CN112011545B

CN112011545B - 调节植物开花时间及生物量的基因及其利用

Info

Publication number: CN112011545B
Application number: CN201910456537.1A
Authority: CN
Inventors: 刘宏涛; 王飞; 赵志伟; 王正琪; 张鑫; 梁华锋
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2019-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2039-05-29
Also published as: CN112011545A

Abstract

本发明提供了一种调节植物开花时间及生物量的基因及其利用。本发明揭示了一种新型转录因子EDF1(EMS induced delayed flowering 1)，其编码一个MYB类转录因子，可以通过促进玉米成花素基因ZCN(ZEA MAYS CENTRORADIALIS)家族成员的转录，从而正向调控玉米的开花时间；同时，本发明还揭示了EDF1的等位基因edf1，其能够抑制EDF1对ZCN家族成员的转录调控，并表现出剂量效应。发明还揭示了EDF1及其等位基因edf1作为植物性状调控靶点的应用。

Description

调节植物开花时间及生物量的基因及其利用

技术领域

本发明属于植物生物学领域，更具体地，本发明涉及调节植物开花时间及生物量的基因及其利用。

背景技术

玉米遗传性较为复杂，变异种类丰富，在常规的育种过程中存在着周期过长、变异系数过大、影响子代生长发育的缺点，而现代生物育种技术不但克服了上述缺点和不足，同时也提高了育种速度和质量。

其中诱变可以提高变异频率，加速育种进程，创造并筛选人类需要的变异类型，从而大幅度改良某些性状，从中选择培育出优良的品种或者获得控制某性状的突变基因。结合分子设计育种或者基因编辑育种可以快速的改变优良品种的该性状。

在玉米的驯化、传播和选育过程中，开花时间是一个至关重要的因素。对模式植物拟南芥的研究，人们逐渐深入地认识了植物的开花调控。玉米作为第二大粮食作物，其开花调控网络也逐渐受到关注，然而关于玉米开花调控的研究仍比较少，玉米开花相关突变体材料非常欠缺，可供分子设计育种的基因也很少。

玉米中已经发现的开花时间突变体有indeterminate1gene(id1)、delayedflowering1(dlf1)和Vegetative to generative transition 1(Vgt1)。id1是早在1946报道的第一个玉米开花突变体，它不能完成正常的开花转换，持续停留在营养生长期。到了1998年，ID1基因才被克隆，它是一个锌指蛋白，id1是其功能缺失突变体。但由于id1不能够正常完成开花转换，所以它的利用前景非常有限。dlf1是在1997报道的第二个玉米晚花突变体。它的开花比野生型晚10-14天时间，从利用前景上来讲，这是个相对合适的晚花表型。在2006年DLF1被报道编码了一个基本的亮氨酸拉链蛋白，dlf1是其功能缺失突变体。Vgt1是在1992年分析到的一个促进开花作用的数量性状位点quantitative trait loci(QTLs)。在2007年被克隆到，它有非常早花的表型，2016年密苏里大学哥伦比亚分校还利用含有这一位点的株系选育出仅有60天生育周期的快速开花微小玉米品种(Fast-FloweringMini-Maize)。

通过诱变筛选获得更多的玉米开花相关突变体，鉴定更多的玉米开花调控基因可以加速玉米开花调控网络的建成，有助于快速改变优良品种的开花时间，从而加速其推广，扩大其推广面积。

青贮玉米是饲喂牛、羊等为主的草食牲畜的一种玉米，其作为优质的青贮饲料的发展空间巨大，市场前景十分广阔。随着国民生活水平的提高及消费观念的转变，对牛、羊肉与奶产品的需求量迅速上升，青贮玉米的需求量会逐步增加。青贮玉米要求生物产量高，纤维品质好，持绿性好、干物质和水分含量适宜用厌氧发酵的方法进行封闭青贮。开花时间也是与生物量、持绿性直接相关的因素，鉴定更多的玉米开花调控基因也可以用来培育优良的青贮玉米品种。

发明内容

本发明的目的在于提供调节植物开花时间及生物量的基因及其利用。

在本发明的第一方面，提供一种调节植物开花时间和生物量的方法，包括：调节植物中EDF1或其等位基因edf1的表达或活性，从而调节植物开花时间和生物量；所述的包括它们的同源物。

一个优选例中，所述方法选自：(a)上调EDF1的表达或活性和/或下调EDF1等位基因edf1的表达或活性，从而缩短植物开花时间、生育期或营养生长期；或(b)下调EDF1的表达或活性和/或上调EDF1等位基因edf1的表达或活性，从而延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数。

在另一优选例中，(a)中，EDF1被上调或EDF1等位基因edf1被下调，上调ZCN家族基因表达(包括转录水平的激活)，进而缩短植物开花时间、生育期或营养生长期。

在另一优选例中，(b)中，EDF1被下调或EDF1等位基因edf1被上调，使得ZCN家族基因表达被下调，进而延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数；

在另一优选例中，所述的ZCN家族基因包括ZCN7，ZCN8或ZCN12。

在另一优选例中，下调EDF1包括：在植物中敲除或沉默EDF1的编码基因，或抑制EDF1的活性；较佳地，包括：以特异性干扰EDF1的编码基因表达的干扰分子来沉默EDF1，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除EDF1的编码基因，以同源重组的方法敲除EDF1编码基因，或在含有EDF1的植物中将EDF1突变为edf1。

在另一优选例中，下调edf1包括：在植物中敲除或沉默edf1的编码基因，或抑制edf1的活性；较佳地，包括：以特异性干扰edf1的编码基因表达的干扰分子来沉默edf1，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除edf1的编码基因，或以同源重组的方法敲除edf1编码基因，或在含有edf1的植物中将edf1突变为EDF1。

在另一优选例中，所述下调EDF1包括：破坏EDF1的MYB结构域的DNA结合能力；较佳地，通过包括选自以下的方式破坏EDF1的MYB结构域的DNA结合能力：(i)改变EDF1的MYB结构域中第三个α-helix结构(较佳地，该MYB结构域中第三个α-helix结构为SEQ ID NO:1序列中87～98位)，从而破坏EDF1的MYB结构域的DNA结合能力；(ii)在MYB结构域之前或在EDF1的N端添加(融合)一段序列(如标签蛋白、无关序列片段)，改变MYB结构域上的α-helix结构、位置或构象；(iii)以CRISPR系统或以同源重组方法进行基因编辑，从而破坏MYB结构域的DNA结合能力；(iv)相应于SEQ ID NO:1所示的EDF1序列，在其第95位与第96位之间，插入外源的氨基酸(如插入氨基酸VVK)，从而破坏MYB结构域的DNA结合能力。

在另一优选例中，上调EDF1包括：将EDF1的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；对EDF1进行功能获得性点突变；或在含有edf1的植物中将edf1突变为EDF1。

在另一优选例中，所述的EDF1的多肽是：(a)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有(a)多肽功能的多肽；或(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:1的片段。

在另一优选例中，所述的edf1的多肽是：(a’)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(b’)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a’)多肽功能的由(a’)衍生的多肽；或(c’)氨基酸序列与(a’)限定的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有(a’)多肽功能的多肽；或(d’)具有(a’)多肽功能的SEQ ID NO:2的片段。

在本发明的另一方面，提供一种调节植物开花时间和生物量的方法，所述方法包括：调控植物中EDF1或其等位基因edf1对于ZCN家族基因的表达调控作用，从而调节植物开花时间和生物量；所述的EDF1或其等位基因edf1包括它们的同源物。

在一个优选例中，所述方法选自：(i)上调EDF1的表达或活性和/或下调EDF1等位基因edf1的表达或活性，从而上调ZCN家族基因的表达，进而缩短植物开花时间、生育期或营养生长期；或(ii)下调EDF1的表达或活性和/或上调EDF1等位基因edf1的表达或活性，从而下调ZCN家族基因的表达，进而延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数。

在本发明的另一方面，提供一种EDF1或其等位基因edf1或它们的调节剂的用途，用于调节调节植物开花时间和生物量，所述的开花时间和生物量包括：开花时间，生育期，营养生长期，株高，叶片数；所述的EDF1或其等位基因edf1包括它们的同源物。

在一个优选例中，EDF1或其上调剂、edf1下调剂缩短植物开花时间、生育期或营养生长期。

在另一优选例中，edf1或其上调剂、EDF1下调剂延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数。

在另一优选例中，所述的EDF1上调剂包括但不限于：外源的EDF1编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体；对EDF1进行功能获得性点突变的试剂；或在含有edf1的植物中将edf1突变为EDF1的试剂(如基因编辑试剂，基因重组试剂，定点突变试剂)。

在另一优选例中，所述的EDF1下调剂包括但不限于：敲除或沉默EDF1的试剂，抑制EDF1活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰EDF1的编码基因表达的干扰分子，针对EDF1的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂(在含有EDF1的植物中将EDF1突变为edf1)，破坏EDF1的MYB结构域DNA结合能力的试剂，能在MYB结构域之前或在EDF1的N端添加(融合)一段序列(如标签蛋白、无关序列片段)，改变MYB结构域上的α-helix结构、位置或构象的试剂。

在另一优选例中，所述的edf1下调剂包括但不限于：敲除或沉默edf1的试剂，抑制edf1活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰edf1的编码基因表达的干扰分子，针对edf1的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂(在含有edf1的植物中将edf1突变为EDF1)。

在本发明的另一方面，提供一种定向选择或鉴定植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的EDF1或其等位基因edf1的表达：若是该测试植物的EDF1表达高于(显著高于)该类植物的EDF1平均表达值，或edf1表达低于(显著低于)该类植物的edf1平均表达值，则其为开花时间、生育期或营养生长期缩短的植物；若是该测试植物的EDF1表达低于(显著低于)该类植物的EDF1平均表达值或不表达，或edf1表达高于(显著高于)该类植物的edf1平均表达值，则其为开花时间、生育期或营养生长期延长的植物，或株高或叶片数增加的植物；其中，所述的EDF1或其等位基因edf1包括它们的同源物。

在本发明的另一方面，提供一种筛选调节植物开花时间和生物量的调节剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有EDF1的体系中；较佳地，该体系含有ZCN家族基因；(2)检测所述体系中，观测(1)的体系中EDF1的表达或活性；若所述候选物质上调EDF1的表达或活性，或促进EDF1对于ZCN家族基因的上调作用(包括转录水平的激活)，则表明该候选物质是缩短植物开花时间、生育期或营养生长期的调节剂；若所述候选物质下调EDF1的表达或活性，或抑制EDF1对于ZCN家族基因的上调作用，则表明该候选物质是延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数的调节剂；其中，所述的EDF1或其等位基因edf1包括它们的同源物。

在本发明的另一方面，提供一种筛选调节植物开花时间和生物量的调节剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有edf1的体系中；(2)检测所述体系中，观测(1)的体系中edf1的表达或活性；若所述候选物质下调edf1的表达或活性，则表明该候选物质是缩短植物开花时间、生育期或营养生长期的调节剂；若所述候选物质上调edf1的表达或活性，则表明该候选物质是延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数的调节剂；其中，所述的EDF1或其等位基因edf1包括它们的同源物。

在一个优选例中，上述筛选方法中，还包括设置对照组与测试组，以观测候选物质在测试组与对照组中的区别。

在另一优选例中，所述的促进、上调、抑制或下调，是具有统计学意义的或具有显著性的。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对EDF1或edf1，或它们上游或下游蛋白或基因设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物(如激素)等。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、植物组织体系、植物器官体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验、植物体内实验和/或转基因试验，以从候选物质中进一步确定调节植物开花时间和生物量效果优异的物质。

在本发明的另一方面，提供一种植物EDF1或其等位基因edf1的用途，用于作为鉴定植物开花时间和生物量的分子标记；所述的EDF1或其等位基因edf1包括它们的同源物。

在一个优选例中，所述植物包括：单子叶植物或多子叶植物；较佳地为表达EDF1或edf1或其同源物的植物。

在一个优选例中，所述植物是双子叶十字花科植物，或单子叶禾本科植物；更佳地，所述植物包括：双子叶植物拟南芥，单子叶植物玉米；更佳地，所述的玉米包括：籽粒玉米(普通玉米)、青贮玉米、鲜食玉米。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多肽，其是：(a’)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(b’)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a’)多肽功能的由(a’)衍生的多肽；或(c’)氨基酸序列与(a’)限定的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有(a’)多肽功能的多肽；或(d’)具有(a’)多肽功能的SEQ ID NO:2的片段。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码所述的分离的多肽。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、edf1的半显性晚花表型。

(A)上海春季，edf1纯合突变体、杂合体以及野生型对照开花表型。生长80天拍照。

(B-C)开花时间按照散粉时总的叶片数目以及从萌发到开花的天数进行统计。误差线代表SD(n≥15)。字母“a，b，c”表示开花时间的和叶片数的差异显著性分析(Tukey’sLSD，p<0.05)。

图2、edf1影响了ZCN8的表达。

(A)图片展示了C图取材时对应发育天数的野生型和突变体的SAM表型；其中DAG表示萌发后时间(Days After Germination)。

(B)上海夏季长日照条件下edf1和WT在萌发后第5片叶子完全展开时ZCN8一天内的表达模式，ZT0为日出时间5:00am，横坐标的单位为“小时(h)”，纵坐标为相对表达量。

(C)edf1和WT中ZCN8的表达量随发育天数的变化，每四天的ZT0时取最新展开叶片的前半部，误差线代表SD(n＝3)，横坐标单位为天(萌发后天数)，纵坐标为相对表达量。

图3、edf1的基因定位。

(A)通过5000株F2群体的精细定位，edf1被定位到分子标记InDzw9和InDzw27之间约900Kb的区间，GRMZM2G052544是edf1的候选基因，基因编号下方的星星和数字代表了该基因上含有的SNP数。

(B)基因GRMZM2G052544在野生型和突变体中的CDS克隆产物和gDNA克隆产物的测序比对结果。

(C)edf1突变体中新产生了一个转录本，而对应野生型中转录本的表达量很低。

(D)和(E)RT-qPCR分析两个转录本在野生型，杂合体和突变体中的表达量，误差线代表SD(n＝3)。

图4、EDF1功能互补转基因实验。长日照条件下，功能互补转基因株系与野生型和edf1突变体开花表型观察。

图5、EDF1/edf1对于ZCN8的转录调控。

(A)效应因子载体和报告载体构建模式图。ZCN8的启动子(-2,141bp至-1bp)被克隆到Dual-LUC报告载体上。(B)利用农杆菌浸染的方法在烟草叶肉细胞中共转报告载体和如图标示的效应因子。误差线为三个生物学重复的平均标准误。

图6、EDF1/edf1株高统计结果。

在植株散粉结束后，从玉米的根部到雄穗顶端进行株高的测量统计。误差线代表SD(n≥18)。字母“a，b，c”表示玉米株高的差异显著性分析(Tukey’s LSD，p<0.05)。

图7、EDF1/edf1调控开花的工作模型。工作模型认为通过对EDF1/edf1相对表达量的调控可以实现对玉米开花时间的精确调节。

图8、EDF1与edf1的蛋白二级结构。

edf1的蛋白二级结构分析发现三个氨基酸的插入破坏了EDF1的MYB结构域中第三个α-helix结构(第87到98位氨基酸形成的α-helix结构)。

图9、edf1蛋白的三级结构预测图。

(A)EDF1的MYB domain的三级结构预测图，绿色为EDF1的结构，紫色为edf1中的三个氨基酸插入。被破坏的α-helix正好是MYB结构域中第三个α-helix结构。

(B)同源的已解析结构的模型中(绿色)MYB domain的第三个α-helix是与DNA大沟结合的部位。蓝色代表EDF1，红色代表edf1的突变位点所在。

图10、GFP-EDF1抑制EDF1对ZCN8的转录激活作用。

图11、使用分子标记来鉴定基因型的实例。

经过PCR、酶切后电泳检测来鉴定EDF1/edf1基因型单株自交果穗上籽粒的基因型。将基因型为edf1/edf1的单株标记为1；将基因型为EDF1/EDF1的单株标记为2；将基因型为EDF1/edf1的单株标记为3。

具体实施方式

本发明首次研究及揭示了一种新型转录因子EDF1(EMS induced delayedflowering 1)，其编码一个MYB类转录因子，可以通过促进玉米成花素基因ZCN(ZEA MAYSCENTRORADIALIS)家族成员的转录，从而正向调控玉米的开花时间；同时，本发明还揭示了EDF1的等位基因edf1，其能够抑制EDF1对ZCN家族成员的转录调控，并表现出剂量效应。并且，发明还揭示了EDF1及其等位基因edf1作为植物性状调控靶点的应用。

EDF1、edf1

在本发明中，除非特别说明，所述的EDF1或edf1指具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的多肽，还包括具有与EDF1多肽相同功能的序列变异形式。

所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的EDF1或edf1多肽同源性高(比如与SEQ ID NO:1或2所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有EDF1或edf1多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。

来源于玉米以外其它物种的与SEQ ID NO:1或2所示序列的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。

本发明中，所述的“EDF1”或“edf1”也包括它们的同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种玉米的EDF1或edf1以及它们与ZCN家族成员的相互作用，但是获自其它物种的与所述EDF1或edf1高度同源(如具有60％以上，如70％，80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。例如在保守性含有ZCN家族成员的植物中，若存在与本发明中“EDF1”或“edf1”具有同源性，特别是高度同源或结构域类似的基因，且也能与ZCN家族成员之间发挥与本发明中所给出的相同的相互作用或相互调控功能，那么该基因也应被涵盖在本发明中。

改良植物的方法

如本文所用，所述的“植物(作物)”是包含/表达“EDF1”或“edf1”或它们的同源物的植物；较佳地，所述的植物包括：双子叶十字花科植物或单子叶禾本科植物。更佳的，所述的植物是禾本科植物如玉米，包括：籽粒玉米(普通玉米)、青贮玉米、鲜食玉米。

目前报道的玉米开花调控基因中ID1和VGT1的调控表型非常强不利于生产应用；ZmCCT在进化中产生了多个拷贝，单基因的突变表型较弱，可以通过多位点的筛选调控玉米开花。但这就限制了它无法快速地应用于育种；相比之下，DLF1调控表型适中可以应用于生产，但是它作为单基因的质量性状则可塑性不强，没有QTL的范围调节优点，因此本领域亟待开发既具有较强的开花调控作用、又具有作用可调节性的单基因。

基于上述目的，本发明人经过深入研究，揭示了转录因子EDF1，其作为开花正调控因子促进玉米成花素ZCN8及其同源基因ZCN7和ZCN12的表达。本发明中获得了EDF1的功能获得性突变形式edf1，发现edf1可以通过抑制EDF1对于ZCN8的转录激活作用而使玉米延迟开花，也发现EDF1/edf1在调控玉米开花时间上具有剂量效应。

因此，基于本发明人的新发现，本发明提供了一种改良植物的方法，所述方法包括：调控植物体内转录因子EDF1或其等位基因edf1，进而调控植物体开花时间和生物量，具体包括如开花时间、生育期、营养生长期、株高的生长性状，或如叶片数的产量性状。或者，所述方法包括：调节植物体内转录因子EDF1对于ZCN家族成员的调控作用(包括转录水平激活作用)，进而调控植物体开花时间和生物量。

一方面，本发明提供了一种缩短植物开花时间、生育期或营养生长期的方法，包括：上调EDF1的表达或活性和/或下调EDF1等位基因edf1的表达或活性。另一方面，本发明提供了一种延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数的方法，包括：下调EDF1的表达或活性和/或上调EDF1等位基因edf1的表达或活性。

应理解，在得知了所述EDF1或其等位基因edf1，及其与ZCN家族基因的相互作用机制后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的EDF1或其等位基因edf1的表达或调节EDF1对ZCN家族基因的调控作用。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低EDF1或其等位基因edf1的表达或使之缺失表达。

本发明中，所述的EDF1或edf1的蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低EDF1或edf1蛋白的活性、降低EDF1或edf1蛋白或其编码基因的稳定性、下调EDF1或edf1蛋白的表达、减少EDF1或edf1蛋白有效作用时间、或抑制EDF1或edf1基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调EDF1或edf1有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰EDF1或edf1基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑EDF1或edf1的基因编辑试剂，等等。

本发明中，所述的EDF1或edf1的蛋白或其编码基因的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”。任何可提高EDF1或edf1的活性、提高EDF1或edf1的稳定性、上调EDF1或edf1的表达、增加EDF1或edf1有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调EDF1或edf1有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

本发明还提供了一种下调植物中EDF1或其等位基因edf1的表达的方法，包括对EDF1或其等位基因edf1进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，使EDF1转变为edf1基因，或使edf1基因转变为EDF1，从而改变植物的性状。作为一种更为具体的实施例方式，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除或下调靶基因(根据控制植物的需要，可以是EDF1或其等位基因edf1)。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

作为本发明的另一种实施方式，提供了一种下调植物中EDF1或其等位基因edf1的表达的方法，包括：(1)将干扰EDF1或其等位基因edf1表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

本发明中，经精细比较，EDF1与edf1之间的差异较为明确。因此，作为本发明的优选方式，通过破坏EDF1的MYB结构域的DNA结合能力来下调EDF1。本发明的实施例中，提供了一种针对EDF1序列、在其第95位与第96位之间插入外源的氨基酸从而破坏其DNA结合能力的实例。事实上，若是在第95位与第96位之间插入VVK，则EDF1转变为edf1，从而使得原发挥EDF1功效的该转录因子转变为发挥edf1的功效。应理解，这种变化是交互的，也可以通过本领域已知的基因改造手段，来将edf1转变为EDF1。

作为本发明的另一种实施方式，还提供了一种上调植物中EDF1或其等位基因edf1的表达的方法，所述的方法包括：将EDF1或其等位基因edf1的编码基因或含有所述编码基因的表达构建物或载体转入植物中。

应用

本发明的技术方案可被应用于进行多种途径的分子设计育种。

作为一种应用方式，利用EDF1正调开花或EDF1促进ZCN8的基因表达的机制，可以定向地分子设计育种，应用于缩短优良植物品种的生育期。

作为另一种应用方式，edf1负调开花，edf1抑制EDF1对ZCN8的转录调控，该抑制作用呈现出剂量效应，这将为农业生产中人为干预开花时间提供理论指导以及基因资源。这个机制可以分子设计育种，应用于增加优良植物品种的生育期；

作为另一种应用方式，edf1获得的抑制开花作用以及其对于植物株高的促进作用，这两种表型直接影响到了植物的持绿期和生物量，可以分子设计育种，应用于培育青贮植物品种，如青贮玉米。

作为另一种应用方式，根据edf1的突变特点，通过基因编辑手段改变EDF1的MYB结构域，获得类似于edf1的功能获得性突变，应用于增加优良植物品种的生育期或者培育青贮植物品种。edf1调控开花的作用适中，且因其剂量效应而呈现的可调节性是其在农业生产中应用的一个优点。EDF1的等位基因edf1的MYB结构域的DNA结合能力受到影响而使其获得新的功能这一机制的解析为通过基因编辑手段快速改变某优良植物品种的EDF1基因从而人为干预开花提供了理论依据。EDF1的等位基因edf1可以平均增加约3.5片叶子和节间，使株高增加30cm。显然这是出乎意料的。

植物定向筛选或靶向性筛选调控分子

在得知了EDF1或其等位基因edf1的功能及其对于ZCN家族基因的影响及其分子机制以后，可以通过这一调节机制或以EDF1或其等位基因edf1为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控植物开花时间和生物量的物质或潜在物质。

因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定植物调节剂的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的EDF1或其等位基因edf1的表达：若是该测试植物的EDF1表达低于该类植物的EDF1平均表达值，或edf1表达高于该类植物的edf1平均表达值，则其为开花时间、生育期或营养生长期缩短的植物；若是该测试植物的EDF1表达高于该类植物的EDF1平均表达值，或edf1表达低于该类植物的edf1平均表达值或不表达，则其为开花时间、生育期或营养生长期延长的植物，或株高或叶片数增加的植物。

本发明提供了一种筛选调节植物开花时间和生物量的调节剂的方法，所述方法包括：将候选物质加入到含有EDF1的体系中；较佳地，该体系含有ZCN家族基因；检测所述体系中，观测体系中EDF1的表达或活性；若所述候选物质上调EDF1的表达或活性，或促进EDF1对于ZCN家族基因的上调作用，则表明该候选物质是缩短植物开花时间、生育期或营养生长期的调节剂；若所述候选物质下调EDF1的表达或活性，或抑制EDF1对于ZCN家族基因的上调作用，则表明该候选物质是延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数的调节剂。

本发明还提供了另一种筛选调节植物开花时间和生物量的调节剂的方法，所述方法包括：将候选物质加入到含有edf1的体系中；检测所述体系中，观测体系中edf1的表达或活性；若所述候选物质下调edf1的表达或活性，则表明该候选物质是缩短植物开花时间、生育期或营养生长期的调节剂；若所述候选物质上调edf1的表达或活性，则表明该候选物质是延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数的调节剂。

以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。

经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于EDF1或其等位基因edf1，或作用于EDF1或其等位基因edf1与ZCN家族基因相互机制的、对植物开花时间和生物量有调控作用的潜在物质。

本发明的积极进步效果在于：

1.利用EDF1正调开花，edf1负调开花，它们表现出的较强的调节作用以及剂量效应为优良的植物品种快速的向高纬度或者低纬度地区的快速推广提供了理论指导以及优质的基因资源；

2.利用edf1负调开花延长植物的营养生长期，同时也增加叶片数增加植物株高，改变一个基因可以同时优化可用作青贮植物的两个特点，展现了在培育青贮植物品种中它的高投入产出比；

3.模拟edf1的突变特点，为利用基因编辑手段快速改良植物品种提供了理论指导以及优质的基因资源。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、溶液或试剂

EMS工作液：20μL EMS加入到30mL石蜡油(paraffin oil)中。

硫代硫酸钠溶液：含1％Tween的10％的硫代硫酸钠溶液。

2、植物材料

野生型材料：W22，玉米自交系W64A和HiII为公共玉米种质。W22用于EMS诱变、建库和筛选突变体，W64A用于克隆基因中构建mapping群体，Hi II用于功能互补转基因实验。W22背景的EW0019获自W22的EMS诱变突变体库。

edf1：在本发明中筛选获得的功能获得性的EDF1点突变突变体。

功能互补转基因植株pEDF1:EDF1的建立：克隆EDF1编码区CDS序列，用EDF1启动子驱动表达EDF1，转化Hi II，获得pEDF1:EDF1转基因植株。

3、花丝与花粉处理

(1)处理前一天将已抽出少量花丝的雌穗用剪刀剪去部分包衣及花丝，以确保第二天花丝整齐地抽出，方便处理；(2)处理前一天晚上(或处理当天一早)，对雄穗中部部分散粉的雄花进行套袋处理，套袋前除去老花粉；(3)处理当天早上收集花粉，用滤网过滤除去花药，然后用带有刻度的离心管大致估量花粉体积；(4)以花粉10倍体积的EMS工作液处理花粉，振荡摇匀50min左右，期间每隔3-5min混一次，使花粉均匀分布在EMS工作液中，静置片刻，待花粉全部沉降到离心管底部后，倒掉石蜡油；(5)用毛笔将处理好的花粉刷在抽出的花丝上，然后对处理处的雌穗进行套袋处理，在袋上做好记录。通常处理过的花粉活力可以持续75min左右，但是动作仍要迅速；(6)第二天和第三天分别重复一次步骤3-5。在所有的处理过程必须佩带一次性全方位防护工作服、面罩、手套；(7)使用过的所有实验用品和防护用品都需喷施硫代硫酸钠溶液进行EMS解毒处理。

4、玉米的种植

春季和秋季非转基因材料种植在上海松江中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所作物栽培基地，转基因材料则种植在基地转基因安全圃内。

冬季非转基因材料种植在三亚中国农科院棉花研究所南繁基地吉阳镇大茅村，转基因材料则种植在上海植物生理生态研究所人工气候室。

5、碱煮法粗提玉米胚乳基因组DNA

(1)用蒸馏水浸泡籽粒30min，从籽粒顶部边缘切取少量胚乳要尽量的薄，剥去种皮，将胚乳放置于96孔PCR板中，剩余种子放入对应编号的48孔板中晾干；(2)加入100μL0.1M的NaOH，盖上硅胶膜，PCR仪中99℃碱煮12min；(3)加入100μL 1×TE(pH 2.0)缓冲液中和，颠倒混匀，短离，4℃或-20℃保存备用。

6、基因型鉴定

本发明人采用聚合酶链式反应(PCR)的方法，使用Transgen公司的2×PCR Mix进行扩增。PCR反应体系为：2×PCR Mix 5μL，10μM工作浓度正反向引物各0.5μL，DNA模板50-100ng，补充ddH₂O至10μL；PCR程序：95℃预变性3min；95℃变性20s，50～60℃退火20s，72℃延伸30s/kb，35个循环；72℃终延伸5min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用天能凝胶成像系统拍照。

在基因分型实验中，PCR程序为：95℃预变性1min；95℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终延伸2min。PCR结束后，每个反应加入Hind III 0.125μL，Cutsmart Buffer 1μL，ddH₂O 1μL，混匀后37℃酶切30min。反应产物进行聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，采用天能凝胶成像系统拍照。

7、实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)

将上述反转录产物稀释20倍作为qPCR模板，采用的SYBR Premix Ex Taq，TAKARA(Cat#RR420A)试剂盒进行实时荧光定量PCR，在Agilent Mx3000P实时荧光定量系统中运行，反应体系为：模板4μL，SYBR Green II Premix 6μL，正反向引物各0.25μL，ROX dye II0.25μL，ddH₂O补足至12μL。

采用两步法PCR运行程序为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火加延伸30sec共40循环在qPCR过程中进行荧光信号的采集。

qPCR结果分析时，使用内参基因UBQ，均有三次技术性重复及3次以上生物学重复。

8、瞬时转录激活实验(Dual-LUC实验)

扩增PFG MYB启动子，通过酶切连接方法连接到pGreenⅡ 0800-LUC报告基因载体中，该载体有35S驱动RENILLA及目的基因启动子驱动LUC表达。将含有报告载体与效应载体(EDF1-CFP或edf1-CFP)的农杆菌混合，共转烟草，两天后检测报告基因的表达情况。使用Promega公司的双荧光报告系统检测试剂盒，通过化学发光检测系统luminometer(GloMax20/20，Promega)进行荧光信号的定量，计算LUC/REN的比值。或者使用冷CCD直接采集LUC信号。

实施例1、通过EMS诱变筛选获得了半显性的晚花突变体edf1

选择玉米常用自交系W22为诱变材料，采用花粉EMS诱变的方法建立了突变体库、进行表型筛选获得了晚花突变体edf1。将来自W22背景的EW0019与W64A杂交，在F2分离群体中，本发明人发现它的突变体开花时间与野生型相比要晚两周左右；杂合体植株的开花时间则介于野生型和纯合突变体之间，显示出了一定程度的晚花表型。这说明edf1是一个半显性的晚花突变体(图1A、C)。

edf1在上海春季(3月15日到7月15日)和秋季(7月25日到10月25日)的长日照条件下以及在海南三亚冬季(11月1日到3月1日)的短日照条件下都表现为晚花表型。

同时，统计叶片数发现，突变体叶片数最多，野生型叶片数最少，而杂合体植株处于中间(图1B)，说明该突变型显著增加了叶片的数量。

实施例2、edf1通过影响玉米成花素ZCN8的表达造成晚花表型

通过对突变体发育过程的跟踪取材检测，本发明人发现：与突变体晚花表型一致，其顶端分生组织的转换期和成花素ZCN8表达起峰时间都要比野生型晚两周左右(图2A)。这个检测结果提示，edf1突变体的晚花表型是由于ZCN8的正常表达受到影响。

本发明人还检测了上海夏季长日照条件下edf1和WT在萌发后第5片叶子完全展开时ZCN8一天内的表达模式，结果如图2B，野生型在一天内发生有波动但相对较高地表达，而edf1则在极低的水平表达。说明萌发后第5片叶子完全展开时，野生型ZCN8表达已上升，预示着开花的即将来临，这显著早于edf1。

本发明人还检测了edf1和WT中ZCN8的表达量随发育天数的变化，结果如图2C，野生型在萌发后约第20天时表达量显著升高，而edf1则在第24天后才有缓慢提升，到第28天时增速提高。

实施例3、edf1突变体基因的克隆

通过图位克隆结合全基因组测序，本发明人定位到了编号为GRMZM2G052544的候选基因(图3A)。

对GRMZM2G052544的基因组DNA序列分析，发现其第二内含子的第8个碱基由鸟嘌呤G突变为腺嘌呤A，与后面的碱基一起又形成了一个新的AGGT的5’剪接位点，这一变化导致其干扰了原有剪接位点的选择。在新形成的转录本中多保留了第二内含子中的前9个碱基(图3B，C)。利用RT-PCR检测发现这种形式的转录本占据了多数，而原来的转录本仍有表达，但检测到的量明显少于突变后的形式(图3D，E)。

本发明人检索了玉米生物信息学网站MaizeGDB(https://www.maizegdb.org)，在已有SNP多态信息的自交系中查询到该突变位点，其是非常保守的。GRMZM2G052544编码了一个MYB类型的转录因子，具有一个保守的MYB DNA结合结构域。这个突变位点处在其MYB结构域的末端处。

实施例4、edf1候选基因的验证

为了验证该候选基因GRMZM2G052544，本发明人首先从玉米的Mu插入突变体库(参见玉米遗传学和基因组学数据库(MaizeGDB))中查到在该基因的第三个内含子中有一个Mu插入位点mu1032844::Mu存在于插入突变体UFMu-02656中。随后本发明人申请获得了这个Mu插入突变体(申请自Maize Genetics Cooperation Stock Center)，但转录水平的检测发现该Mu插入并没有引起基因GRMZM2G052544的转录水平变化，也没有发现它有晚花表型，所以本发明人采用了功能互补转基因的方法来验证该候选基因。

功能互补转基因实验中将基因GRMZM2G052544的启动子(-2,028bp至-1bp)(SEQID NO:3)连接其CDS序列(不含终止密码子，总长1,134bp)构建到载体pEarleyGate 302进行功能互补转基因实验，通过农杆菌浸染玉米幼胚的方法将功能互补载体转入HiII品系中。

结果共获得了5个转基因事件，将它们与edf1突变体杂交后自交获得功能互补的单株。图4中所示的是其中一个事件的功能互补结果。表型观察发现，edf1突变体背景下的转基因事件在一定程度上恢复了edf1的晚花表型，说明基因GRMZM2G052544是正确的候选基因，转基因纯合的阳性植株基因型为EDF1/EDF1/edf1/edf1表现为杂合体的表型也验证了EDF1/edf1两个等位基因表现出的剂量效应(图4)。

上述结果表明，EW0019的晚花表型确实是由于GRMZM2G052544基因的突变导致的。

实施例5、edf1的转录组分析

对16DAG的野生型和edf1的叶片进行了转录组测序。edf1中在所有检测到的基因中查询了ZCN家族成员基因的表达变化，发现有三个成员ZCN7，ZCN8和ZCN12的转录水平发生了明显的下调(表1)，暗示了EDF1的突变是影响了成花素ZCN家族多个成员的表达造成了突变体的晚花表型。

表1、转录组中检测到的ZCN家族基因的变化

-：表示没有显著变化

实施例6、EDF1/edf1对于ZCN8的转录调控

为了检测EDF1是否可以促进FT同源基因ZCN8的转录，本发明人在烟草叶片中做了瞬时转录激活实验。采用Dual-LUC载体报告系统：ZCN8的启动子驱动报告基因萤火虫荧光素酶(LUC)，35S启动子驱动内参报告基因海肾荧光素酶(REN)。效应因子载体采用了35S启动子驱动的EDF1或edf1(图5A)。

检测发现，EDF1能明显激活报告基因的表达；当将效应因子edf1的表达量逐渐加大时，它抑制了EDF1对于报告基因的表达激活作用(图5B)。这说明EDF1对于ZCN8的转录有很强激活作用，而edf1则可以抑制EDF1对于ZCN8的转录激活作用。

实施例7、EDF1/edf1对于玉米株高的调节作用

通过田间株高的测量发现：相对于野生型植株，EDF1/edf1杂合植株以及edf1/edf1纯合突变体的株高都有显著的变化，突变体比野生型高出30cm之多(图6)，说明edf1可以明显的增加玉米的植株高度。

实施例8、EDF1/edf1对于玉米开花调控的工作模型

根据EDF1/edf1调控开花的作用，本发明人得出了EDF1/edf1的开花调控的工作模型：当需要将开花时间延后时，通过增加edf1的拷贝数和表达量来实现；当需要缩短开花时间时，则通过增加EDF1的拷贝数和表达量来实现(图7)。

实施例9、EDF1/edf1的蛋白结构变化分析

为了进一步解析edf1的点突变后增加了三个氨基酸的突变本质最终导致edf1获得新功能的原因，通过对两个转录本的二级结构(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)分析发现，edf1中三个氨基酸的插入破坏了EDF1的第87到98位氨基酸所形成的α-helix结构(图8)。

而对三级结构的预测(https://swissmodel.expasy.org)则表明edf1突变了MYB结构域中第三个α-helix结构，而有已解析出结构的模型中这个α-helix正是与DNA大沟结合的区段(图9)，并提示该位点的三个氨基酸插入破坏了其MYB结构域的DNA结合能力。而负责蛋白质相互作用的MYBcc domain却没有受到影响。

结果提示，这多出来的三个氨基酸影响了MYB结构域的构象，进而获得了新的功能，该新功能为抑制开花的功能。

实施例10、EDF1/edf1的结构决定功能

本发明人推测，edf1的突变是对其结合DNA产生了位阻效应(图9)，影响了其MYB结构域对DNA的结合能力。

为了验证上述假设，本发明人通过在EDF1的N端融合一个27KDa的GFP标签，通过Dual-LUC实验来检测融合蛋白的活性，实验结果发现GFP融合在EDF1的N端也抑制了EDF1的转录激活能力(图10)。

综合上述实验结果，无论是在EDF1的N端融合一个Tag，改变MYB结构域上的α-helix结构，或者是改变第三个α-helix结构之后的氨基酸都可以影响到EDF1的MYB结构域的DNA结合活性从而获得抑制开花的功能获得性突变体。这一发现也为基因编辑改变玉米开花时间提供了非常好的理论基础和基因资源。

实施例11、对EDF1/edf1的鉴定方法

为了方便、简单快捷的区分EDF1/edf1这一对等位基因，本发明人根据edf1的突变位点设计了用来鉴定的dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)分子标记(如图11)。通过这一方法，可以实现快速的基因分型。

此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 调节植物开花时间及生物量的基因及其利用

<130> 192635

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 375

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 1

Met Phe Pro Ser Lys Lys Ala Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala Val Ser Ser Asn Asp Ser Arg Gln Gln Ala Met Cys Val Gln Ala

20 25 30

Asp Ser Gly Ser Gly Leu Val Leu Thr Thr Asp Pro Lys Pro Arg Leu

35 40 45

Arg Trp Thr Val Glu Leu His Glu Arg Phe Val Asp Ala Val Thr Gln

50 55 60

Leu Gly Gly Pro Asp Lys Ala Thr Pro Lys Thr Ile Met Arg Val Met

65 70 75 80

Gly Val Lys Gly Leu Thr Leu Tyr His Leu Lys Ser His Leu Gln Lys

85 90 95

Phe Arg Leu Gly Lys Gln Pro His Lys Glu Phe Asn Glu His Ser Val

100 105 110

Lys Asp Ala Ala Ala Ala Met Glu Met Gln Arg Asn Ala Ala Ser Ser

115 120 125

Ser Gly Met Met Gly Arg Ser Met Asn Asp Arg Ser Val His Met Asn

130 135 140

Glu Ala Ile Arg Met Gln Met Glu Val Gln Arg Arg Leu His Glu Gln

145 150 155 160

Leu Glu Val Gln Arg His Leu Gln Met Arg Ile Glu Ala Gln Gly Lys

165 170 175

Tyr Met Gln Ser Ile Leu Glu Lys Ala Tyr Gln Thr Ile Ala Thr Gly

180 185 190

Asp Leu Ala Ala Cys Ser Pro Val Ala Ala Gly Tyr Lys Ser Leu Leu

195 200 205

Gly Asn Pro Gln Ala Met Leu Asp Val Cys Ser Leu Lys Asp Met Gly

210 215 220

Pro Ser Met Gly Phe Pro Ser Leu Gln Asp Leu His Met Tyr Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly His Cys Leu Asp Leu Gln Gln Gln Met Glu Arg Pro Met Glu

245 250 255

Ala Phe Phe Ala Ser Cys Asp Ile Gly Ser Leu Ala Lys Lys Arg Pro

260 265 270

Val Ser Pro Tyr Ala Asp Asp Asp Gly Gly Lys Ser Pro Met Leu Trp

275 280 285

Gly Glu Asp Asp Glu Gly Lys Gly Ile Val Asp His Phe Gln Met Ala

290 295 300

Ala Pro Met Met Asp Ala Ala Gly Ile Asp Val Met Asp Ser Ile Ala

305 310 315 320

Asp Val Tyr Gly Asp Ala Lys His Met Thr Met Ser Gly Asp Ser Thr

325 330 335

Gly Ser Lys Gly Gly Gly Phe Asp Val Arg Leu Glu Arg Pro Ser Leu

340 345 350

Arg Arg Pro His Met Gly Gly Ser Pro Ser Val Leu Gly Gly Gly Gln

355 360 365

Thr Arg Asn Leu Ser Tyr Gly

370 375

<210> 2

<211> 378

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 2

Met Phe Pro Ser Lys Lys Ala Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala Val Ser Ser Asn Asp Ser Arg Gln Gln Ala Met Cys Val Gln Ala

20 25 30

Asp Ser Gly Ser Gly Leu Val Leu Thr Thr Asp Pro Lys Pro Arg Leu

35 40 45

Arg Trp Thr Val Glu Leu His Glu Arg Phe Val Asp Ala Val Thr Gln

50 55 60

Leu Gly Gly Pro Asp Lys Ala Thr Pro Lys Thr Ile Met Arg Val Met

65 70 75 80

Gly Val Lys Gly Leu Thr Leu Tyr His Leu Lys Ser His Leu Gln Val

85 90 95

Val Lys Lys Phe Arg Leu Gly Lys Gln Pro His Lys Glu Phe Asn Glu

100 105 110

His Ser Val Lys Asp Ala Ala Ala Ala Met Glu Met Gln Arg Asn Ala

115 120 125

Ala Ser Ser Ser Gly Met Met Gly Arg Ser Met Asn Asp Arg Ser Val

130 135 140

His Met Asn Glu Ala Ile Arg Met Gln Met Glu Val Gln Arg Arg Leu

145 150 155 160

His Glu Gln Leu Glu Val Gln Arg His Leu Gln Met Arg Ile Glu Ala

165 170 175

Gln Gly Lys Tyr Met Gln Ser Ile Leu Glu Lys Ala Tyr Gln Thr Ile

180 185 190

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195 200 205

Ser Leu Leu Gly Asn Pro Gln Ala Met Leu Asp Val Cys Ser Leu Lys

210 215 220

Asp Met Gly Pro Ser Met Gly Phe Pro Ser Leu Gln Asp Leu His Met

225 230 235 240

Tyr Gly Gly Gly Gly His Cys Leu Asp Leu Gln Gln Gln Met Glu Arg

245 250 255

Pro Met Glu Ala Phe Phe Ala Ser Cys Asp Ile Gly Ser Leu Ala Lys

260 265 270

Lys Arg Pro Val Ser Pro Tyr Ala Asp Asp Asp Gly Gly Lys Ser Pro

275 280 285

Met Leu Trp Gly Glu Asp Asp Glu Gly Lys Gly Ile Val Asp His Phe

290 295 300

Gln Met Ala Ala Pro Met Met Asp Ala Ala Gly Ile Asp Val Met Asp

305 310 315 320

Ser Ile Ala Asp Val Tyr Gly Asp Ala Lys His Met Thr Met Ser Gly

325 330 335

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340 345 350

Pro Ser Leu Arg Arg Pro His Met Gly Gly Ser Pro Ser Val Leu Gly

355 360 365

Gly Gly Gln Thr Arg Asn Leu Ser Tyr Gly

370 375

<210> 3

<211> 2028

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 3

tcatgaagga catggttgta aattctcaca ggctgcgtcc tgtgcctata aatagtgaac 60

agtactcctt tactgttcac gctttttgat tcgggttttt caccatctca tcattttgag 120

aaccaacctt tgtcaaggca aaggtataat tgtatccaat actcaaatat attgattgag 180

tataatatga ttcatttact tttgatactc tatattttat gttatttcgt acaatttatc 240

aacgtacgat tacgaaaact caaccttcgt aatcgtattg tcgtacgcct tcgtctagag 300

ttcattatcc ccgagggaat aatgcttcac tggacgaagg tcattatcat ttaatatttt 360

atgttgtctt gttcttgatt catagcggtt gagaacaagt ccccaacaaa aacagtgtga 420

gtaattaata ggacatgttc aaagtagtca aatttttgtg ctctaaatat gcgttgctca 480

gtgccaacac tccatctcca tctttatgtt tgtttggctt taattcatat cagcttctat 540

tacttctaaa tatttttgtc tttgaattac agttgcaaca gtacaaatag ttagctttaa 600

tccgaagtga atagttaaga aaccctgtac gttttaagac ggtaatgaag tggccatatc 660

cctcagctag cgggtatgac aggttaatag aataacattt acatattgaa ctgcgcgcct 720

gtttgttttt ctggaatggt caaaaagggc cggagagaat ggacacactt agtacaaact 780

aaaggtggat aacttgcttg tttctagtgc caaaggagaa gcaatgaaaa gtagtactga 840

tcctgccatg tgtgtgggac acacaaagac aaaatcacgc gcaaggtcat tagatttatt 900

agcccccgat atgtcattat tagctagcga tgttcatgtg ggatctaacg gttctgtcaa 960

attttctatg cattattatt tatactgact atatgtgtgg agtgatactg tttcgtatag 1020

ctcgatctcc tggatttaac ctggaattct ctagcatttt tgccaaacaa aagactaaac 1080

agaaatagac atatacatgg ctcgataatc tagccgcctc taggagcttt tgtccaacaa 1140

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gggtactagt aataacacgc ttcataaaaa aaaactttgg cctctcatct ttgtgctcag 1380

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ggtggctttg ttgttttcct ccgggccggc cggggcagcg cgctggatag aatatcacac 1500

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gagatagagg aggttcgtgt gcgaggcgcg gggagaatag tagacaga 2028

Claims

1.一种调节植物开花时间和生物量的方法，其特征在于，包括：调节植物中EDF1或其等位基因edf1的表达或活性，从而调节植物开花时间和生物量；所述EDF1是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽，所述edf1是SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽，所述植物为玉米。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法选自：

(a) 上调EDF1的表达或活性和/或下调EDF1等位基因edf1的表达或活性，从而缩短植物开花时间、生育期或营养生长期；或

(b) 下调EDF1的表达或活性和/或上调EDF1等位基因edf1的表达或活性，从而延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，(a)中，EDF1被上调或EDF1等位基因edf1被下调，上调ZCN家族基因表达，进而缩短植物开花时间、生育期或营养生长期；或

(b)中，EDF1被下调或EDF1等位基因edf1被上调，使得ZCN家族基因表达被下调，进而延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数；

其中所述的ZCN家族基因为ZCN8。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，下调EDF1包括：在植物中敲除或沉默EDF1的编码基因，或抑制EDF1的活性；或

下调edf1包括：在植物中敲除或沉默edf1的编码基因，或抑制edf1的活性。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，下调EDF1为：以特异性干扰EDF1的编码基因表达的干扰分子来沉默EDF1，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除EDF1的编码基因，以同源重组的方法敲除EDF1编码基因，或在含有EDF1的植物中将EDF1突变为edf1。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，下调edf1为：以特异性干扰edf1的编码基因表达的干扰分子来沉默edf1，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除edf1的编码基因，或以同源重组的方法敲除edf1编码基因，或在含有edf1的植物中将edf1突变为EDF1。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，上调EDF1包括：将EDF1的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；或在含有edf1的植物中将edf1突变为EDF1；或

上调edf1包括：将edf1的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；或在含有EDF1的植物中将EDF1突变为edf1。

8.一种调节植物开花时间和生物量的方法，其特征在于，所述方法包括：调控植物中EDF1或其等位基因edf1对于ZCN家族基因的表达调控作用，从而调节植物开花时间和生物量；所述EDF1是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽，所述edf1是SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽，所述植物为玉米；其中所述的ZCN家族基因为ZCN8。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法选自：

(i) 上调EDF1的表达或活性和/或下调EDF1等位基因edf1的表达或活性，从而上调ZCN家族基因的表达，进而缩短植物开花时间、生育期或营养生长期；或

(ii) 下调EDF1的表达或活性和/或上调EDF1等位基因edf1的表达或活性，从而下调ZCN家族基因的表达，进而延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数；其中所述的ZCN家族基因为ZCN8。

10.一种EDF1或其等位基因edf1或它们的调节剂的用途，用于调节调节植物开花时间和生物量，所述的开花时间和生物量包括：开花时间，生育期，营养生长期，株高，叶片数；所述EDF1是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽，所述edf1是SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽，所述植物为玉米。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，EDF1或其上调剂、edf1下调剂缩短植物开花时间、生育期或营养生长期；

edf1或其上调剂、EDF1下调剂延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数。

12.一种定向选择或鉴定植物的方法，其特征在于，所述方法包括：鉴定测试植物中的EDF1或其等位基因edf1的表达：

若是该测试植物的EDF1表达高于该类植物的EDF1平均表达值，或edf1表达低于该类植物的edf1平均表达值，则其为开花时间、生育期或营养生长期缩短的植物；

若是该测试植物的EDF1表达低于该类植物的EDF1平均表达值或不表达，或edf1表达高于该类植物的edf1平均表达值，则其为开花时间、生育期或营养生长期延长的植物，或株高或叶片数增加的植物；

其中，所述EDF1是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽，所述edf1是SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽，所述植物为玉米。

13.一种筛选调节植物开花时间和生物量的调节剂的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 将候选物质加入到含有EDF1的体系中；

(2) 检测所述体系中，观测(1)的体系中EDF1的表达或活性；

若所述候选物质上调EDF1的表达或活性，则表明该候选物质是缩短植物开花时间、生育期或营养生长期的调节剂；

若所述候选物质下调EDF1的表达或活性，则表明该候选物质是延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数的调节剂；

其中，所述EDF1是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽，所述edf1是SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽，所述植物为玉米；所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、植物组织体系或植物器官体系。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，(1)中，该体系含有ZCN家族基因；(2)中，若所述候选物质促进EDF1对于ZCN家族基因的上调作用，则表明该候选物质是缩短植物开花时间、生育期或营养生长期的调节剂；

若所述候选物质抑制EDF1对于ZCN家族基因的上调作用，则表明该候选物质是延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数的调节剂；

其中所述的ZCN家族基因为ZCN8。

15.一种筛选调节植物开花时间和生物量的调节剂的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将候选物质加入到含有edf1的体系中；

(2)检测所述体系中，观测(1)的体系中edf1的表达或活性；若所述候选物质下调edf1的表达或活性，则表明该候选物质是缩短植物开花时间、生育期或营养生长期的调节剂；若所述候选物质上调edf1的表达或活性，则表明该候选物质是延长植物开花时间、生育期或营养生长期，增加株高或增加叶片数的调节剂；

16.一种植物EDF1或其等位基因edf1的用途，用于作为鉴定植物开花时间和生物量的分子标记；所述EDF1是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽，所述edf1是SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽，所述植物为玉米。

17.一种分离的多肽，其是如SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。

18.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求17所述的分离的多肽。