益国; S·杰克逊; 李春阳
Original assignee: PLANT BIOLOGICAL SCIENIC CO Ltd; University of Warwick
Current assignee: University of Warwick
Priority date: 2010-03-05
Filing date: 2011-03-07
Publication date: 2012-11-21
Also published as: WO2011107808A1; MX2012008975A; AU2011222740B2; US9238820B2; AU2011222740A1; GB201003702D0; EP2542568A1; CA2789938A1; US20130081151A1; BR112012020122A2

Abstract

一种植物，该植物含有修饰的FT多核苷酸，该FT多核苷酸表达修饰的多肽，该植物表现改变的开花时间、成花数量和/或增加的种子产量。公开了赋予不同表型的不同突变体序列。

Description

用于作物改良的成花诱导剂的分子工程

技术领域

本发明涉及开花时间，成花数量和/或种子产量改变了的植物，并提供生产这种植物的方法。

背景技术

在光周期的开花植物中，开花时间是一个重要的发育开关，它能被叶片感知的环境信号所影响。开花基因座T(Flowering Locus T，FT）基因是调节开花信号途径的一个重要元件。当诱导植物开花时，产生韧皮部-移动信号称为“成花素”，成花素通过韧皮部运输流被运输至茎端分生组织（SAM），在此成花素诱导花发育^1，2。在拟南芥中，已经显示移动的成花素由开花基因座T(ET）基因所编码。FT特异性地在韧皮部细胞中而不在SAM³中转录成mRNA。然而，其蛋白质产物却在苗端发挥功能^4-6。拟南芥FT是一个由175个氨基酸（aa）组成的23kd的球形小蛋白，与哺乳动物中的磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）或Raf激酶抑制剂蛋白同源。FT属于一组六个紧密相关的蛋白，包括金鱼草（Antirrhinum）的TFL 1和CENTRORADIALIS（CEN）。

收集的证据表明：拟南芥的FT蛋白^7,8与它的番茄的SFT⁹，水稻的Hd3a¹⁰和葫芦的Cm-FTL1/2¹¹直向同源物作为非细胞自主开花信号的一个元件，这个信号通过韧皮部被运输至SAM，然而，FT mRNA在长距离成花素信号中的活动的作用仍然未知¹²。一旦FT存在于SAM中，它与由开花基因座D编码的bZIP转录因子、FD相互作用，以便激活成花识别基因例如APETELA1和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1。后者激活LEAFY并诱导开花^4,6。在控制水稻FT直向同源物Hd3a的表达及Hd3a本身的基因中，自然遗传变异有助于耕种水稻中开花时间的多样性¹³。几种物种的转基因植物中FT的过表达与早花有关。US 6,225,530描述了一种分离的多核酸编码FT多肽。Hanzawa等也描述了植物中修饰的FT和它们的表达序列¹⁴。

开花时间和花（及种子）的质量是作物的产量和质量的重要方面，有必要在农业中创造新工具来控制多种植物的开花时间和数量及种子的产量。不但通过增加开花来提高植物产量，而且在某些特定植物中，期望通过延迟或完全阻止开花来提高植物产量。本发明旨在解决这些需求。FT的生物工程或通过TILLING、突变育种和FT的筛选创造新型的FT等位基因，能够为新作物育种提供有益等位基因以提高产量，从而满足全球粮食、饲料和能源的快速增加的需求。

发明内容

开花基因座T(ET）是成花信号途径的一个重要元件。已知FT与控制开花时间有关。令人惊讶地，发明人发现改变FT蛋白质的氨基酸序列也能增加花的数量和种子的产量。本发明公开FT的修饰导致单个氨基酸变化，提供了新的等位基因，该等位基因具有令人惊讶地提高作物产量的分子育种的潜能。用丙氨酸扫描方式和植物基于病毒的成花诱导系统，本发明描述了拟南芥FT蛋白的分子工程以产生修饰的FT，该FT具有改变的表型，例如增强引发开花的能力，导致更多的花及种子产量的增加。当修饰基因在植物中表达时，在FT序列中保守残基的修饰导致表型变化。

因此，本发明涉及转基因植物，该转基因植物表达修饰的FT基因或多核苷酸，所述基因编码修饰的氨基酸序列，其特征在于，所述表达导致表型区别于野生型表型又区别于野生型过表达FT的植物。以在FT氨基酸序列中改变保守残基的方式修饰所述基因。本发明的另一方面涉及生产这种植物的方法。

一方面，本发明涉及一种转基因植物，该转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物显示改变的开花分布型。

具体地，本发明涉及一种转基因植物，该转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物显示以下表型之一：

a)提高的开花能力；

b)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量；

c)不抽薹，不开花；

d)在氨基酸修饰不含有Y85H的情况下，正常抽薹及延迟开花，或者

e)正常抽薹，不开花。

一方面，本发明涉及一种转基因植物，该转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物显示提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量。

另一方面，本发明涉及生产如上所限定的植物的方法，所述方法包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。

进一方面，本发明涉及一种在植物中诱导提高开花及增加种子产量的方法，该方法包括在所述植物中引入且表达修饰的FT多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。

进一方面，本发明涉及一种分离的核酸分子或序列，所述核酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，当在植物中引入所述核酸时，所述修饰导致植物改变的表型，其中，所述表型选自：

a)提高的开花能力；

b)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量；

c)不抽薹，不开花；

e)正常抽薹，不开花。

另一方面，本发明涉及一种分离的核酸分子或序列，所述核酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述修饰由一个或者多个以下残基的取代组成或者含有一个或者多个以下残基的取代：V70、D73、R119、R173、D71、L67、S78或者Q140。

另一方面，本发明涉及分离的核酸在植物中编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽以改变开花的数量和/或种子和/或果实的产量中的用途。

本发明涉及一种修饰的植物，所述植物含有分离的核酸分子或序列，所述核酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述修饰由一个或者多个在表1中尤其在组Ⅱ-V中被识别的残基的取代组成或者含有一个或者多个在表1中尤其在组Ⅱ-V中被识别的残基的取代。

附图说明

结合以下非限制性附图阐述本发明。

图1拟南芥和其他种类植物的FT氨基酸序列的对比。表明了磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）域与假定的酰胺化作用位点。筛选用于修饰的各个氨基酸残基用粗体表示。表明了所有物种中保守氨基酸（注上星号的）。对于图1，编号基于拟南芥的序列的编号，在此参照拟南芥的直向同源物，当拟南芥序列比，例如水稻的直向同源物，少含有2个N端氨基酸时，必须从图1所示编号中减去两个氨基酸。

图214个基于病毒的成花诱导载体的构建。（a）用于它们的构建的PVX载体和引物序列。（b）使用引物对A和B，或C和D用于PVX/FT突变体的构建的产生两个重叠产物的重叠PCR。如前所述构建PVX/FT和PVX/mFT¹²。表明了基于PVX的载体的轮廓。

图3FT_V70A在成花诱导和种子生产中具有增强的生物活性。（a-e）观察短日照（SD）烟草（N.tabacum）马里兰州猛犸（Maryland Mammoth）（MM）的不同开花表型：在非诱导的长日照（LD）下模拟接种的植物(a)，或者接种PVX/mFT的植物(b)、接种PVX/F的植物(d)或接种PVX/FT_V70A的植物(e)，以及在诱导SD条件下的MM植物(c)。(f,g)接种PVX/FT的SD烟草马里兰州猛犸植物上的种荚(f)或接种PVX/FT_V70A的SD烟草马里兰州猛犸植物上的种荚(g)。(h)在三个单独实验中每个接种植物的种荚的平均数量的分析。表明了每个实验中使用的植物的数量(n)。当与PVX/FT对比时，所有样品的T检验（student t-tests）显示了每个接种PVX/FT_V70A的植物的种荚的数量的显著性差异(P=0.0002)。(i)种荚的大小。除了对照(c)的所有植物(a,b,d-g)在LD条件下生长。接种后7周（7-wpi）的照片(a-e)，12-wpi的照片(f,g)或者14-wpi的照片(i)。

图4FT_V70A增强成花诱导。尽管FT和FT_V70A都有相似的引发植物抽薹的能力(b)，但FT_V70A引起早花芽的形成并将产生更多的花(a)。6个SD烟草马里兰州猛犸植物接种PVX/mFT(mFT)、PVX/FT(FT)、PVX/FT_V70A(FT_V70A)或PVX/FT_R173A(FT_R173A)。在接种后21,28和35天通过茎高测定抽薹并统计花及花芽的数量。FT_R173A、FT的功能缺失型突变体(表1)被用作附加对照。

图5FT_V70A表达的分子分析。(a-c)病毒瞬时FT RNA的检测。通过半定量RT-PCR在系统的幼叶中检测病毒瞬时FT RNA(a)和18S rRNA(b)。从模拟接种的或者接种基于PVX的基因表达载体5-wpi的植物收集的幼叶中提取总RNA样品，用无RNase活性的DNase（RNase-free DNase）预处理，并如前所述的用于RT-PCR检测¹²。测序RT-PCR产物以证实修饰的序列(c)。图中表明了1kb的DNA梯及RT-PCR产物的大小和位置。用于改变FT蛋白的氨基酸的核苷酸突变用下划线标出，(d-e)SD烟草马里兰州猛犸植物的FT蛋白的蛋白印迹分析(d)和PVX外壳蛋白的蛋白印迹分析(e)。(f)考马斯亮蓝染色的凝胶显示从模拟接种的植物或接种PVX/mFT、PVX/FT、PVX/FT_V70A或PVX/FT_R173A5-wpi的植物的幼叶中提取的等上样量的可溶性蛋白。表明了蛋白标记、FT和PVX CP的位置和大小。FT_R173A，一种新发现的FT功能缺失型的突变体(表1)被用作附加对照。

图6用于大麦转化的FT过表达盒的构建。用于拟南芥FT的编码序列及它的新等位基因将通过使用高保真度pfu聚合酶、特异性引物和cDNA克隆(图1a)作为模板进行PCR扩增，经Xhol和Spel消化，克隆到双元载体pBract211的Xhol/Spel位点以产生pBract211/FT(对照)、pBract211/mFT(对照)和pBract211/FT_V70A。这三个表达盒将用于大麦转化。

图7在大麦中通过基于病毒的载体的GFP表达。修饰鸭茅轻花叶病毒(CMMV)¹⁷的传染性cDNA克隆以产生用于新的亚基因组(sg)RNA的体外生产的载体。这种新的sgRNA编码目的基因的mRNA以取代病毒外壳蛋白基因并用作蛋白质翻译的mRNA。在新构建的CMMV载体中克隆GFP编码的序列。混接CMMV基因组RNA和新的sgRNA-GFP转录体的大麦叶片组织显示通过共焦显微镜检查显露出的GFP绿色荧光(a；左边：GFP荧光，中间：叶绿素自体荧光；右边：合并图像)。然而，在模拟接种的大麦植物中没有观察到GFP特异荧光(b)。在感染植物中GFP mRNA的病毒表达能够很容易地被RT-PCR检测到(c).Bar=100μm。

图8在大麦中通过FT的分蘖和带有谷粒的穗头的提高的产量。在新构建的CMMV载体中克隆野生型拟南芥FT编码的序列。幼嫩大麦植物混接CMMV基因组RNA和sgRNA-FT或者sgRNA-GFP转录体。后者用作阴性对照。与具有GFP表达的植物相比，接种后16天后，FT的病毒表达引起提早的植物发育并增加分蘖的数量(a,b)。接种后65天后，FT-表达的大麦植物(c)比GFP-表达的植物(d)形成更多的带有谷粒的穗头(箭头所示)。

图9在SD下在烟草马里兰州猛犸（MM）中FT_V70A对于成花诱导和种子产量具有增强的生物活性。模拟接种(a,e,i)或用PVX/mFT(b,f,j)、PVX/FT(c,g,k)或PVX/FT_V70A(d,h,I)处理MM植物，并在25℃下12小时SD光周期下生长。接种后35-(a-d),56-(e-h,k,I)和84-(i,j)天拍照。模拟接种的(i)或者PVX/mFT(j)处理的植物最终开花且产生种荚。

图10在SD下在烟草马里兰州猛犸（MM）中FT_V70A的病毒瞬时表达促进二次出芽和开花。用PVX/FTV70A(a,b)或PVX/FT(c,d)处理MM植物，并在25℃下12小时光周期下生长。在引发成花腋芽和花不断发育的侧枝的发育中，FTV70A(a,b)相比FT(c,d)具有增强的功能。在接种后70天收获从初次花产生的成熟的种荚。剩余的非成熟的主种荚依附于经PVX/FT处理的植物(c,d)。接种后70天拍照。植物轮廓部分被放大以便显示腋枝和新形成的成花芽(箭头)。

图11在SD下在烟草马里兰州猛犸（MM）中FT_V70A的病毒瞬时表达促进二次发芽和开花。用PVX/FT或PVX/FT_V70A处理MM植物，并在25℃下12小时光周期下生长。FT_V70A的表达诱导腋枝、二次成花芽、花和种荚的进一步发育(箭头，a-c)。在植物接种后70天收获从初次花产生的成熟的种荚。接种后84天(a)或98天(b,c)拍照，植物(i,ii)的箱形断面被放大以便显示腋枝和新形成的二次成花芽与花。

图12在SD下在烟草马里兰州猛犸（MM）中FT_V70A提高成花诱导和种子产量。当与模拟处理或PVX/mFT处理(a,b)相比时，FT或来自PVX/FT的FTV70A或PVX/FT_V70A有效诱导早抽薹和早开花。然而，经PVX/FT_V70A处理的MM植物相比经PVX/FT(b,c)处理的显著地产生更多的花和种荚。在接种后21、28和35天通过茎高测定抽薹并统计花和成花芽的数量。在接种后70天和105天统计总的初次和二次种荚。

图13FT基因的病毒瞬时表达的检测。(a)模拟接种的或经PVX/mFT(mFT)、PVX/FT(FT)或PVX/FT_V70A(V70A)处理的MM植物中病毒瞬时FT基因的RT-PCR分析。(b-d)在试验过程中，病毒瞬时FT特异性RT-PCR产物的直接测序证实重组的病毒在mFT、野生型FT(起始密码子ATG用下划线标示)中保持无义（下划线）和缺失（Δ）双重突变或者在FTV70A中保持同义突变（下划线）。(f-g)拟南芥FT蛋白和PVX CP的蛋白印迹分析。在模拟接种的MM植物或用PVX/mFT处理的植物中检测非内源或病毒瞬时FT蛋白。然而，拟南芥FT蛋白的表达在经PVX/FT或PVX/FT_V70A处理的MM植物中很容易检测到(f)。病毒CP在经PVX/mFT、PVX/FT或PVX/FT_V70A处理的植物中检测到，但是在模拟接种的植物中检测不到。(g).考马斯亮蓝染色的凝胶显示总的可溶性蛋白样品的等负荷。(h).表明1.0kb的DNA和蛋白标记的位置和大小。

图14在SD MM烟草植物中拟南芥FT的RT-PCR病毒传递和表达。用引物PP82和PP83通过RT-PCR在两个接种的(a,b)和系统的(c,d)幼叶中检测病毒瞬时FT RNA(a,c)和18S rRNA(b,d)[Li C,Zhang K,Zeng X,JacksonS,Zhou Y and Hong Y(2009)A cis element within Flowering Locus T mRNAdetermines its mobility and facilitates trafficking of heterologous viral RNA.JVirol 83:3540-3548]。

图152M转基因大麦。大麦的转化。用pBract214-FT_V70A转化春麦，黄金的承诺（Golden Promise），比用pBract214-FT或pBract214-mFT转化的大麦产生更多的穗头。转化后2个月拍照。

图164M转基因大麦。FTV70A的转基因表达显著提高了大麦的产量。从用pBract211-mFT、pBract211-wtFT或pBract211-FTV70A转化的单个大麦植物的穗头中统计谷粒数。将表达的FTV70A与表达的mFT大麦转化株相比较，每株系/植物的总谷粒数增加了大约85.7%。具有零复制的任意三个转基因构建的再生植物用作“零转化对照（Null transformation control）”。T检验显示谷粒产量上的显著性差异存在于FTV70A-转基因株系和mFT-转基因株系之间(p=0.017)以及存在于FTV70A-转基因株系和wtFT-转基因株系之间(p=0.003)；然而，在mFT-转基因株系和wtFT-转基因株系之间不存在显著性差异(p=0.178)。

图17在SD下在MM植物中FT_T27A比FT产生更多的花。

具体实施方式

现在将进一步描述本发明。在以下段落中，本发明的不同方面将更加详细地阐述。除非明确地反向表明，如此阐述的每方面可与任何其他方面结合。尤其，表明作为优选的或有益的任何特征可与任何其它特征或表明作为优选的或有益的特征结合。

除非另有说明，本发明的实例将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的传统技术，属于现有技术。文献中充分解释了这些技术。

第一方面，本发明涉及一种转基因植物，该转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物显示以下表型之一：

a)提高的开花能力；

b)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量；

c)不抽薹，不开花；

d)在氨基酸修饰不含有Y85H的情况下，正常抽薹及延迟开花或者

e)正常抽薹，不开花。

拟南芥FT是一个由175个氨基酸组成的球型小蛋白，与哺乳动物中的磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）或Raf激酶抑制剂蛋白同源。开花基因座T(FT）基因在不同种植物中高度保守。FT氨基酸序列的比对示于图1。PEBP域和酰胺化作用位点是特别保守。通过比较拟南芥FT和其直向同源物与水稻和其他物种的氨基酸序列，我们识别了43个氨基酸，包括9个处于保守的PEBP域的氨基酸、3个处于假定的酰胺化位点的氨基酸，在119位点（R119）的精氨酸残基，在140位点(Q140)的谷氨酰胺残基和许多N-端残基，作为用于分子修饰的靶。

本文描述的实验中，每个氨基酸都用丙氨酸（Ala,A）取代以产生43个不同的单个氨基酸修饰的FT蛋白（表1）。这通过使用特异引物的PCR和基于重叠PCR的突变发生实现（表3，实施例8）。然后将序列克隆到基于马铃薯病毒X（PVX）的成花诱导系统¹²(图2b)。分别使用野生型FT和无义突变体mFT作为阳性和阴性对照¹²，短日照（SD）烟草变种MM在非诱导的长日照条件下，我们发现，通过半定量(sq)RT-PCR和蛋白印迹证实，14种FT衍生物的病毒异位表达（表1）在非诱导的长日照（LD）条件下在短日照（SD）烟草马里兰州猛犸（MM）植物中产生5种不同的表型（表1）。

表1 单个氨基酸突变对拟南芥FT蛋白的生物功能的效果

^*表型是对比于经PVX处理的表达拟南芥wtFT蛋白的MM植物的表型

这些数据表明本文识别的不同保守的氨基酸对FT生物活性有不同的影响且不遵循理论。它们很可能通过影响FT蛋白功能的不同方面来达到效果，例如非细胞自主成花素信号和/或细胞自主成花诱导。本文所描述的本发明的不同方面如表1详细描述的利用FT多肽中的特异氨基酸的变化。具体地，表达修饰的FT核苷酸的转基因植物在本发明的范围内，该修饰的FT核苷酸编码FT多肽，与野生型序列相比，该FT多肽如在上述限定的任意突变群I至V（或直向同源物的序列中的等效突变）中所描述的具有改变的序列。

根据本发明的修饰的FT多核苷酸是一种修饰的核酸序列，即，修饰的FT基因，其序列不同于野生型多核苷酸、基因或核酸序列。

本文所述的野生型是指没有被修饰的植物且优选是相同物种。文中所述的增加可以是两倍或更多，或者描述至少10-50%的增加，例如至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%或更多。

通常,为了本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”是指关于，例如，核酸序列、表达盒、基因构建或载体，它们含有核酸序列或用核酸序列转化的有机体并表达根据本发明的核酸序列、表达盒或载体，所有这些构建由如下之一的重组方法所引起：

(a)在本发明方法中有益的编码蛋白的核酸序列，或

(b)与根据本发明的核酸序列可操作地连接的基因控制序列，例如，启动子，或

(c)a)和b)

这些构建并不位于自然遗传环境中或通过重组方法进行修饰，修饰可能采用不同的形式进行，例如，取代、添加、删除、倒置或插入一个或多个核苷酸残基。自然遗传环境被认为是在原始植物或者基因组文库中出现的自然基因组或染色体位点。至于基因组文库，优选至少部分保留核酸序列的自然遗传环境。环境至少在一边侧翼核酸序列并具有序列长度至少为50bp，优选为至少500bp，特别优选为至少1000bp，最优选为至少5000bp。当表达盒被非自然的，合成的(“人工的”)方法例如诱变处理修饰时，自然发生的表达盒-例如，如本文限定，核酸序列的自然启动子与在本发明方法中有用的编码多肽的相应的核酸序列的自然发生的结合-成为转基因表达盒。例如在US5,565,350或WO 00/15815中描述了合适的方法。

如上所述，用于本发明的目的的转基因植物如此理解为用于本发明方法的核酸并不在上述植物的基因组中的自然位点上，可能用于核酸的同源或异源表达。然而，如前所述，转基因的也意味着，当根据本发明的不同实施方式的核酸在植物基因组的自然位点上时，相对于自然序列，序列已被修饰，和/或自然序列的调控序列已被修饰。具体地，转基因植物可能是指通过方法产生的植物,所述方法并不仅仅依赖于传统的育种。植物不能随身携带“转基因”，但可以通过诱变产生。转基因的优选地理解为在基因组中的非自然位点上的根据本发明的核酸的表达，即发生的核酸的同源的或，优选地，异源的表达。本文提到优选的转基因植物。修饰的FT多核苷酸编码修饰的多肽，该修饰的多肽的氨基酸序列不同于野生型多肽。修饰的多肽含有氨基酸修饰，例如删除、添加或取代。优选地，修饰是一个或多个氨基酸在序列上的氨基酸取代。在一种优选的实施方式中，修饰由单一的氨基酸取代组成。取代可能是保守的或非保守的。在一种实施方式中，取代是指非保守的取代，即氨基酸用另一种不具有相同化学性质的氨基酸代替。最优选的是用不引起蛋白结构改变的中性氨基酸取代，例如丙氨酸(Ala,A)或苯丙氨酸(Phe,F)。

不引起蛋白质结构改变的取代是优选的。例如，对于A的突变使蛋白质折叠同时影响肽的生物功能。在此特定的氨基酸的化学性质的变化对野生型功能是至关重要的，所述氨基酸的改变使突变体植物产生不同的表型。然而,基于本文提供的信息，本领域技术人员将意识到除了本文公开的用A取代外的氨基酸取代以及用其他的氨基酸取代也在本发明范围内，特别是那些能使蛋白质折叠但与天然残基具有不同性质的取代被期望有相似的效应。因此这种取代在技术人员的技术范围内。

技术人员将意识到实现所需的氨基酸取代，相应的密码子必须改变，而且由于DNA的简并密码子，目标密码子的不止一个改变可能在肽中产生所需的取代。

根据本发明的植物表现出不同于野生型表型的表型。特别是，植物表现出改变的的开花型。术语开花型可以指开花的增加和/或开花时间的改变。用于本文的增加的开花被理解为每株植物增加的花数目，从而导致种子产量的增加。开花时间可能提前或延迟。例如，比表达野生型FT的植物提前1周开花。植物表现延迟开花，比表达野生型FT的植物晚一周开花。然而，发明人惊奇地发现改变FT蛋白的氨基酸序列也能够增加花和种荚的数量。同时还观察到能增加种子的产量（表1，图3）。

因此，在优选的实施方式中，本发明涉及一种转基因植物，该转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物表现增加的开花和增加的产量，即，增加的果实和/或种子的产量。本公开提供了如此修饰的实例。例如，修饰为取代并且所述取代含有或由V70的或T27的或V70和T27两者的取代组成。取代也可能是用A取代。因此，在修饰的FT多核苷酸中，编码V70和/或T27的密码子可能转变为编码A(GCU,GCC,GCA,GCG)的密码子。植物进一步显示改变的开花时间。

用于本公开的氨基酸残基的数量是基于拟南芥FT氨基酸序列的数量。如图1所示的数量。因此，在拟南芥FT氨基酸序列中的V70是保守PEBP域(YTLVMVDPDVPSPSNPHLREYL)中的第二V残基。由于在其他物种中FT氨基酸序列可能含有更少或更多的氨基酸（最典型的，1到2个附加或减少的氨基酸），在氨基酸序列中第二个保守V残基的位置可能不是70，但是可能是69、71或72。在一些实施例的植物种类中根据本发明的目标残基的位置如图1所示。换句话说，根据本发明的这方面的一种实施方式，修饰是取代并且所述取代含有或由PEBP域中的第二保守V的取代组成，该PEBP域包括以下序列或者其至少90%同源的序列：YTLVMVDPDVPSPSNPHLREYL。在另一实施方式中，在大约27位置上的N端残基被修饰。

所述植物表达的肽序列如SEQ ID NO.44和45所示。在等效位置上发生突变的其他植物的同源的或直向同源物的序列在本发明的范围内。

在三个单独的实验中分析生物功能和FT_V70A蛋白工程的表达之间的联系。模拟接种的或用携带突变的非翻译的FTmRNA的PVX/mFT处理的SDMM烟草植物在长日照下保持生长(图3a,b)，而阳性对照植物(图3c)和用能表达正常的FT蛋白的PVX/FT处理的MM植物都开花(图3d)。通过对比，尽管FT和FT_V70A都有诱导MM烟草抽薹的相似的能力(图4b)，但FT_V70A的病毒瞬时表达引发了早成花芽的形成并开花(图4a)，并导致每个接种植物的花数量得明显增加(图3e)。不断发现表达FT_V70A但并不表达FT的MM烟草植物具有显著提高的种荚数量(图3f-h)。种荚数量的增加并没有导致种荚大小变小(图3i)。因此，用PVX/FT_V70A处理的植物的种子产量的总干重比用PVX/FT处理的植物的种子产量的总干重高约30%。而且，发现从PVX/FT_5A处理的植物收集来的种子与正常的MM烟草种子相比有相同的种子萌发活力。植物接种后21天也表现出早花，这比植入表达野生型FT的重组病毒的植物大约早1周(图4)。而且，与野生型FT表达的植物大约40朵花/每株相比，该植物还具有增加花数的特性，大约72朵花/每株(图4)。

因此，根据本发明的优选方面之一，植物显示种子生产或种子产量的增加，其中，所述增加是大约10%到大约50%或更多，例如大约30%。开花的增加可能是10%到大约50%或更多。

在另一种实施方式中，本发明涉及一种植物，该植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物表现不抽薹，也不开花。在一种实施方式中，取代包括或由在残基D73、R119或R173处的氨基酸的取代组成。取代可能是用A取代。如上所述，用于本公开的目标保守氨基酸残基的数量是基于拟南芥FT氨基酸序列的数量。在73位置的保守D是保守PEBP域中的第一个D。在173位置的保守R是酰胺化位点中的第一个R残基。也可能用到上述列出的突变的组合。

所述植物表达的肽序列如SEQ ID NO.41和43所示。在等效位置上发生突变的其他植物的同源的或直向同源物的序列在本发明的范围内。

在另一种实施方式中，本发明涉及一种植物，该植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物表现由不包括Y85H的氨基酸修饰提供的正常抽薹和延迟开花。在一种实施方式中，取代包括或由在残基L67、S78、Q140、G16、L19、F22、K29或V30处的氨基酸取代组成。在优选实施方式中，取代包括或由在残基L67、S78或Q140处的氨基酸取代组成。取代可以是用A取代。如上所述，用于本公开的目标保守氨基酸残基的数量是基于拟南芥FT氨基酸序列的数量。例如，L67在PEBP域中指定第一个保守的L，S78在PEBP域中指定第二个保守的S并且Q140在配体结合位点中与Y85位置相近的外环中指定保守的Q。也可能用到上述列出的突变的组合。

所述植物表达的肽序列如SEQ ID NO.23和30所示。在等效位置上发生突变的其他植物的同源的或直向同源物的序列在本发明的范围内。

在另一种实施方式中，本发明涉及一种植物，该植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物表现正常抽薹但不开花。在一种实施方式中，取代包括或由在残基D71、Y85、N13、N4、D7、L9、V14、V15、D17或V18处的氨基酸取代组成。在一种实施方式中，取代包括或由在残基D71或Y85处的氨基酸取代组成。取代可以是用A取代。D71在PEBP域中指定与V残基(用于拟南芥序列的V70)毗邻的第一个保守的D。如上所述，用于本公开的目标保守氨基酸残基的数量是基于拟南芥FT氨基酸序列的数量。例如，Y85对着PEBP域的N端指定第二个保守的Y。也能用到上述列出的突变的组合。

所述植物表达的肽序列如SEQ ID NO.31和40所示。在等效位置上发生突变的其他植物的同源的或直向同源物的序列在本发明的范围内。

在另一方面，本发明涉及一种植物，该植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述修饰是取代，所述取代由列于表1的一个或多个下述残基处的取代组成或选自列于表1的一个或多个下述残基处的取代，尤其是列于组Ⅱ-V中的，最优选是在组V中的。在一种实施方式中，取代是用A取代。在一种实施方式中，修饰是取代，并且所述取代由在V70和/或T27处的取代组成或选自在V70和/或T27处的取代，例如V70A和/或T27A。

在一种实施方式中，植物也含有调控序列。该调控序列调控所述植物中多核苷酸的表达。该序列可能是启动子序列，例如内源启动子或驱动基因组成型过表达的启动子。根据本发明的过表达是指转基因在高于由内源启动子驱动的表达的水平表达。例如，可以使用强启动子如花椰菜花叶病毒启动子（CaMV35S）、水稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子或任何能增强表达的启动子进行过表达。也可以使用诱导型启动子，例如压力诱导型启动子，例如RubisCO小亚基启动子，或乙烯、丙烯、类固醇或乙醇反应启动子或热休克启动子。还设想是异位表达，即在组织中正常不表达的基因表达。或者，通过使用转录或翻译增强子或激活子可以实现增强的或增加的表达，并可以把增强子整合到基因中以进一步增强表达。当技术人员将能选择合适的能够驱动基因充分表达以导致产生修饰蛋白的启动子时，不考虑限制该列表。

本发明也延及本文所描述的修饰植物的收获部分，例如，不限于种子、叶子、果实、花、茎、根、根茎、块茎和鳞茎，收获部分包括编码修饰的FT多肽的重组核酸。本发明进一步涉及来自植物的收获部分，例如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质，的衍生产物，优选直接衍生产物。

在另一方面，本发明涉及一种生产本文所述的植物的方法，该方法包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸，其中，多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。在一种实施方式中，本发明也涉及生产能长出更多花和具有增加的果实或种子产量的植物的方法，该植物包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸，其中，多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。更确切地说，修饰的FT多核苷酸编码修饰的多肽，其中，用其它氨基酸取代V70或T27或它们两个。

在另一方面，本发明涉及一种在植物中增加开花和种子产量的方法。该方法包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸，其中，多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。优选地，修饰的FT多核苷酸编码修饰的多肽，其中，用其它氨基酸取代V70和/或T27。

含有本文所描述的修饰的FT多核苷酸序列的序列可进一步含有选择标记，该选择标记可能与异源核酸序列，即可操作地连接到启动子的结构基因，相关。本文所使用的术语“标记”是指编码特征或表型的基因，该特征或表型允许选择或筛选含有标记的植物或植物细胞。该标记基因可能是抗生素抗性基因，借以利用适当的抗生素从未转化的细胞中筛选转化的细胞。或者，标记基因可能是抗除草剂基因。本领域技术人员了解合适的标记。

技术人员将意识到进行本发明的方法，用含有有利的序列的载体转化植物。本文已公开如此的载体。植物基因工程的本领域技术人员已知可以使用的载体的构建细节。在本发明中利用的异源核酸序列能够，例如，使用Ti质粒，根诱导（Ri）质粒或植物病毒载体例如PVX引入植物细胞中。

根据本发明的植物的转化，即通过异源核酸序列的引入的宿主植物的基因型的改变，本质上可以以植物分子生物学的本领域技术人员已知的各种方式进行。转化的实例包括感染农杆菌，例如通过用转化的根癌农杆菌感染植物细胞、外植体、分生组织或种子。在本领域技术人员已知的合适条件下，转化的植物细胞生长形成枝、根并进一步发育成植物。另外的例子是使用病毒载体的转染，例如本文所述的PVX载体系统，电穿孔或粒子轰击。本发明并不限于所列出的方法，技术人员可以使用适合的系统。

已识别许多拟南芥的同源物和直向同源物，这些非限制的选择示于下表2。

表2

如此所示，根据本发明的不同方面的植物可以是烟草或大麦。发明人显示由拟南芥FT基因衍生出的修饰的基因序列能在烟草中指导修饰的FT蛋白的表达，并诱导相对于野生型的改变的表型。技术人员知道本发明并不限于在实验中用作模式植物为了说明本发明的烟草或大麦。牢记FT位点在许多植物物种中是保守的，根据本发明，技术人员知道可以利用任何单子叶或双子叶植物。

双子叶植物可以选自包括但不限于菊科（Asteraceae）、十字花科（Brassícaceae）(如油菜（Brassíca napus）)、藜科（Chenopodíaceae）、葫芦科（Cucurbítaceae）、豆科（Legumínosae）(苏木科（Caesalpíníaceae）、含羞草科（Aesalpiniaceae Mímosaceae）、蝶形花科（Papílíonaceae）或豆科（Fabaceae）)、锦葵科（Malvaceae）、蔷薇科（Rosaceae）或茄科（Solanaceae）的科。例如，植物可以选自生菜、向日葵、拟南芥、花椰菜、菠菜、西瓜、南瓜、卷心菜、番茄、马铃薯、辣椒、烟草、棉花、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、紫花苜蓿、豆、大豆、蚕豆、豌豆、扁豆、花生、鹰嘴豆、杏、梨、桃、葡萄或柑橘类物种。在一个实施方式中，植物是油菜。

还包括生物燃料和生物能源作物，例如油菜/油菜籽、亚麻籽、羽扇豆和柳树、杨树、杨树杂交种、柳枝稷、芒或裸子植物，如火炬松。也包括农作物如青贮饲料(玉米)，牧草或饲料(草、三叶草、红豆草（sanfoin）、苜蓿)，纤维(如棉花、亚麻)，建筑材料(如松树、橡树)，纸浆(如杨树)，用于化工的原料(如高芥酸油菜、亚麻籽)和用于设施目的的原料(例如高尔夫球场草坪草)，公共和私人花园的观赏植物(例如金鱼草、矮牵牛、玫瑰、天竺葵、烟草)及用于家居的植物和切花(非洲紫罗兰、秋海棠、菊花、天竺葵、彩叶吊兰（Coleus spider plants）、龙血树、橡胶植物)。

单子叶植物例如可以选自棕榈科（Arecaceae）、石蒜科（Amaryllídaceae）或禾本科（Poaceae）。例如，植物可以是谷类作物，例如小麦、水稻、大麦、玉米、燕麦高粱、黑麦、洋葱、韭菜、小米、荞麦、草坪草、意大利黑麦草、柳枝稷、芒、甘蔗或羊茅属的种。

优选地，根据本发明不同方面的植物为农作物。农作物是指用于人类或动物消费或利用或其他非食品或饲料用途的以商业规模生长的任何植物。

优选的植物是玉米、小麦、水稻、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、棉花、生菜、西兰花或其他芸苔属蔬菜或杨树。在另一种实施方式中，植物可以选自表1所示的植物并可以表达基于表1中所识别的内源基因的修饰的内源FT基因。

在一种实施方式中，植物可以用于生物能源生产。

在根据本发明的不同方面的植物中表达的修饰的基因或多肽可能是在不同植物物种中表达的外源基因，例如修饰的拟南芥FT。优选的植物如上详述。或者，本发明也涉及利用基于内源FT基因的修饰基因。该内源FT基因是FT拟南芥同系物或直向同源物。这些基因在本文中被说明并且在本领域是已知的。修饰的多肽或基因编码本文阐述的改变的蛋白，并且在植物中被引入和表达或过表达。优选的植物如上详述。

在另一方面，本发明提供了一种分离的修饰的FT核酸序列，该核酸序列编码含有氨基酸修饰的修饰的FT多肽。修饰可以是删除、添加或取代。优选地，修饰是取代。分离的修饰的核酸序列选自编码含有在以下残基中的一个或它们的组合处取代的多肽的序列：T27、V70、D73、R119、R173、D71、L67、S78、Q140或FTG16、FTL19、FTF22、FTK29或FTV30。例如，多肽可能在这些残基处具有单个的取代。同时设想是修饰的多肽，其中，残基Y85用A来取代。

在一种实施方式中，修饰的多肽具有选自上述取代的单个的氨基酸取代。在优选的实施方式中，修饰的核酸序列编码含有在残基V70或T27或这两残基处取代的多肽。技术人员将意识到实现上述氨基酸取代，必须改变相应的密码子并由于DNA的简并密码子，密码子的不止一个的改变能够产生所需的取代。

本文所述的编码修饰的FT蛋白的序列或载体作为转基因被引入植物中。这可通过植物遗传工程中本领域已知的各种方法来进行，例如用农杆菌、PVX或粒子轰击进行转化。

在另一方面，本发明涉及含有修饰的核酸序列的载体，该修饰的核酸序列编码本文所述的多肽。在另一方面，本发明涉及用本文所述的载体或基因序列转化的植物细胞。具体地，本发明涉及表达在V70或T27或它们两个的位置处具有取代的修饰的蛋白的宿主细胞。植物细胞可以是本文进一步限定的单子叶或双子叶植物的细胞。修饰的核酸序列在编码本文所述的多肽以在植物中改变开花时间和/或数量和/或种子/果实产量中的用途也在本发明的范围内。例如，编码含有残基V70或T27或它们两个的取代的多肽的修饰的核酸序列可以在植物中用于诱导更多的开花并增加种子产量。这可以使用本文所述的方法进行。

进一方面，本发明涉及用于生产表达FT变异的并具有本文所述的表型之一的特征的突变体植物的方法，其中，所述方法使用诱变和定向诱导基因组局部突变(TILLING)以靶向表达FT多肽的基因。根据此方法，产生携带特异突变的株系具有已知的表型效应。例如，使用TILLING进行诱变，其中，通过高通量筛选进行传统的化学诱变用于点突变。因此本方法不涉及创造转基因植物。筛选植物用于本文所述的表型之一，例如，该植物显示增加的开花和种子产量。然后分析FT基因座以识别为观察到的表型的原由的特异FT突变。可以繁殖植物以获得具有期望的表型并在FT基因座中携带突变的稳定的株系。因此，在一种实施方式中，本发明涉及生产表现选自以下的改变的表型的植物的方法：

a)提高的开花能力；

b)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量；

b)不抽薹，不开花；

c)正常抽薹及延迟开花

d)正常抽薹，不开花

所述方法包括诱变植物种群并筛选由所述种群衍生的子代用于所述表型，鉴定表现所述表型的植物并筛选所述植物用于FT基因座中的一个或多个点突变。

因此在一种实施方式中，用于创造和分析突变的方法是定向诱导基因组局部突变(TILLING)，参考Henikoff et al,2004,Plant Physiology,2004,630-636。在这方法中，用化学突变剂例如EMS诱变种子。产生的M1植物是自花授粉并且M2代个体用于制备DNA样品用于突变筛选。DNA样品用于建库并排列在微量滴定板上并进行基因特异性PCR。可以使用识别野生型和突变体基因之间的异源双链的任意方法来筛选PCR扩增产物用于FT靶基因中的突变。例如，但不限于，变性高效液相色谱法(dHPLC)、恒定变性剂毛细管电泳(CDCE)，温度梯度毛细管电泳(TGCE)，或用化学切割粉碎片段。优选地，PCR扩增产物加入核酸内切酶温育，该核酸内切酶能够在野生型和突变体序列之间的异源双链中优先切割错配。切割产物用自动化测序凝胶仪器进行电泳，在标准商业成像系统程序帮助下分析凝胶电泳图。可以利用FT基因的任意特异引物在DNA样品池中扩增FT基因。优选地，设计引物扩增FT基因的区域，其中有益的突变最有可能出现，尤其是在高度保守和/或具有活性的FT基因的区域。为了方便在凝胶上检测PCR产物，可以用任意传统的标记方法标记PCR引物。

因此，快速高通量筛选程序提供扩增产物的分析用于鉴定使相比相应的非诱变野生型植物的FT基因的表达减少或失活的突变。一旦在有益基因中识别了突变，携带突变的M2植物的种子生长为成年的M3植物并筛选出与FT基因有关的表型特征。相比野生型对照，在叶片衰老期能够如此识别具有增加的产量及增加的表达的功能缺失或者减少的突变体。

另一方面，本发明涉及一种用于识别含有FT变异多核苷酸序列的突变体植物的方法，该方法包括如本文所述识别突变体表型并分析该FT多核苷酸序列。

实施例

本文在上文对本发明进行了概括的描述，下文的实施例进一步地描述了本发明，使得本领域的技术人员能够实施本发明的全部范围，包括它的最好模式。实施例的细节遵从本发明然而不应该解释为对本发明的限制，本技术领域人员将意识到本文所公开的详细的细节的变型、修改和排列能够产生有用的结果，尽管与详细的细节不同，然而包括在随附权利要求和其对等范围内。

实施例1

FT基因的克隆

编码FT_G172A、FT_R173A和FT_R174A的拟南芥FT衍生物通过使用相应的引物对A和D(图2)和携带野生型FT基因的质粒PVX/FT作模版的PCR进行扩增¹²。PCR反应体系含有：5μL的10×反应缓冲液(Promega)，0.2mMdNTPs(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，每个引物15pmole，1.25单位的pfuDNA聚合酶(Promega)和50ng的模板DNA。结果产生的PCR产物用QIAGEN Quick PCR纯化试剂盒纯化，接着用C/al和Eagl双酶切，然后克隆进入基于PVX的基因表达载体的C/al/Eagl位点¹²。

通过重叠延伸PCR获得所有其他FT衍生物（图2）。每个涉及的样品设计2个诱变引物B和C（图2），它们包含特异的突变且彼此部分互补。进行两个单独PCR反应(5μL的10×反应缓冲液(Promega)，0.2mM dNTPs(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，每组引物A和B或C和D 15pmole，1.25单位的pfu DNA聚合酶(Promega)和50ng的模版DNA)以生成FT基因的5′和3′部分。然后通过第三次PCR(5μL的10×反应缓冲液(Promega)，0.2mMdNTPs(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，引物A和D 15pmole，1.25单位的pfu DNA聚合酶(Promega)和50ng的PCR产物FT基因的5′和3′部分)扩增全长FT衍生物，纯化，限制性酶切并克隆进入PVX以产生如上所述的每种相应的表达载体(图2a)。通过测序确认所有重组克隆的完整性和突变的存在。

实施例2

FT基因的修饰

为了修饰FT基因的5′(即在首位100个核苷酸中的任意核苷酸)或3′(即在末位100个核苷酸中的任意核苷酸)端，化学合成特异引物(30-110核苷酸)，该特异引物具有用于选择具有编码丙氨酸的三个核苷酸的氨基酸的密码子的取代。当然，使用这种方法论，可利用其他的氨基酸取代，以下文描述的相同方式检测因此产生的突变体。如实施例1中所述，在PCRs中使用诱变的引物并选择性地使用引物A或D（图2A），以便将特异的修饰引入FT基因。

为了将核苷酸变化引入FT基因的中间部分（即核苷酸101-429），合成两个部分互补的引物B和C(图2)。将核苷酸变化引入两个引物中以便取代用于选择用于具有编码丙氨酸的三个核苷酸的突变的氨基酸的密码子。与引物A或D配对的两个诱变引物被用于实施例1中所述的重叠延伸PCRs以将特异的修饰引入FT基因。

实施例3

植物中修饰基因的表达

每个重组PVX载体的RNA转录物通过体外全长转录（in vitro run-offtranscription）产生¹²。典型的体外全长转录反应(50μL含有5μL的10×缓冲液(Biolabs)，40单位的RNasin(Promega)，ATP、CTP、UTP和GTP每个2mM，0.5mM m⁷GpppG(Biolabs)，2.5μg的Spel-linearised载体DNA及200单位的T7 RNA聚合酶)37℃温育1hr。RNA转录物进一步用1单位的Rnase-free Dnase在37℃处理30min，然后在植物5-6叶期机械接种。幼嫩的短日(SD)烟草马里兰州猛犸(MM)植物在25℃，持续光照以提供长日(LD,16-hr)光周期，无昆虫的温室中培养。¹²在如前所述的RNA和蛋白水平分析野生型和修饰的FT基因的病毒异位过表达，并通过测序确认野生型和修饰的FT基因的病毒传递。

实施例4

用于改变的表型的植物的分析

经病毒处理的SD MM植物形成与病毒有关的表型，包括接种后7天到14天接种叶片上枯黄病变及幼嫩叶片上的轻度枯黄病。如果用表达野生型拟南芥FT基因或它的功能性等位基因的重组病毒处理植物，在大约接种后20天植物开始发芽，接种后大约35天开始开花。每周都测量植物的生长（抽薹）。常规地检测成花芽，花及种荚的发育情况并用Nikon digital CoolPix 995相机拍照记录。统计芽，全开放的花和种荚的数量。然后收集种荚，测量种子的重量，测试种子的萌发。相比表达野生型拟南芥FT的植物，各种FT突变体的病毒异位表达影响每株植物在抽薹，开花时间及花种荚的数量方面的表型。

实施例5

携带修饰的基因的植物的转化

具有增强功能的FT突变体FT_V70A代表新基因，该新基因在农业生物技术领域可能具有巨大的潜能。这一点已通过用修饰的FT基因转化农作物及分析FT_V70A的表达在作物中是否诱导与烟草中获得的相似表型，即提高开花能力，提高开花数量及提高果实和/或种子产量，被证实。为此，使用已建好的转化方案¹⁶构建三个表达盒(图6)用于转化大麦。本工作可以延伸至农作物包括但不限于水稻，小麦，玉米，棉花，番茄，大豆和芸苔，及园艺和水果作物，还有观赏性物种。此外，在拟南芥FT和其在水稻，大麦，小麦和其他物种中的直向同源物中发现在FT_V70A中用丙氨酸取代的缬氨酸残基是保守的。因此，通过植物转化，在带有丙氨酸的这些FT直向同源物中这些氨基酸的突变被预见能够增强其生物功能以引发早花，增加成花数量并增加谷粒（种子）产量。

实施例6

用于改变的表型的转化的分析

野生型和突变的FT mRNA的病毒传递在PVX处理的MM烟草植物的系统的叶片中通过RT-PCR很容易被检测(图5a,b)，该图显示在测试植物中每个相应的重组病毒中的FTmRNA等效量地表达。此外，特异RT-PCR产物的直接测序表明引入FT基因的修饰在实验过程中能够稳定地保持(图5c)。使用对FT多肽具体提出的抗血清，我们检测到大约20kDa的一条带，该条带相应于接种了PVX/FT的植物中表达的FT蛋白及接种了PVX/FT_R173A的植物中R173A功能缺失型FT蛋白突变体（表1）的预测大小（图2a；图5d）。惊奇地，在接种PVX/FT_V70A的植物中，持续地发现FT_V70A的两种形式，表明FT_V70A可能经历翻译后修饰，这种修饰可能被需求用于合成蛋白的新功能。相应于RT-PCR分析，在接种植物中显示了等效量的FT mRNA，也检测到相似量的PVX CP(图5e,f)，表明基于PVX的表达系统能够在所有接种MM烟草植物中传递等量的FTmRNA和其蛋白产物。

主要转化的表型（生长，开花时间，开花数量，种子产量及生产能力）对比于用对照基因表达盒转化的植物的表型（图6）。决定每个转基因株系中转基因的复制数并选择具有相关转基因的单一复制的株系用于进一步分析。在RNA和蛋白水平上分析转基因表达，然后联系用三种不同的基因表达盒转化的转基因株系中的表型变化（图6）。预期（1）成花数量的增加尤其有益于园艺工业用于繁育新开花植物；和（2）产量的增加尤其有益于农业、食品和生物技术用于繁育高产量和高生物能源产量的新作物。

实施例7

在新作物的分子育种中功能增强的FT_V70A的可能的启示

我们的数据表明在FT蛋白中的V70A取代能够提高FT_V70A生物活性，使得其能够引发开花及增加开花数量和种子产量。这个发现在提高作物产量的FT蛋白工程中是重要的。此外，我们的基于病毒的成花诱导系统揭示了许多FT的其它潜在有用的等位基因，这些等位基因赋予了不同的开花响应（表1）。例如，组IV突变体的过表达（即不抽薹且不开花）可能在植物例如生菜中具有明显的副作用，使得这些农作物保持营养生长。组IV突变体另一潜在应用在生物质作物中被发现，例如避免能量转入开花过程（抽薹且开花），尤其对营养生长性物种，它们的花/种子阶段对于农作物耕种并不是必需的（例如甘蔗）。组IV突变体（不抽薹且不开花）通过阻止开花，当开花并不是必需时，例如甜菜，草坪草等，在生育控制方面也能发挥作用。

赋予一系列开花特征的等位基因系的知识对分子植物育种者很有帮助，他们基于本公开，通过靶分子育种方法，能够生产携带具有已知表型效应的特异突变的株系，靶分子育种方法例如筛选TILLING群体中特异的FT突变。另一潜在的应用是非种子-携带的病毒载体在表达FT或FT_V70A以在育种项目或种质资源收集中的顽拗植物物种中促进开花和提高种子产量中的用途。此外，FT突变体文库，尤其，在组III和IV中非开花功能缺失型等位基因（表1），代表用于剖析FT蛋白的分子域的独特的资源，该FT蛋白用于长距离活动和自主细胞的成花诱导。

实施例8

用于检测转基因复制数的实时定量PCR（Quantitative real-time PCR）

使用Hyg基因和CO2(Constans-like,AF490469)基因的特异引物和探针[Bartlett J G，Alves S C,Smedley M,Snape J W，Harwood W A(2008)High-throughput Agrobacterium-mediated barley transformation.Plant Methods,4:22]进行实时定量PCR。用应用生物系统引物表达软件（Applied Biosystemssoftware Primer Express），结合TaqMan探针和引物设计模块（见下文）设计靶向靶序列的引物。反应使用Thermo ABGene Absolute QPCR Rox Mix (Catnumber AB1139)。多重复地进行Hyg基因和CO2基因的检测。探针和引物的终浓度是200nM(Hyg)或100nM(CO2)。反应体系包含5μL的DNA溶液,且优化后的DNA终浓度在1到10ng/μL范围内(体系中5到50ng DNA)。在带有384位板的Applied Biosystems ABI7900中进行PCRs。所用的检测仪是带有ROX内部阴性参照和无9600仿真的FAM-TAMRA和VIC-TAMRA。PCR循环条件是95℃15分钟(酶激活)，40个循环的95℃15秒，60℃60秒。每个样品分析2次。

经过PCR后用Applied Biosystems SDS软件获得循环阈值(CT)，调整背景扣除（background subtraction）和阈值后，以便所有的扩增曲线接近中间-log（mid-log）扩增。计算每个样的ΔCt值（Hyg的Ct减去CO2的Ct）。参照ΔCt对样品进行排序，具有高ΔCt值的样品具有低的Hyg基因的复制数，而具有低ΔCt值的样品具有高的Hyg基因的复制数。

实施例9

植物材料和幼胚分离

供体植物春麦，黄金承诺，在如前所述的白天15℃和夜晚12℃的可控环境条件下生长[Harwood WA,Ross SM,Cilento P,Snape JW:The effect ofDNA/gold particle preparation technique,and particle bombardment device,onthe transformation of barley(Hordeum vulgare).Euphytica 2000,111:67-76]。湿度是80%和在成熟植物冠层处由增补钨灯泡的金属卤化物灯(HQI)提供的光照水平500μmol.m^-2.s^-1。当幼胚直径为1.5-2mm时，收集大麦幼穗。从穗中移除不成熟的种子并如前所述消毒[Harwood WA,Ross SM,Cilento P,SnapeJW:The effect of DNA/gold particle preparation technique,and particlebombardment device,on the transformation of barley(Hordeum vulgare).Euphytica 2000,111:67-76]。用精细镊剥开幼胚并移除胚胎轴。然后以胚盘向上的方式将胚放在Cl培养基上，该培养基含有4.3g/L Murashige & Skoog植物盐基(Duchefa)、30g/L麦芽糖、1.0g/L酪蛋白水解物、350mg/L肌醇、690mg/L脯氨酸、1.0mg/L硫胺素HCl、2.5mg/L麦草畏(Sigma-Aldrich)和3.5g/L植物凝胶，每个9cm的培养皿上有25个胚。

实施例10

质粒和菌株

含有pBract载体的农杆菌菌株AGL1用于所有的实验中。所有的pBract载体基于pGreen[Hellens RP,Edwards EA,Leyland NR,Bean S,MullineauxPM:pGreen:a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant Mol Biol 2000,42:819-832]，因此需要共同转化进入携带辅助质粒pSoup的农杆菌中。为了使pGreen小尺寸，农杆菌中复制需求的的pSa起始复制，被分离成两个不同的功能部分。复制的起始点(ori)存在于pGreen上，反式作用的复制酶基因(RepA)存在于pSoup上。在农杆菌中需求两个载体用于pGreen复制。pBract载体DNA和pSoup DNA同时通过电穿孔转移至AGL1。

实施例11

农杆菌介导的转化

Tingay等的方法[Tingay S,McElroy D,Kalla R,Fieg S,Wang M,Thornton S,Brettell R:Agrobacterium tumefaciens-mediated barleytransformation.Plant J 1997,11:1369-1376]用于制备标准农杆菌接种体用于转化。从-80℃中取出400uL液态的标准培养液，添加到10mL的MG/L[Bartlett J G,Alves S C,Smedley M,Snape J W,Harwood W A(2008)High-throughput Agrobacterium-mediated barley transformation.Plant Methods,4:22]无抗生素的培养基中，在摇床上以180rpm 28℃过夜培养。这种全强培养液用于接种准备好的幼胚。添加一小滴农杆菌悬浮液到平板上的每个幼胚上。然后倾斜平板允许过量的农杆菌悬浮液流出。然后在以胚盘向下的方式转移至新鲜Cl平板之前将幼胚轻轻地拖过培养基的表面（为了移除过量的农杆菌）。胚在23-24℃的黑暗环境下共培养3天。

实施例12

转化植物的筛选

共培养后，将胚转移至新鲜的Cl平板，该Cl平板含有50mg/L潮霉素、160mg/L特美汀(Duchefa)和1.25mg/L CuSO₄.5H₂O。每2周胚分化培养至新鲜筛选平板上并保持在24℃的黑暗坏境中。4-6周后，将胚转移至过渡培养基（T）上，该培养基含有2.7g/L Murashige & Skoog修饰的植物盐基(无NH₄NO₃)(Duchefa)、20g/L麦芽糖、165mg/L NH₄NO₃、750mg/L谷氨酰胺、100mg/L肌醇、0.4mg/L硫胺素HCl、1.25mg/L CuSO₄.5H₂O、2.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)(Duchefa)、0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤(BAP)、3.5g/L植物凝胶、50mg/L潮霉素和160mg/L特美汀在低光照下。再过2周后，将胚长出的愈伤组织转移至再生培养基在全日照条件下在24℃下，保持来自单个胚的所有的愈伤组织在一起。再生培养基与过渡培养基相同，但是不添加铜、2,4-D或BAP。一旦再生植物长出2-3cm的芽体，将它们转移至含Cl培养基，不含麦草畏或任何其他成长调节剂但仍含50mg/L潮霉素和160mg/L特美汀的玻璃培养试管中。在1-2周后，转化的植物在含有潮霉素的培养基中形成牢固的根系统，然后被转移至土壤中并在相同的条件下生长作为供体植物。

表3下表显示引物序列(SEQ ID No.52-78)

表3

表2 引物序列

序列表

拟南芥FT核酸序列(野生型)SEQ ID No 1

ATGTCTATAAATATAAGAGACCCTCTTATAGTAAGCAGAGTTGTTGGAGACGTTCT

TGATCCGTTTAATAGATCAATCACTCTAAAGGTTACTTATGGCCAAAGAGAGGTGA

CTAATGGCTTGGATCTAAGGCCTTCTCAGGTTCAAAACAAGCCAAGAGTTGAGATT

GGTGGAGAAGACCTCAGGAACTTCTATACTTTGGTTATGGTGGATCCAGATGTTC

CAAGTCCTAGCAACCCTCACCTCCGAGAATATCTCCATTGGTTGGTGACTGATATC

CCTGCTACAACTGGAACAACCTTTGGCAATGAGATTGTGTGTTACGAAAATCCAAG

TCCCACTGCAGGAATTCATCGTGTCGTGTTTATATTGTTTCGACAGCTTGGCAGGC

AAACAGTGTATGCACCAGGGTGGCGCCAGAACTTCAACACTCGCGAGTTTGCTGA

GATCTACAATCTCGGCCTTCCCGTGGCCGCAGTTTTCTACAATTGTCAGAGGGAG

AGTGGCTGCGGAGGAAGAAGACTTTAG

拟南芥FT多肽(野生型)SEQ ID No2

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

组Ⅰ

拟南芥FT多肽FTV68A SEQ ID 3

MAINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTP72A SEQ ID 4

MAINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTP77A SEQ ID 5

MAINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTG172A SEQ ID 6

MAINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTR174A SEQ ID 7

MAINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTS2A SEQ ID 8

MAINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTI5A SEQ ID 9

MSINARDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTR6A SEQ ID 10

MSINIADPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTP8A SEQ ID 11

MSINIRDALI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTV11A SEQ ID 12

MSINIRDPLI ASRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTS12A SEQ ID 13

MSINIRDPLI VARVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTR13A SEQ ID 14

MSINIRDPLI VSAVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTD20A SEQ ID 15

MSINIRDPLI VSRVVGDVLA PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTP21A SEQ ID 16

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD AFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTN23A SEQ ID 17

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFARSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTR24A SEQ ID 18

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNASITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTS25A SEQ ID 19

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRAITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTI26A SEQ ID 20

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSATLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTL28A SEQ ID 21

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITAKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTT31A SEQ ID 22

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV AYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

组Ⅱ

拟南芥FT多肽FTG16A SEQ ID 23

MSINIRDPLI VSRVVADVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTL19A SEQ ID 24

MSINIRDPLI VSRVVGDVAD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTF22A SEQ ID 25

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PANRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTK29A SEQ ID 26

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLAV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTV30A SEQ ID 27

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKA TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTL67A SEQ ID No 28

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTAVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTS78A SEQ ID No 29

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPANP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTQ140A SEQ ID No 30

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRA NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

组Ⅲ

拟南芥FT多肽FTI3A SEQ ID 31

MSANIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTN4A SEQ ID 32

MSIAIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTD7A SEQ ID 33

MSINIRAPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRR 175

拟南芥FT多肽FTL9A SEQ ID 34

MSINIRDPAI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTV14A SEQ ID 35

MSINIRDPLI VSRAVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTV15A SEQ ID 36

MSINIRDPLI VSRVAGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTD17A SEQ ID 37

MSINIRDPLI VSRVVGAVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTV18A SEQ ID 38

MSINIRDPLI VSRVVGDALD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTD71A SEQ ID No 39

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV APDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTRFFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTY85A SEQ ID No 40

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREALHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

组Ⅳ

拟南芥FT多肽FTD73A SEQ ID No 41

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPAVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTR119A SEQ ID No 42

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHAV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTR173A SEQ ID No 43

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGARL 175

组Ⅴ

拟南芥FT多肽FTV70A SEQ ID No 44

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSITLKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMA DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHR VVFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

拟南芥FT多肽FTT27A SEQ ID 45

MSINIRDPLI VSRVVGDVLD PFNRSIALKV TYGQREVTNG LDLRPSQVQN 50

KPRVEIGGED LRNFYTLVMV DPDVPSPSNP HLREYLHWLV TDIPATTGTT 100

FGNEIVCYEN PSPTAGIHRV VFILFRQLGR QTVYAPGWRQ NFNTREFAEI 150

YNLGLPVAAV FYNCQRESGC GGRRL 175

参考文献

1.Zeevaart，J.A.D.Annu.Rev.Plant Physiol.27，321-348(1976).

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17.Ziegler，A.et al.Arch Virol DOI 10.1007/s00705-009-0468-8(2009).

Claims

1.一种转基因植物，所述转基因植物含有并表达修饰的FT多核苷酸，所述多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽，其中，所述植物表现以下表型之一：

a)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量；

b)提高的开花能力；

c)不抽薹，不开花；

e)正常抽薹，不开花。

2.根据权利要求1所述的植物，其中，所述植物表现提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量。

3.根据权利要求2所述的植物，其中，所述修饰包括在PEBP域中第二个保守V残基处的氨基酸取代，或由在PEBP域中第二个保守V残基处的氨基酸取代组成。

4.根据权利要求3所述的植物，其中，所述保守V残基是V70或同源位置上的V。

5.根据权利要求2所述的植物，其中，所述修饰包括在T27或者同源位置上的氨基酸取代或由在T27或者同源位置上的氨基酸取代组成。

6.根据权利要求1所述的植物，其中，所述植物表现不抽薹和不开花。

7.根据权利要求6所述的植物，其中，所述修饰包括选自在一个或多个以下残基：D73、R119或R173处的取代的氨基酸取代或由选自在一个或多个以下残基：D73、R119或R173处的取代的氨基酸取代组成。

8.根据权利要求1所述的植物，其中，所述植物在氨基酸修饰不含有Y85H的情况下表现正常抽薹及延迟开花。

9.根据权利要求8所述的植物，其中，所述修饰包括在一个或多个以下残基：L67、S78、Q140、G16、L19、F22、K29或V30处的取代的氨基酸取代或由选自在一个或多个以下残基：L67、S78、Q140、G16、L19、F22、K29或V30处的取代的氨基酸取代组成。

10.根据权利要求1所述的植物，其中，所述植物表现正常抽薹，不开花。

11.根据权利要求10所述的植物，其中，所述修饰包括在一个或多个以下残基：D71、oY85、13、N4、D7、L9、V14、V15、D17或V18处的取代的氨基酸取代或由选自在一个或多个以下残基：D71、oY85、13、N4、D7、L9、V14、V15、D17或V18处的取代的氨基酸取代组成。

12.根据权利要求1-11中任意一项所述的植物，其中，用中性氨基酸进行氨基酸取代。

13.根据权利要求12所述的植物，其中，用丙氨酸进行氨基酸取代。

14.根据权利要求1-13中任意一项所述的植物，其中，FT多核苷酸可操作地与调控序列连接。

15.根据权利要求14所述的植物，其中，所述调控序列是启动子。

16.根据权利要求1-15中任意一项所述的植物，其中，植物是单子叶或双子叶植物。

17.根据权利要求16所述的植物，其中，所述植物是农作物植物。

18.根据权利要求17所述的植物，其中，所述植物选自玉米，小麦，水稻，高粱，大豆，甘蔗，甜菜，牧草，草坪草，柳枝稷，芒，土豆，番茄，大麦，豌豆，豆，蚕豆，棉花，生菜，向日葵，芸苔属植物，例如油菜籽、芸苔或花椰菜，或紫花苜蓿，或杨树。

19.根据权利要求1-18中任意一项所述的植物，其中，所述修饰的FT多核苷酸是修饰的内源多核苷酸。

20.根据权利要求1-18中任意一项所述的植物，其中，所述修饰的FT多核苷酸是修饰的外源多核苷酸。

21.从权利要求1-20中任意一项所述的植物获得的植物组织或收获的材料。

22.一种生产权利要求1-20中任意一项所述的植物的方法，该方法包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸，其中，多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。

23.一种提高植物开花能力和种子和/或果实产量的方法，该方法包括在所述植物中引入并表达修饰的FT多核苷酸，其中，多核苷酸编码含有氨基酸修饰的修饰的多肽。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述修饰包括在残基V70或T27或它们两者位置上的氨基酸取代或由在残基V70或T27或它们两者位置上的氨基酸取代组成。

25.一种分离的核酸，所述核酸编码修饰的多肽，该修饰的多肽含有氨基酸修饰，其中，当在植物中引入所述核酸时，所述修饰导致改变的表型，其中，所述表型选自：

a)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量；

b)提高的开花能力；

c)不抽薹，不开花；

e)正常抽薹，不开花。

26.一种分离的核酸，所述核酸编码修饰的多肽，该修饰的多肽含有氨基酸修饰，其中，所述修饰包括一个或多个以下残基：T27、V70、D73、R119、R173、D71、L67、S78、Q140或G16、L19、F22、K29或FTV30的取代或由一个或多个以下残基：T27、V70、D73、R119、R173、D71、L67、S78、Q140或G16、L19、F22、K29或FTV30的取代组成。

27.根据权利要求25或26所述的分离的核酸，其中，所述修饰包括在残基V70或T27或它们两者位置上的取代或由在残基V70或T27或它们两者位置上的取代组成。

28.根据权利要求26或27所述的分离的核酸，其中，用A取代氨基酸。

29.一种载体，该载体含有权利要求25-28中任意一项所述的核酸。

30.权利要求25-28中任意一项所述的核酸或权利要求29所述的载体在提高植物开花能力和/或种子和/或果实产量中的用途。

31.一种植物，该植物含有权利要求25-28中任意一项所述的核酸或权利要求29所述的载体。

32.一种生产表现改变的表型的植物的方法，改变的表型选自：

a)提高的开花能力；

b)提高的开花能力和增加的果实和/或种子产量；

c)不抽薹，不开花；

d)正常抽薹及延迟开花

e)正常抽薹，不开花

所述方法包括诱变植物种群并为了所述表型筛选来自所述种群的子代，鉴定表现所述表型的植物并筛选所述植物以得到在FT基因座上的一个或多个点突变。