CN110079534B - 调控玉米开花期的基因、启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了调控玉米开花期的基因、启动子及其应用。本发明首先提供了调控玉米开花期或叶片数量的关键基因组区域，其多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，本发明利用遗传学和分子生物学的方法证明了ZmSBP29基因具有调控玉米开花期和叶片数的功能。本发明进一步提供了可用于调控ZmSBP29基因表达量的关键基因组变异并创制了超表达ZmSBP29基因的转基因事件，不仅能应用于改良玉米开花期和株型，还可将其应用于玉米的高产和适应性育种。

Description

调控玉米开花期的基因、启动子及其应用

技术领域

本发明涉及调控玉米开花期的基因以及启动子，尤其涉及调控ZmSBP29基因的启动子突变体和检测引物，本发明进一步涉及它们在调控玉米开花期或叶片数量中的应用，属于玉米开花期以及叶片数量的基因调控领域。

背景技术

玉米是集粮食、饲料、工业原料于一身的重要农作物，是目前中国、也是全球种植范围最广、需求最大的谷类作物之一。适宜的开花期是决定玉米适应不同生态环境种植、继而保证其产量供应的关键因素之一。中国共有6大玉米种植区，其中，北方春播玉米区和黄淮海平原夏播玉米区是两大玉米主产区。对于北方春播玉米区，适当早花能保证玉米有足够的时间进行灌浆并避开后期的霜冻，利于高产；对于黄淮海夏播玉米区，受“一年两熟”耕作制度的影响，适当早花是保证玉米产量和保障后茬作物正常轮作的关键。此外，研究表明，适当早花还有利于降低玉米空杆率和加速籽粒脱水，并且针对玉米开花期基因的改良还有助于玉米根系性状的改善。对美国和中国不同年代玉米自交系的研究还表明，开花期是玉米育种中重要的选择性状，并且早花是近现代中美玉米育种历程中共有的选择趋势。因此，发掘和应用控制玉米花期的关键基因，对于培育、筛选和改良适合不同生态区种植的玉米新品种至关重要。

鉴于花期对于玉米生产的重要性，科研人员已对玉米花期的遗传和分子调控机制开展了部分研究。玉米开花期由多条信号途径参与调控。目前仅有少数的玉米开花期基因和数量性状位点(QTL)被克隆和功能验证。如ZCN8、DLF1、ZmMADS1、ZMM4、ID1、VGT1、ZmRAP2.7、phyB1、phyB2、ELM1、ZmGI1a、ZmGI1b、ZmCOL3、ZmCCT9和ZmCCT10等。总体来讲，相较于模式植物拟南芥(拟南芥至少有306个基因参与了植物不同途径的开花调节过程)和单子叶植物水稻，玉米花期调控基因的克隆，及遗传基础和分子机理的研究还十分滞后。

已有报道显示，大多数玉米开花期基因都会部分影响到玉米花器官的发育，影响开花期的同时会造成雌穗(玉米的收获器官)或雄穗的变异，影响玉米产量。而部分早花基因，因提早开花，会缩短玉米进行同化产物积累的时间，从而造成玉米减产。目前，玉米上还鲜有影响玉米开花期同时，不影响玉米产量的开花期基因被报道。

近来研究发现，SPL(SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE)家族基因，如LG1、UB2、UB3、ZmSBP29、TGA1等，在调节玉米株型、穗型和籽粒发育方面起关键作用。但目前为止，还没有SPL基因调控玉米开花期、叶片数等表型的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种调控玉米开花期或叶片数量的基因；

本发明的目的之二是提供调控ZmSBP29基因表达的启动子以及该启动子的突变体；

本发明的目的之三是提供一种调控玉米开花期或叶片数量的转基因方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了一种调控玉米开花期或叶片数量的关键基因(ZmSBP29)，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)或(d)所示：

(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸；或

(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有调控玉米开花期或叶片数量的功能；

(c)与SEQ ID No.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或

(d)在SEQ ID No.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸突变体，且该多核苷酸突变体所编码的蛋白仍具有调控玉米开花期或叶片数量的功能或活性。

本发明所述的基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“突变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，突变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的突变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些突变体。诸如此类天然存在的突变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。突变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的多核苷酸突变体或者是通过重组的方法(例如DNA改组)所得到的突变体，或者是通过自然选择所得到的突变体。

本发明提供了含有所述基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将所述基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该基因或突变体的重组植物表达载体。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.1所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物玉米的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在玉米中的表达效率。

本发明还提供了用于调控ZmSBP29基因表达的启动子序列，其多核苷酸为SEQ IDNo.2所示。

本发明进一步提供了调控玉米开花期和叶片数有关的等位变异Chr7_151256322_G/C、Chr7_151256317_C/T和Indel_7_151256304_5/0，其多核苷酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。

其中，用于扩增SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示多核苷酸及其反向互补序列的PCR扩增引物也属于本发明保护范围之列；利用这些PCR扩增引物，可对玉米品种中的Chr7_151256322_G/C、Chr7_151256317_C/T或Indel_7_151256304_5/0变异情况进行检测从而用于玉米的分子辅助育种。

本发明进一步提供了一种调控玉米开花期或叶片数量的方法，包括：构建ZmSBP29基因超表达植物表达载体；将所构建的超表达植物表达载体转化到玉米中；其中所述ZmSBP29基因的多核苷酸序列优选为SEQ ID No.1所示。

本发明进一步提供了另一种调控玉米开花期或叶片数量的方法，包括：用SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4所述的启动子突变体调控ZmSBP29基因在玉米中的表达。

其中，所述的调控玉米开花期包括使玉米开花期提前；所述的调控叶片数包括减少叶片数量。

将所述启动子突变体与ZmSBP29基因可操作的与其它的表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该ZmSBP29基因的重组植物表达载体。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

本发明中所述的转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的ZmSBP29基因或启动子提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick etal.Plant Cell Reports.1986.5:81-84)。

本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物，优选是玉米。

本发明还涉及用于检测ZmSBP29基因表达量的特异性扩增引物，其多核苷酸序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，利用该特异性扩增引物，可对玉米品种的ZmSBP29基因表达量进行检测，进而为玉米花期育种提供参考。

本发明利用遗传学和分子生物学的方法证明了ZmSBP29基因对调控玉米开花期和叶片数的作用。本发明进一步提供了可用于调控ZmSBP29基因表达量的关键基因组变异，并创制了超表达ZmSBP29基因的转基因事件，不仅对改良玉米开花期和株型具有重要意义，还可将其应用于玉米的产量和适应性育种。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1为通过GWAS方法得到ZmSBP29启动子区的三个变异位点与玉米开花期和叶片数表型显著关联；其中，三个变异位点分别为Chr7_151256322_G/C，Chr7_151256317_C/T和Indel_7_151256304_5/0；图中与X-轴平行的红色的箭头代表ZmSBP29，箭头长度代表ZmSBP29的基因序列长度。DTS代表雌花开花期，TLN代表植株总叶片数。

图2为16个不同类群的自交系在三个变异位点(Chr7_151256322_G/C，Chr7_151256317_C/T和Indel_7_151256304_5/0)处的变异情况；整体上，Chr7_151256322_G/C，Chr7_151256317_C/T和Indel_7_151256304_5/0三个位点连锁在一起，形成两种单倍型：Hap1_GC5和Hap2_CT0。

图3 A和B为ZmSBP29启动子区的三个变异位点处不同变异类型自交系的开花期和叶片数表型比较；其中Hap1_GC5和Hap2_CT0分别代表图2中两种基因型。C为Hap1_GC5和Hap2_CT0两种类型自交系V5时期叶片中ZmSBP29基因的表达分析。

图4为ZmSBP29基因的过表达载体的示意图。

图5为野生型(WT)和过表达转基因事件SBP29-OE1 V5时期叶片中ZMSBP29的基因表达分析。

图6 A为野生型材料和转基因事件SBP29-OE1对应的开花期对比照片；SBP29-OE1比野生型对照早花7天左右；B为野生型材料和转基因事件SBP29-OE1对应的成熟植株的表型照片；成熟的SBP29-OE1植株比野生型少约两节地上部茎。

图7为野生型材料和转基因事件SBP29-OE1对应的果穗对比照片。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的自交系可从“中国作物种质信息网”得到相关信息和申请获取对应的种子。

实施例1 ZmSBP29启动子区的变异位点通过控制ZmSBP29的基因表达量调控玉米开花期和叶片数

1、ZmSBP29启动子区变异位点的发掘

利用350份玉米自交系的深度(>10×)重测序的数据结合已公布的玉米B73 V3基因组，挖掘出了25,320,664单核苷酸多态性分子标记(SNPs)和4,319,510个插入缺失多态性分子标记(Indel)。利用这些挖掘到的分子标记估算出350份玉米自交系的群体结构和亲缘关系，然后结合收集到的4个环境的开花期和叶片数的表型进行全基因组关联分析(GWAS)。其中发现7号染色体上的两个SNP Chr7_151256322_G/C、Chr7_151256317_C/T，和一个Indel Indel_7_151256304_5/0与玉米的开花期和叶片数性状显著关联(图1)。进一步研究发现这三变异位点位于ZmSBP29的启动子区域(SEQ ID No.2)，距离ZmSBP29基因(SEQID No.1)区约230-bp。

2、ZmSBP29启动子区的变异位点所在基因组区域核苷酸序列的获得

根据Chr7_151256322_G/C、Chr7_151256317_C/T和Indel_7_151256304_5/0所在区域的B73 V3基因组序列设计特异的扩增引物，对16个不同类群的玉米自交系进行扩增，获得了该区域的核苷酸序列和该变异的准确信息(图2)。

3、ZmSBP29启动子区的变异位点调控ZmSBP29基因的表达

根据三个变异位点Chr7_151256322_G/C、Chr7_151256317_C/T和Indel_7_151256304_5/0处的基因型可将所测序自交系分为Hap1_GC5和Hap2_CT0两类(图2和图3)。将这两种类型的代表性自交系(图2)，分别种在田间，在其有5片完全展开叶时(V5期，该时期是玉米成花转化的关键时期)，进行取样和液氮速冻。每5个单株的叶片混合成一个样品，每种自交系取3个生物学重复，之后用TRIzol法提取RNA，利用特异引物(SEQ ID No.5和SEQID No.6)检测ZmSBP29基因的表达量。发现Hap2_CT0类型的自交系叶片中ZmSBP29基因显著高表达(图3)。表明ZmSBP29启动子区的变异位点可调控ZmSBP29基因在玉米叶片中的表达。

实施例2 ZmSBP29过表达转基因事件SBP29-OE1的创制和表型分析

1、ZmSBP29基因过表达载体的构建和遗传转化

将B73基因组中ZmSBP29基因的CDS序列用PCR的方法克隆出来，将PCR产物用In-Fusion Advantage Kit插入到植物超表达载体CPB-UBI-EGFP的BamH I与Pst I酶切位点之间(图4)；最终构建成的基因过表达载体经过PCR测序验证无误后，用农杆菌介导的方法转化玉米自交系ZC01。

2、ZmSBP29过表达转基因事件SBP29-OE1的获取

将步骤1中所得的T0代转基因种子于2017年夏种植于河北廊坊转基因基地，在V5时期对其中5个转基因事件进行取样，液氮速冻，之后用TRIzol法提取RNA，利用特异引物(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)检测ZmSBP29基因的表达量。根据基因表达量，从5个转基因事件中筛选出了ZmSBP29基因超表达理想的转基因事件SBP29-OE1(图5)，并自交获得了T1代转基因种子。

3、转基因事件SBP29-OE1的表型分析

2017年冬天，将SBP29-OE1的T1代种子种植于海南乐东转基因基地。观察发现，SBP29-OE1较野生型对照早花约7天(图6A)。植株散粉结束后，对田间植株进行测量发现，SBP29-OE1较野生型对照植株矮化约10cm，地上可见叶片数减少约2片(图6B)。果穗收获后，穗部性状考察发现，SBP29-OE1与野生型果穗性状相似(图7)，表明其并不对玉米产量性状造成不良影响。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学、中国农业科学院生物技术研究所

<120> 调控玉米开花期的基因、启动子及其应用

<130> BJ-2002-190329A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 621

<212> DNA

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acgagcttaa ttcgaccttg aga 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

acagctcgtg gaacctagc 19

Claims (2)

1.ZmSBP29基因在调控玉米开花期或叶片数量中的应用；所述的调控玉米开花期是使玉米开花期提前；所述的调控叶片数是减少叶片数量；ZmSBP29基因的多核苷酸为SEQ IDNo.1所示。

2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：构建ZmSBP29基因超表达重组植物表达载体；将所构建的超表达重组植物表达载体转化到玉米中。

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