CN112680472B - ZmSPL基因在调控玉米冠根或气生根发育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ZmSPL基因在调控玉米冠根或气生根发育中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术将玉米中ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因敲除后，获得玉米Zmsbp20Zmsbp25Zmsbp27三突变体突变体植株，表型调查显示，三突变体幼苗植株的冠根发育提早并且气生根层数增加，表明敲除ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因后可使玉米植株产生更多的气生根。本发明在促进玉米冠根发育或增加玉米气生根数量或层数以及在培育抗倒伏玉米新品种等方面有应用前景。

Description

ZmSPL基因在调控玉米冠根或气生根发育中的应用

技术领域

本发明涉及ZmSPL基因在调控玉米根发育中的应用，尤其涉及ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因在调控玉米冠根或气生根发育中的应用，属于ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因的新用途领域。

背景技术

玉米作为重要的粮食、饲料和生物能源，如今已经成为中国的第一大农作物。充足的玉米产出对保证中国的粮食安全有着举足轻重的作用。随着玉米群体种植密度增加，植株容易倒伏，而倒伏现象大致上分为茎倒和根倒。高密度种植导致茎秆的压碎强度和外皮穿刺强度显著降低，节间直径变小，节间长度增加，从而导致玉米植株易于倒伏。此外，玉米根系发育受到抑制，表现为较高节间(第5-8节间)上的节根条数和平均直径随着密度的增加而减少或降低，这些特征也使得植株易倒伏。

玉米的根系分为三种：1)种子萌发后产生的初生根和种子根；2)后期生长过程中茎秆节上产生的冠根，位于地下的起到吸收水分、无机盐和支撑的作用，位于地上的起支撑作用(又称作气生根或支撑根)。抗倒伏能力强的玉米株系具有理想的根系结构，如根粗、气生根条数多，在根系的构型上表现为开张角度大、扎根深。玉米发育至成株期，茎生根成为根系的主要组成部分，这一阶段茎生根的发育质量是决定植株抗倒伏能力的关键因素。大量研究一致认为入土气生根条数和气生根层数对抗倒性有重要影响，入土气生根条数和层数越多，植株抗倒性越强。抗倒性还和气生根发育的早晚有关，在大喇叭口期就已经形成地上第一层气生根的玉米自交系抗倒性强，说明气生根发育越早，对抗倒性越有利。

SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)是植物特有的一类转录因子，含有结合DNA的SBP-box结构域，因此又被称为SBP转录因子。SPL(或SBP)广泛存在于绿色植物中。SPL在植物形态建成、发育阶段转变、孢子发生、花和果实发育、花青素积累、逆境胁迫应答以及激素信号转导等多个生理生化过程中发挥重要调控作用(Wang and Wang,.2015)。SPL在拟南芥中有17个基因家族成员，在水稻中有19个，在玉米中有30个基因家族成员。microRNA156(miR156)通过转录切割以及翻译抑制来调节SPL基因表达。玉米有11个ZmSPL受到miR156调控，其中ZmSBP13和ZmSBP29的miR156结合位点位于其3'UTR中(Wei etal.,2018)。迄今为止，只有5个玉米ZmSPL基因的功能被报道，分别为LIGULELESS(LG1)调控叶夹角，UNBRANCHED2(UB2)和UB3调控雄穗分枝数，TASSELSHEATH(TSH4)调控苞叶发育、雄穗分枝数和植株分蘖，TEOSINTE GLUME ARCHITECTURE1(TGA1)调控籽粒颖壳发育。迄今为止，在玉米中，还没有关于ZmSPL基因调控玉米冠根或气生根发育的报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供ZmSPL基因在调控玉米冠根或气生根发育中的应用；

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术敲除玉米中ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因后，玉米突变体植株的表型调查显示，Zmsbp20 Zmsbp25 Zmsbp27三突变体幼苗植株冠根发育提早、成熟植株的气生根层数增加，表明敲除ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因后，可使玉米植株产生更多的气生根，这对玉米气生根层数的遗传改良提供了理论依据。

由此，本发明提供了一种促进玉米植株的冠根或气生根的发育或增加玉米植株的冠根或气生根数量或层数的方法，包括：

构建ZmSBP20基因，ZmSBP25基因或ZmSBP27基因中的任何一种基因的敲除载体；将所构建的基因敲除载体转化到玉米植物中，将玉米中的ZmSBP20基因，ZmSBP25基因或ZmSBP27基因中的任何一种基因进行敲除或一种以上的基因同时敲除或突变；

优选的，构建ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因的敲除载体，将玉米中ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因同时进行敲除或突变。

其中，所述ZmSBP20基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述ZmSBP25基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，所述ZmSBP27基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

本发明进一步提供了一种减少玉米冠根数量或延缓或阻滞玉米冠根发育的方法，包括：

(1)构建含有ZmSBP20基因，ZmSBP25基因或ZmSBP27基因的植物表达载体；将所述植物表达载体转化到玉米中，将ZmSBP14基因，ZmSBP10基因或ZmSBP26基因在玉米中进行过表达；

或者(2)：构建含有ZmSBP20基因和ZmSBP25基因的植物表达载体；将所述植物表达载体转化到玉米中，将ZmSBP20基因和ZmSBP25基因同时在玉米中进行过表达；

或者(3)：构建含有ZmSBP25基因和ZmSBP27基因的植物表达载体；将所述植物表达载体转化到玉米中，将ZmSBP25基因和ZmSBP27基因同时在玉米中进行过表达；

或者(4)：构建含有ZmSBP20基因和ZmSBP27基因的植物表达载体；将所述植物表达载体转化到玉米中，将ZmSBP20基因和ZmSBP26基因同时在玉米中进行过表达；

或者(5)：构建含有ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因的植物表达载体；将所述植物表达载体转化到玉米中，将ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因同时在玉米中进行过表达。

将ZmSBP20基因，ZmSBP25基因或/和ZmSBP27基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在玉米中表达该基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化玉米，使ZmSBP20基因，ZmSBP25基因或/和ZmSBP27基因在玉米植物中进行过表达。

本发明整体技术方案的详述

本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术对玉米中的三个同源基因ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因分别设计两个靶点进行了基因编辑，靶位点序列由图1所示，使ZmSBP20基因有大片段(616个碱基)的删除，ZmSBP25基因有大片段(179个碱基)的删除，ZmSBP27基因有碱基插入和缺失，导致移码突变。得到了基因编辑后序列如图2所示。表型调查显示，Zmsbp20 Zmsbp25 Zmsbp27三突变体植株的冠根或气生根层数增加，表明敲除ZmSBP20，ZmSBP25和ZmSBP27基因后，可使玉米植株产生的更多的冠根或气生根，对玉米冠根或气生根层数的遗传改良提供了理论依据，能够应用于选育抗倒伏的玉米新品种。因此，应用本发明方法可以调控玉米的冠根或气生根的发育或者培育得到抗倒伏的玉米新品种。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

附图说明

图1为ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因的序列比对；灰色显示每个基因的CRISPR/Cas9的靶位点，PAM序列(NGG)为红色显示。

图2为ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27转基因突变体植株的基因型鉴定，PCR产物测序后与野生型的序列进行比对。

图3为Zmsbp20/25/27三突变体植株的冠根或气生根层数增加的表型。

图4为玉米Zmsbp20/25/27三突变体种子萌发后9天冠根的差异。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 ZmSBP20基因、ZmSBP25基因和ZmSBP27基因的CRISPR/Cas9敲除载体的构建

利用SnapGene Viewer软件及同源序列比对设计和筛选各个ZmSBP基因特异的靶标序列(设计sgRNA)，为了保证基因编辑效率，每个基因选取两个最优的靶标序列：

ZmSBP20(GRMZM2G065451，Zm00001d053890)的CRISPR/Cas9靶标序为GAACAAGAACAAGAACAACA，TTCGGCTCATCGAGGCTGTC；

ZmSBP25(GRMZM2G414805，Zm00001d014698)的CRISPR/Cas9靶标序为TCTGTCTCAAATGCAGTTAC，GAGAGGCATGTTAAGAACAC；

ZmSBP27(GRMZM2G097275，Zm00001d015233)的CRISPR/Cas9靶标序为CCTGCTTCTCCGAAGAAGAC，TGGATTAGCTGAGTTTGACC；

之后将这些靶标序列引入到sgRNA表达盒中。

靶位点序列由图1所示，使ZmSBP20基因有大片段(616个碱基)的删除，ZmSBP25基因有大片段(179个碱基)的删除，ZmSBP27基因有碱基插入和缺失，导致移码突变。

同时，将人类中的hSpCas9序列用商业化的PCR CloningKit试剂盒克隆到pCPB载体中，构建成为pCPB-ZmUbi:hSpCas9载体。接着，将两个sgRNA表达盒通过HD Cloning Kit试剂盒插入到pCPB-ZmUbi:hSpCas9的HindIII酶切位点间，最终构建成的CRISPR/Cas9基因编辑载体经过PCR测序验证无误后用于后续的遗传转化。

实施例2所构建的CRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的方法转化玉米自交系C01及转基因植株的表型分析

将实施例1所构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体通过农杆菌介导的方法转化玉米自交系C01；玉米的遗传转化委托中国种子遗传转化平台(中种遗传转化平台)完成。

图2为ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因突变体植株的基因型鉴定，PCR产物测序后与野生型的序列进行比对结果。

图3为Zmsbp20/2/27三突变体植株的冠根或气生根层数增加的表型。

图4为玉米Zmsbp20/2/27三突变体种子萌发后9天冠根的差异。转基因植株的表型调查显示，Zmsbp20 Zmsbp25 Zmsbp27三突变体植株的冠根或气生根层数增加，表明敲除ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因后，可使玉米植株产生的更多的冠根或气生根。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> ZmSPL基因在调控玉米冠根或气生根发育中的应用

<130> GD-2001-190728A

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 780

<212> DNA

<213> Zea mays L

<400> 1

atgggctcgt ttgggatgga catggactgg aaccagaagg cctccgtgct gctgtgggac 60

tgggagaacc tgccgcccgc agccgcaaac gggagcgaga gccacaggac gaccgctgcc 120

gcgcctcagt tcgcgggcct tgaggccaca gggcatgaac cggcgccttc ttccgtatcc 180

tcgtcaatcc attctctgcc cagtgccaag gggaacaaga acaagaacaa catggagctc 240

atcagtttcg cacctgccaa agcgcccgac aaggacactg gttcggtgct cagcagcgga 300

gagccggtgg tgctaggcct gaagcttggc aagagaacgt atttcgaaga tggttgtgga 360

ctagggcaga gcggcaagag ttcggcggcg ttaggcactg ccagtgcagc gacccctccg 420

ggtcctgcga agaaggcgaa ggcggcggcg gcggctccaa ccgcgcagca gcagaaatcg 480

tactgccagg ttgaaggctg caggaccgat ctgtcctctg ctaaagacta tcatcgcaag 540

cacagagtct gcgagcccca ttccaaggcg cccaaggtgg tcgtcgctgg cctggagcgg 600

cgcttctgcc agcagtgcag ccggttccat ggactggccg agttcgacca gaagaagaag 660

agctgccgca ggcgactcaa cgaccacaac gcgcgcaggc ggaagcccca gcccgaagcg 720

ctccctttcg gctcatcgag gctgtcggcg atgttctatg gtactagtga taagcattga 780

<210> 2

<211> 1320

<212> DNA

<213> Zea mays L

<400> 2

atgggttctt ttgggatgaa ctggaatcag aaggacccca tggtgtggga ttgggaacat 60

ctagtaccgt ctgtctcaaa tgcagttaca aggcacggat ctgctaattc atctggtggt 120

actcttactt ctaactcaga gctagggcat ggttcatcca agagctctat ttcagcgtcc 180

attgattcac cctctggagt agggaacagc ttagagttca acttcgccgc tgttgagagg 240

catgttaaga acacgggcac gaacggcaga gtcgatgact cggggaattc tccatcgtca 300

atgatagctt tcaaccaagg agagccatta atcagcctga aacttgggaa gagggcttac 360

ttcgaaaacg cctgcggagg acaggatgcc aaggtttctg cagcttcaga cgttacttct 420

gcagccagcg tggtcaagaa gactaaggtg tctcagcaga atgcaaagaa ctggtactgt 480

caggttgaag ggtgcaaagt tgacctgtct tctgctaaag attacaatcg caagcacaag 540

gtctgtgtag tccattctaa agctaccaag gtggttgttg ctggtctaga gcgtcggttt 600

tgtcaacagt gtagccgttt tcatggttta gcggagtttg atcagaacaa acgaagctgt 660

cgtaggcgtc tgatgcatca taatgcacgg aggaggaaac ctcaggcaga cacaatttca 720

ttcaattcat cgacaatgtt ttatgataca aggcagcgga caaatctttt ctttagtcaa 780

ccactttatg gccaagtgag gagcaatgca gggtcttcat gggataactt gggaggctta 840

aaattcatgg agacgaaaca tccgccagtg catccaacaa aaacagcatc ccctgatgaa 900

ctgcatttct cagccctcca gataactagt gctgcggctc acaccggaca tcatcatgat 960

ctcgatgggt tcatggcgtt caagggaacc agcacaaagg tccttaacca aggcgtggag 1020

gcttgggcgg ccgcttccag ctcgaacaac ggaggcccag aaggtgggcg tgctctctct 1080

cttctgtcag acggctcgtg gggctcgagt tcagccgtca tccagcagcc cacatctcac 1140

gcggacgccg gtgcattgct gccgcccctc gccaccgttg ccgtctccaa cgccgccgcc 1200

gccgccgggc atcctctgga cccgtccccg ggaaggttct ggccgcaaga cgatcatccc 1260

ccgctcgtcg acggacccgc cacgcagatt ccggagctgg cgcacctccg gatatggtga 1320

<210> 3

<211> 1332

<212> DNA

<213> Zea mays L

<400> 3

atgggctcct ttgggatgga ctggaaccag aaggcctccg tgttgtggga ctgggagaac 60

ttgccgcccg tagccgtagg cgcgagcggg agcgagaacc ccaggatggc tgctgcgcct 120

caggctttgc attctgcctg tggcaccatc tcttccagct cagagatggg gtatggctca 180

tccaagagct ccgtatccgc gtcggctgat gattcttcac ccaaggccaa ggggaaaagc 240

atggagctca acttcgcacc tgacaaagtg cctgacaaga acactgattc agggaaggtt 300

gacgacgcca ggacctctcc gtcgtcgccg gtgattgcca tcagcagtgc agagcccgtg 360

cttagcctga agcttggcaa gagaacgtat ttcgaagatg tctgtggagg gcagagcgtc 420

aagagtttgc cgtcggatac gagtgcagtg actcctcctc ctgcttctcc gaagaagacg 480

aaggtgactc caaacaagaa atcttactgt caggttgaag gctgcaaggt tgatctctct 540

tctgctaaag agtaccatcg gaagcacaga gtctgtgaac ctcattctaa ggctcccaag 600

gtggttgttg ctggtctgga gcggcgcttt tgtcaacagt gtagccggtt ccatggatta 660

gctgagtttg accagaagaa gaaaagctgc cgcaggcgcc tcaatgatca caatgcccgc 720

agacggaaac cacaacctga agcactttct tttgggtcat caaggctgtc ggcaatgttc 780

tatgagacaa aaggtccctg gttaagagct ggtggtgttg atgggttgca tcaaccaagt 840

cagcaggtgt ggaacaactt tatgccacat ggtgtccatc aagattttga tgggttcaca 900

gctttcaaag gaaccaatgc aaaggtcctt catcaaggcg ttgaagcttc tgcggtcgcc 960

tccaaccaga acggcgcccc acaaccggac cttcatcgtg ctctctctct tctgtcaaac 1020

agctgggctg gtggtggtac cggtaccggt accgaccagc acccgacggc ccagctgcgc 1080

cacgctgccc tgagcagcag cctcgccgcc agctccgtct ccgtggcgca ggcctcgcca 1140

gcagggctgt ggcaggacgg cggcgcggcc ctgggccacc acgactacgc ccacgcgttc 1200

caggctatca acacgccggg cggcggcggc gccgccgctc ccattgcagt gggtcaggag 1260

ctgcttcagc tcccgcgtcc gccgtccctg tacgacgacg gctcctcgtc ccgctacgac 1320

ctgatgcgct ga 1332

Claims (3)

1.敲除ZmSPL基因在促进玉米幼苗冠根发育或增加成熟玉米植株的气生根层数或数量中的应用；所述的ZmSPL基因由ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因组成；所述ZmSBP20基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述ZmSBP25基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示，所述ZmSBP27基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；

ZmSBP20基因的靶标序列为：

GAACAAGAACAAGAACAACA和 TTCGGCTCATCGAGGCTGTC；

ZmSBP25基因的靶标序列为：

TCTGTCTCAAATGCAGTTAC和GAGAGGCATGTTAAGAACAC；

ZmSBP27基因的靶标序列为：

CCTGCTTCTCCGAAGAAGAC和TGGATTAGCTGAGTTTGACC。

2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：构建ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因的基因敲除载体；将所构建的基因敲除载体转化到玉米植物中，将玉米中的ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因同时进行敲除。

3.一种培育抗倒伏的玉米新品种的方法，其特征在于，包括：构建ZmSBP20基因， ZmSBP25基因和ZmSBP27基因的基因敲除载体；将所构建的基因敲除载体转化到玉米植物中，将玉米中的ZmSBP20基因，ZmSBP25基因和ZmSBP27基因同时进行敲除；所述ZmSBP20基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述ZmSBP25基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，所述ZmSBP27基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；

ZmSBP20基因的靶标序列为：

GAACAAGAACAAGAACAACA和 TTCGGCTCATCGAGGCTGTC；

ZmSBP25基因的靶标序列为：

TCTGTCTCAAATGCAGTTAC和GAGAGGCATGTTAAGAACAC；

ZmSBP27基因的靶标序列为：

CCTGCTTCTCCGAAGAAGAC和TGGATTAGCTGAGTTTGACC。