KR100464677B1

KR100464677B1 - 활성 표지를 위한 인핸서 및 유전자 포획을 위한 리포터유전자를 포함하는 ｔ-ｄｎａ 표지 벡터로 단자엽 식물의형질전환체를 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된형질전환체

Info

Publication number: KR100464677B1
Application number: KR10-2002-0064822A
Authority: KR
Inventors: 안진흥; 정동훈; 강홍규; 안수영; 안경숙; 문선옥
Original assignee: 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2002-10-23
Publication date: 2005-01-03
Also published as: KR20040036041A

Abstract

본 발명은 활성 표지(activation tagging) 및 유전자 포획(gene trapping)을 동시에 수행하는 T-DNA 표지 벡터로 단자엽 식물의 형질전환체를 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된 단자엽 식물의 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명의 T-DNA 표지 벡터는 유전자 주변에 삽입될 경우에는 그 유전자의 활성화에 의해 유전자 기능을 분석할 수 있으며, T-DNA가 유전자 내에 삽입될 경우에는 유전자 포획(gene trapping)을 통해 삽입된 유전자의 발현 양상을 조사할 수 있어 다양한 식물 유전자의 기능 분석 및 새로운 품종 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

활성 표지를 위한 인핸서 및 유전자 포획을 위한 리포터 유전자를 포함하는 Ｔ-ＤＮＡ 표지 벡터로 단자엽 식물의 형질전환체를 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된 형질전환체{THE METHOD FOR PREPARING TRANSFORMED MONOCOTYLEDON WITH T-DNA TAGGING VECTOR COMPRISING AN ENHACNER ELEMENT FOR ACTIVATION TAGGING AND A REPORTER GENE FOR GENE TRAPPING AND THE TRANSFORMANTS PREPARED BY THIS METHOD}

본 발명은 활성 표지(activation tagging)를 위한 인핸서 및 유전자 포획(gene trapping)을 위한 리포터 유전자를 포함하는 T-DNA 표지 벡터로 단자엽 식물의 형질전환체를 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된 형질전환체에 관한 것이다.

특정 유전자의 기능을 규명하기 위해서, 목적하는 유전자의 기능을 제거한 기능손실 돌연변이체(loss of function mutant)를 이용한 유전학적 및 분자생물학적 방법이 널리 사용되고 있다. 이 방법은 어떤 유전자의 기능을 손상시킨 후에 유발되는 돌연변이 표현형이 그 유전자의 기능을 추정하는 데 가장 직접적인 증거를 제공하기 때문에 널리 이용하고 있다. 그러나, 식물은 기능손실 돌연변이체를 제조하기 위한 방법으로 상동 재조합(homologous recombinant)을 이용할 경우 효율이 매우 낮기 때문에 EMS(ethyl methanesulfonate)와 같은 화학물질을 이용하는 화학적인 방법, 감마선 조사와 같은 물리학적인 방법 또는 T-DNA나 트랜스포존(transposon)과 같은 생물학적인 방법 등이 이용되고 있다. 하지만, 상기와 같은 방법으로 기능손실 돌연변이체를 제조하여 특정 유전자의 기능을 연구하는데 있어서 여러 가지 장점에도 불구하고 목적하는 유전자의 기능과 동일한 기능을 갖는 다른 유전자가 존재하는 경우에는 돌연변이 형질이 검출되지 않는 문제점이 있다. 또한, 어떤 유전자의 경우에는 식물의 발달 초기에 발현되어 이 유전자의 기능손실 돌연변이체가 일찍 죽게 되는 경우에는 돌연변이체를 얻지 못하게 된다. 이러한 이유로 기존의 기능손실 돌연변이체를 이용한 방법은 그 막강한 장점에도 불구하고 식물에서는 제한적으로 사용되고 있다.

이러한 한계를 극복하기 위하여, T-DNA 표지를 이용한 기능손실 돌연변이 연구에 유전자 포획 방법을 사용하고 있다. 유전자 포획 방법은 T-DNA 내부에 GUS(β-글루큐로니다제, β-glucuronidase) 또는 GFP(녹색 형광 단백질, green fluorescence protein)와 같은 리포터 유전자를 이용하여 T-DNA가 삽입된 유전자의 발현을 추적할 수 있는 방법이다(Jeon J.S. et al.,Plant J., 22, 561-570, (2000) 및 Krysan P.J. et al.,Plant cell,11, 2283-2290, (1999)). T-DNA가 내부에 삽입된 유전자의 프로모터 발현 조절에 의해 특정 시기와 장소에서 상기 유전자와 리포터 유전자의 결합 단백질이 활성화된다. 이 때, 리포터 유전자의 활성화를 추적하면 T-DNA가 삽입된 유전자의 발현 양상을 유추할 수 있다. 이러한 유전자 포획 방법을 이용함으로써 T-DNA가 유전자의 내부에 삽입된 형질전환체를 쉽게 선별할 수 있으며, 발현 양상을 통한 돌연변이의 관찰이 용이하다. 또한, 기능이 중복되어 돌연변이 표현형이 나타나지 않는 유전자들도 이러한 발현 양상 연구를 통해 부분적인 연구가 가능하며, 발달 초기에 중요하게 관여하는 유전자들도 동형 접합체는 일찍 죽을 수 있지만, 이형 접합체에 유전자 발현 양상 연구를 적용하면 상기 유전자의 기능 유추가 가능하다.

그러나, 기존의 유전자 포획 기술은 이러한 여러 가지 장점에도 불구하고 효율이 매우 낮다는 문제점이 있었다. 유전자 포획 효율은 T-DNA가 유전자의 내부에 삽입될 확률과, T-DNA가 가지고 있는 리포터 유전자의 방향이 삽입된 유전자의 방향과 같을 확률의 곱에 의해 결정된다. 또한, T-DNA가 유전자의 인트론에 삽입되거나, 엑손에 삽입되더라도 리포터 유전자와 결합되지 않는 구조로 삽입되면 효율이 떨어지게 된다. 이러한 문제를 해결하는 방법의 하나로 리포터 유전자의 앞에 다중 스플라이싱 공여체/수용체(multiple splicing donor/acceptor)를 삽입하여 T-DNA가 유전자의 엑손과 인트론에 상관없이 리포터 유전자가 삽입되면 유전자 포획을 할 수 있는 방법이 사용되고 있다(Sundaresan V. et al.,Genes Dev.,9, 1797-1810, (1995)).

한편, 최근에는 기능손실 돌연변이체를 이용한 방법의 대안으로 기능획득 돌연변이체를 이용한 방법이 널리 사용되고 있다. 기능획득 돌연변이체를 얻기 위한 활성 표지 방법은 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터의 인핸서 서열이 비교적 멀리 떨어져 있는 상태에서도 주변 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다는 사실을 이용하고 있다. 모델 식물로 사용되고 있는 애기장대는 이 35S 인핸서를 이용한 연구를 통해 다양한 기능획득 돌연변이체를 얻고 있다. 이러한 연구의 일환으로, 식물 호르몬인 옥신(auxin)에 비의존적으로 성장하는 돌연변이체와 조직배양 시 시토키닌에 비의존적으로 성장하는 돌연변이체를 분리한 보고가 있었다(Zhao Y. et al.,Science,291, 306-309, (2001)). 또한, 최근에는 개화시기를 조절하는 유전자들과 특정 신호전달과정의 하위에서 신호전달을 억제하는 기능을 하는 유전자들의 기능이 다양하게 밝혀지고 있다(Lee H. et al.,Genes Dev.,14, 2366-2376, (2000) 및 Li J. et al.,Cell,110, 213-222, (2002)). 그러나, 벼를 포함한 단자엽 식물에서는 활성 표지를 이용한 대량의 돌연변이체 생산이 아직 이루어지지 않고 있다.

이에 본 발명자들은 벼를 포함한 단자엽 식물에서 유전자 포획을 통한 유전자 발현 관찰과 기능손실 돌연변이체의 획득뿐만 아니라 최초로 대량의 기능획득 돌연변이체를 얻을 수 있는 형질전환용 벡터를 개발하여 이 벡터로 단자엽 식물의 형질전환체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 활성 표지로 유전자 포획의 효율을 높인 단자엽 식물의 형질전환체를 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된 단자엽 식물의 형질전환체를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 T-DNA 표지 벡터인 pGA2715와 대조구 벡터 pGA2707의 유전자 지도(gene map)를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 T-DNA 표지 벡터인 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단에서 분리한 우성 유전 돌연변이체들을 나타낸 것이고,

A: 1B22327 (반점) B: 1B05327 (권엽)

C: 1B05817 (세엽) D: 1B06319 (반점)

E: 1B06616 (녹변엽) F: 1B22328 (왜성)

G: 1B23229 (반점) H: 2715-M2 (왜성)

도 3은 본 발명의 T-DNA 표지 벡터인 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단 중 성숙한 종자 및 유묘에서 GUS 리포터 유전자가 발현되는 식물체를 나타낸 것이고,

A, B 및 C: 성숙한 종자 D 및 E: 뿌리

F, G 및 H: 유묘 지상부

도 4는 본 발명의 T-DNA 표지 벡터인 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단 중 꽃에서 GUS 리포터 유전자가 발현되는 식물체를 나타낸 것이고,

A: 꽃가루 B: 수술 자루

C: 외영 D: 암술

도 5는 본 발명의 T-DNA 표지 벡터인 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단 중 35S 인핸서에 의해 RNA 발현이 증가된 1B-00107 라인을 나타낸 것으로, A는 T-DNA의 삽입 위치를 도식화한 것이고; B는 후세대에서 PCR을 이용하여 삽입된 T-DNA의 유전자형을 조사한 것이고; C는 인접 유전자의 발현량을 RT-PCR로 조사한 결과이고,

도 6은 본 발명의 T-DNA 표지 벡터인 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집합 중 35S 인핸서에 의해 RNA 발현이 증가된 1B-00224 라인을 나타낸 것으로, A는 T-DNA의 삽입 위치를 도식화한 것이고; B는 후세대에서 PCR을 이용하여 삽입된 T-DNA의 유전자형을 조사한 것이고; C는 인접 유전자의 발현량을 RT-PCR로 조사한 결과이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 1) 활성 표지를 위한 인핸서 및 유전자 포획을 위한 리포터 유전자를 포함하는 T-DNA 표지 벡터를 제조하는 단계; 2) 단계 1)에서 제조된 T-DNA 표지 벡터로 형질전환된 미생물과 단자엽 식물의 캘러스를 공배양하는 단계를 포함하는 단자엽 식물의 형질전환체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 목적에 따라 본 발명은 상기 방법으로 제조된 단자엽 식물의 형질전환체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서의 활성 표지를 위한 인핸서는 T-DNA가 삽입된 인접 유전자의 발현량을 증가시킴과 동시에 유전자의 포획의 효율을 증가시키는 유전자를 의미한다.

본 발명의 상기 단자엽 식물의 형질전환체를 제조하는 방법의 단계 1)에서 제조되는 T-DNA 표지 벡터는 효율적인 유전자 포획을 위한 벡터로서, 벡터 내의 T-DNA가 식물체 염색체 상의 유전자 내에 삽입되면 그 유전자에 삽입 돌연변이가 유도됨과 동시에 그 유전자가 리포터 유전자와 연결되어 리포트 유전자의 발현의 분석을 통해 T-DNA가 삽입된 유전자 발현 양상을 조사할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 T-DNA 표지 벡터는 T-DNA의 왼쪽에는 활성 표지를 위한 인핸서가 삽입되고 오른쪽에는 유전자 포획을 위한 리포터 유전자가 삽입된다. 본 발명의 T-DNA 표지 벡터에 사용되는 활성 표지를 위한 인핸서로 모든 조직에서 강하게 유도되거나, 조직 특이적 또는 환경 특이적으로 유도되는 프로모터 자체 또는 이들의 인핸서 등이 사용될 수 있으며, 35S 인핸서가 바람직하다. 35S 인핸서는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터로부터 유래된 것으로, 식물의 염색체에 삽입되었을 때 인접한 유전자의 발현을 증가시킨다. 활성 표지를 위한 인핸서는 동일한 방법으로 1개 이상 포함될 수 있는데, 4개 미만일 때에도 그 활성을 나타내지만 그 정도가 미약하며 4개 이상 사용하는 경우에는 증가된 개수에 비해 발현량 증가에 큰 기여를 하지 못하기 때문에, 4개를 포함시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 T-DNA 표지 벡터에 사용되는 리포터 유전자로는 GUS 유전자, GFP 유전자, 루시퍼라제(Luciferase) 등의 유전자가 사용될 수 있다. GUS 단백질은 X-gluc를 기질로 사용하여 푸른색의 발색반응을 나타내며, GFP 단백질은 자외선을 받아 형광 반응을 나타낸다. GUS 리포터 유전자는 GFP 리포터 유전자에 비해 안정적이고 높은 효율을 나타내며, 특히 식물 자체에서 활성되는 배경효과가 낮아 재현성이 높으므로, 본 발명의 리포터 유전자로는 GUS 유전자가 바람직하다.

본 발명의 T-DNA 표지 벡터는 리포터 유전자 앞에 벼의 α-튜블린(α-tublin) 유전자(Jeon JS. et al.,Plant Physiol.,123, 1005-1014, (2000) 및 genebank accession number AF182523)의 두 번째 인트론을 변형한 다중 스플라이싱 공여체/수용체를 더 포함할 수 있다. 다중 스플라이싱 공여체/수용체는 3가지 reading frame이 가능하도록 각각 3가지의 스플라이싱 공여체 및 수용체를 갖도록 제조한다. 본 발명에서는 OsTubA1 유전자를 주형으로 하고, 벼의 α-튜블린 유전자의 두 번째 인트론의 양 말단 및 변형 올리고머를 포함하는 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통해 다중 스플라이싱 공여체/수용체를 제조한다(Sundaresan V. et al.,Genes Dev.,9, 1797-1810, (1995)).

또한 본 발명의 T-DNA 표지 벡터는 상기 벡터로 형질전환된 미생물 및 T-DNA가 게놈 내로 삽입된 형질전환 식물체를 선별하기 위한 선별 마커를 더 포함 할 수 있다. 선별 마커로는 하이그로마이신 저항성(hph) 유전자, 카나마이신 저항성(nptII) 유전자 또는 제초제 저항성(bar) 유전자가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 하이그로마이신 저항성 유전자가 사용된다.

본 발명에서는 도 1에 나타낸 유전자 지도를 갖는 T-DNA 표지 벡터 pGA2715를 사용할 수 있다. I는 유전자 포획 효율을 높이기 위해 사용한 다중 스플라이싱 공여체/수용체이고, GUS는 유전자 포획을 위해 사용한 β-글루큐로니다제 리포터 유전자를 나타낸다. hph는 형질전환 식물체 선별을 위해 사용한 하이그로마이신 항생제 선별 마커 유전자이며, 이 유전자의 발현은 벼의 α-튜블린 유전자의 프로모터(tub promoter)와 첫 번째 인트론(tub 1st intron)에 의해 강하게 유도되며 Tnos와 Ttub는 각각 노팔린 합성효소(nopaline synthase)와 α-튜블린 유전자의 종결인자(terminator)이다. RB와 LB는 각각 T-DNA의 오른쪽과 왼쪽 끝을 의미하며, 4×35S EN은 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터에서 유래한 인핸서를 4개 연속 붙여놓은 것을 나타낸다. 제한효소 인식부위는 벡터의 위에 표시하였고 이중 T-DNA 내에 하나만 존재하는 제한효소 인식부위는 * 표시를 하였다. 화살표는 전사방향을 나타낸다.

상기 표지 벡터 pGA2715는 기존에 따로 사용되던 유전자 포획과 활성 표지를 동시에 수행할 수 있다.

본 발명의 단자엽 식물의 형질전환체를 제조하는 방법 중 단계 2)는 아래와 같이 수행된다.

본 발명의 T-DNA 표지 벡터를 통상적인 식물 형질전환 방법에 따라 단자엽 식물, 바람직하게는 벼의 배반(scutellum)에서 유래한 캘러스에 도입하고 이로부터 뿌리와 잎의 분화를 유도한 후 화분으로 옮겨 재배함으로써 형질전환된 단자엽 식물, 바람직하게는 벼를 얻을 수 있다.

구체적으로, 단자엽 식물의 형질전환 방법으로 아그로박테리움 매개 형질전환법, 입자사출방법 등을 이용할 수 있으며, 아그로박테리움 매개 형질전환법이 바람직하다. 대표적인 예로 아그로박테리움 매개 형질전환법에 의하면, 상기 T-DNA 표지 벡터를 동결-해동법(An, G. et al.,Plant Molecular Biology ManualA3/1-A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998)에 따라 Ti 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움에 전이시킨 후 적절한 항생제가 포함된 배지에서 배양한 후 캘러스와 함께 베타인(betain)이 포함된 배지에서 25℃ 암조건 하에서 2 내지 3일 동안 공배양한다. 공배양된 캘러스를 세포탁심(cefotaxime)이 포함된 멸균수로 세척한 후, 적절한 항생제 및 세포탁심이 포함된 배지 상에서 다시 3 내지 4주 동안 배양하여 성장이 좋은 캘러스를 얻는다. 이 캘러스를 적절한 항생제 및 세포탁심을 포함하는 선발 배지에 옮기고, 30 내지 60μmol/㎡/초, 바람직하게는 40μmol/㎡/초의 연속적인 광조건 하에 2 내지 3주 동안 배양하여 묘목을 얻는다. 이 묘목을 화분에 심은 후 생장 챔버에서 10 L/14 D 조건 하에서 재배하여 형질전환된 식물체를 얻는다. 바람직하게는 염색체 기원 Ach5가 제거된 헬퍼-Ti 플라스미드 pAL4404를 갖는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumaefaciens) LBA4404 균주가 아그로박테리움 매개 공배양법에 의한 형질전환에 사용된다. 예를 들어, pGA2715로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(수탁번호 : KCTC 10340BP)가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 단엽식물 형질전환체를 제공하며, 특히 벼 형질전환체를 제공한다.

따라서, 본 발명의 표지 벡터 pGFA2715는 벼를 포함한 다양한 단자엽 식물의 유전자 기능 분석 및 새로운 품종 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<비교예> 유전자 포획을 위한 T-DNA 표지 벡터 pGA2707의 제작

벡터 pGA2707은 벡터 pGA2144 (Jeon J.S. et al.,Plant J.,22, 561-570, (2000))를 변형시킨 것으로서, 다중 스플라이싱 공여체/수용체는 OsTubA1 유전자를 주형으로 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 증폭시켰고, 하이그로마이신 저항성 유전자의 종결인자(terminator)는 OsTubA1 유전자의 종결인자(terminator)를 사용하였고, 하이그로마이신 저항성 유전자의 방향이 pGA2144와 반대방향으로 삽입하였다.

벡터 pGA2707은 벡터의 T-DNA가 식물체 염색체 상의 유전자 내에 삽입되면 그 유전자에 삽입 돌연변이가 유도됨과 동시에, 유전자가 GUS 리포터 유전자와 연결되어 GUS 분석을 통한 유전자 발현 양상의 조사가 가능하다는 특징을 갖는다.

구체적으로, 상기 벡터는 벼의 유전자 포획 효율을 높이기 위하여 α-튜블린(α-tublin) 유전자의 두 번째 인트론을 변형한 다중 스플라이싱 공여체/수용체를 유전자 포획을 위해 사용된 GUS 리포터 유전자 앞에 삽입하여 T-DNA가 유전자의 인트론 또는 엑손의 어느 곳에 들어가더라도 삽입된 유전자와 결합된 GUS 단백질이 발현되도록 고안되었다. 형질전환된 식물체 선별을 위한 항생제 선별 마커로 하이그로마이신 저항성(hph) 유전자를 사용하였고, 이 유전자의 발현은 벼에서 35S 인핸서보다 더 강력하게 작용하는 α-튜블린 유전자의 프로모터(tub promoter)와 이 유전자의 첫 번째 인트론(tub 1st intron)에 의해 강하게 유도되도록 하였다. 또한, 상기 벡터는 각각 노팔린 합성효소(nopaline synthase)와 α-튜블린 유전자의 터미네이터에서 유래된 종결인자 Tnos와 Ttub를 포함한다(도 1).

<실시예 1> 활성표지 기능을 수행하는 유전자 표획을 위한 T-DNA 표지 벡터 pGA2715의 제작

비교예에서 제작된 pGA2707 벡터의 기능에 활성 표지 기능을 추가하기 위하여, T-DNA의 왼쪽 끝 부위 XhoI 제한효소 인식부위에 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터로부터 유래된 35S 인핸서(Weigel et al.,Plant Physiol.,122, 1003-1013, (2000))를 4개 연속하여 삽입하였다(도 1). 35S 인핸서는 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 pSKI15(Weigel et al.,Plant Physiol.,122, 1003-1013, (2000))를 주형으로 하는 PCR 반응으로 증폭하였다. PCR 반응은 1unit의 Thermus aquaticus DNA 중합효소(Takara사), 10mM dNTPs, 0.2 μM의 프라이머, 5㎕의 10X 반응 완충용액을 넣어 전체 부피 50㎕에서 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 1분, 62℃에서 1분, 72℃에서 1분을 1 주기(cycle)로 35주기를 수행하였다. 증폭된 DNA 단편을 pUC19의 SspI 제한 효소 인식부위에 StuI, XhoI, KpnI linker를 부착시킨 pGA617의 BamHI, EcoRI 제한 효소 인식부위에 클로닝하여 이를 pGA2702라 명명하였다. 최종적으로 pGA2715는 pGA2707의 XhoI 제한효소 인식부위에 pGA2702의 XhoI과 SalI 단편을 삽입함으로써 만들어졌다.

상기와 같이 제작된 본 발명의 표지 벡터 pGA2715의 T-DNA 내부 염기서열의 정보를 하기 표 1에 나타내었다.

시작	끝	방향	염기서열 정보
1	31	정방향	오른쪽 말단
32	166	정방향	스플라이싱 공여체/수용체
167	2051	정방향	GUS 리포터 유전자
2052	2329	정방향	노팔린 합성효소 유전자의 종결인자
2330	2971	역방향	α-튜블린 유전자의 종결인자
2972	4034	역방향	하이그로마이신 저항성 유전자
4035	4987	역방향	α-튜블린 유전자의 첫 번째 인트론
4988	6154	역방향	α-튜블린 유전자의 프로모터
6155	6784	정방향	pUC18의 단편 일부
6785	6785	역방향	꽃양배추 모자이크 바이러스 유래 35S 인핸서
8195	8275	정방향	왼쪽 말단

<실시예 2> pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단의 제작

본 발명의 표지 벡터 pGA2715를 이용하여 유전자 포획과 활성 표지를 동시에 수행할 수 있는 벼 식물체 집단을 하기와 같이 제작하였다.

구체적으로, 상기 표지 벡터 pGA2715 및 대조군 벡터 pGA2707을 동결-해동법(An, G. et al.,Plant Molecular Biology Manual A3/1-A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, (1998))에 따라 헬퍼-Ti 플라스미드를 함유하는 LBA4404 아그로박테리움 튜마파시엔스에 각각 전이시킨 후, 12.5㎍/ℓ의 하이그로마이신 항생제가 포함된 AB 액체 배지(Chilton, M. D.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,71, 3672-3676, (1974))에서 배양하여 각각의 벡터로 형질전환된 아그로박테리움을 선별하였다. 이로부터 선별된 본 발명의 표지 벡터 pGA2715가 형질전환된 아그로박테리움 튜마파시엔스 LBA4404를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2002년 9월 23일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10340BP).

벼의 배반(scutellum)으로부터 캘러스를 유도하는데, 이는 성숙된 벼 종자를70% 에탄올에 5분, 50% 락스 용액에 1시간 동안 소독한 후, 20일 동안 암조건 및 28℃ 하에서 2㎎/ℓ의 2,4-D를 포함하는 N6 배지에서 배양함으로써 유도하였다. 상기에서 형질전환된 아그로박테리움을 유도된 캘러스와 함께 1mM 베타인(betain)이 포함된 2N6-As 배지(Hiei, Y. et al.,Plant J.,6, 271-282, (1994))에 접종하여 2일 동안 암조건 및 20℃하에서 공배양하였다. 공배양된 캘러스를 250mg/ℓ의 세포탁심(cefotaxime)이 포함된 멸균수로 세척한 후, 3주 동안 암조건 및 28℃하에서 40mg/ℓ의 하이그로마이신 항생제 및 250mg/ℓ의 세포탁심이 포함된 N6 배지에서 배양하여 성장이 좋은 캘러스를 획득하였다. 상기 캘러스를 0.2㎎/ℓ NAA(naphthalene acetic acid), 2㎎/ℓ 키네틴(kinetin), 2% 솔비톨, 1.6% 피트아가(Gibco), 50㎎/ℓ 하이그로마이신 항생제 및 250㎎/ℓ 세포탁심을 첨가한 MS 배지(Life Technologies사)에 옮기고, 4주 동안 40μmol/㎡/초의 연속적인 광조건하에 배양하여 묘목을 얻었다. 상기 묘목을 화분에 심은 후 생장 챔버에서 10L/14D 조건하에서 재배하여 pGA2707 및 pGA2715 벡터로 형질전환된 독립적인 벼 식물체를 획득하였다.

<실험예 1> pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단의 유묘에서 나타나는 돌연변이 분석

(단계 1) 열성 기능손실 돌연변이의 분리

본 발명에 따라 제작된 pGA2707 및 pGA2715 벡터는 모두 벡터의 T-DNA가 벼 염색체의 유전자에 삽입되면 삽입된 유전자의 기능이 손실되어 이 유전자의 기능손실 돌연변이가 표현형으로 나타나게 된다. 본 발명에서는 pGA2707과 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 중 유묘에서 기능상실 돌연변이 라인을 대량으로 찾기 위해 각각 2,082 라인과 3,190 라인에서 20 내지 40 개체의 다음 세대를 발아시킨 후 유묘 상태에서 표현형 변이를 관찰하였다. T-DNA가 삽입된 형질전환체의 후세대는 야생형, 이형 접합체 및 동형 접합체가 각각 1:2:1의 비율로 분리되며, 열성 기능손실 돌연변이의 경우에는 오직 동형 접합체에서만 T-DNA의 유전자 내 삽입으로 인한 돌연변이 표현형이 나타나므로 야생형과 돌연변이의 표현형 비율이 3:1인 열성 유전으로 나타나게 된다. 따라서, 돌연변이의 비율이 20에서 40%인 경우를 유전자 기능손실에 의한 열성 돌연변이로 간주하였다. pGA2707과 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단의 유묘 단계에서 돌연변이 표현형을 선발하여 하기표 2에 나타내었다.

	pGA2707	pGA2715
돌연변이체 표현형	라인의 수(n)	%	라인의 수(n)	%
색소체 변이알비노황록엽담록엽줄무뉘얼룩무뉘녹변엽	32738878959450	15.71.84.24.32.80.22.4	59144242147102255	18.51.47.64.63.20.11.7
신장 변이왜성장엽	1571534	7.57.30.2	2502446	7.57.60.2
생리적 변이반점병변조기 노화	4221138	2.01.00.60.4	104502232	3.31.60.71.0
잎/줄기 모양 변이기형다엽세엽권엽	103791383	4.93.80.60.40.1	20211845318	6.33.71.41.00.3
총계	629	30.2 (629/2,082)	1,147	36.0 (1,147/3190)

표 2에 나타난 바와 같이, pGA2707과 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단의 유묘에서 각각 629 라인 및 1,147 라인의 돌연변이들을 얻었다. 유묘 단계에서 선발된 돌연변이는 색소, 키, 생리 또는 발달의 변이가 나타났으며 pGA2707과 pGA2715가 형질전환된 벼 식물체 집단에서 각각 30.2%와 36.0%의 비율로 비슷하게 나타났다. 이러한 결과는 pGA2707과 pGA2715의 T-DNA가 벼 염색체의 유전자 내에 삽입되어 기능손실 돌연변이를 유도하는 비율이 비슷함을 의미한다.

(단계 2) 활성 표지에 의한 우성 돌연변이의 분리

유묘 단계의 돌연변이 집단 중에는 야생형과 돌연변이의 표현형 분리비가 1:3에 가깝게 나타나는 우성 유전 돌연변이들도 있었다. 따라서 돌연변이의 비율이 60% 이상인 경우를 우성 돌연변이로 간주하였다. 이들은 동형 접합체 뿐만 아니라 이형 접합체에서도 돌연변이 표현형을 보인 경우이다. pGA2707 및 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단에서 분리된 돌연변이 중 우성 표현형을 보이는 식물체들의 빈도와 이들의 표현형 분리비를 하기 표 3에 나타내었다.

벡터 (빈도)	라인	돌연변이체 표현형	표현형 분리비(정상:돌연변이체)
pGA2707 (0.1%)	1A170251C01134	담록엽황록엽	5:125:13
pGA2715 (0.3%)	1B022371B035271B058171B063191B066161B223281B229341B232292715-M2	반점권엽세엽반점녹변엽왜성조기 노화반점왜성	3:53:54:95:155:122:76:113:143:8

상기 표 3에 나타난 바와 같이, pGA2707 및 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단에서 각각 2개와 9개의 우성 돌연변이들을 얻음으로써 0.1%와 0.3%의 빈도로 우성 돌연변이체를 얻었다.

pGA2707 벡터보다 본 발명의 표지 벡터 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단에서 우성 유전 돌연변이가 높게 나타나는 이유는 pGA2715 벡터의 특성에 기인한 것으로, pGA2715 벡터는 35S 인핸서를 가지고 있어 인접한 유전자의 발현을 유도하게 되는데 그 기작이 동형 접합체 뿐만 아니라 이형 접합체에서도 돌연변이 표현형을 유도할 수 있기 때문이다. 우성 돌연변이 표현형을 보이는 라인은 잎에 반점이 나타나는 라인, 키가 작은 라인, 잎의 색소가 결핍된 라인, 잎이 가는 라인 및 노화가 일어나는 라인 등이 있었다(도 2).

<실험예 2> 유전자 포획에 의해 GUS 리포터 유전자가 발현되는 라인의 선별

본 발명에 따라 제작된 pGA2707과 pGA2715 벡터는 T-DNA가 삽입된 유전자의 발현 양상 정보를 조사할 수 있는 유전자 포획 시스템으로 GUS 리포터 유전자를 사용하였다. 이를 이용하여 pGA2707과 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단의 당대 식물에서는 꽃을, 후대 식물에서는 유묘에서 GUS 리포터 유전자가 활성화된 라인을 선별하였다.

(단계 1) 후대 식물의 유묘에서 GUS 유전자가 발현되는 라인의 선별

pGA2707과 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단, 각각 2,990 라인과 2,842 라인의 후세대들을 각각 5 개체씩 유묘 상태에서 GUS 용액(Jeon J.S. et al.,Plant Physiol., 123, 1005-1014, (2000)에 담그고 37℃에서 반응시켜 GUS 유전자의 발현이 유도되는 라인을 선별하였고, 각각의 유전자 발현 빈도를 하기 표 4에 나타내었다.

기관	pGA2707	pGA2715
기관	라인의 수(n)	%	라인의 수(n)	%
성숙 종자	158	5.3	359	9.3
뿌리	85	2.8	241	6.3
지상부	115	3.8	404	10.5
총계	194	6.5 (194/2,990)	514	13.4 (514/2,842)

그 결과, pGA2707로 형질전환된 라인에서는 194 라인이, pGA2715로 형질전환된 라인에서는 514 라인이 GUS 발현을 보여 각각 6.5%와 13.4%의 효율을 보였다. 이는 pGA2715 라인이 pGA2707 라인에 비해 2.1배의 높은 효율로 GUS 리포터 유전자가 발현되는 것으로, pGA2715 벡터가 가지고 있는 35S 인핸서에 의한 결과로 판단된다. 즉, 35S 인핸서가 인접 유전자의 발현을 증가시켜 GUS 리포터 유전자의 발현량을 증가시킴으로써 GUS 발현이 약한 라인들까지 검출된 것이다. 도 3은 본 발명의 표지 벡터 pGA2715가 형질전환된 벼 식물체 집단 중 성숙한 종자나 유묘 단계에서 유전자 포획에 의해 GUS 리포터 유전자가 발현되는 예를 나타낸 것으로, A, B 및 C는 성숙한 종자에서 특이적으로 GUS가 발현되는 라인들이고, D 및 E는 뿌리에서 특이적으로 발현되는 라인들이고, F, G 및 H는 유묘 지상부에서 특이하게 GUS를 발현하는 라인들이다.

또한, GUS 리포터 유전자의 발현이 유도된 라인들의 기관별 발현 양상을 비교한 결과, pGA2707과 pGA2715 라인에서 큰 차이를 보이지 않았다. 이는 35S 인핸서가 포획된 유전자의 발현을 모든 기관에서 증가시키기보다는 원래 유전자가 발현되는 조직에서만 발현을 증가시키기 때문이다. 이러한 결과는 이미 35S 인핸서를 활성 표지 벡터로 사용한 애기장대에서 35S 인핸서 인접 유전자의 발현이 원래 유전자가 발현되는 조건에서만 증가된다(Weigel et al.,Plant Physiol.,122, 1003-1013, (2000))는 보고와 일치하는 것이다. 따라서, 본 발명의 표지 벡터 pGA2715를 사용함으로써 포획된 유전자의 발현 양상에 변화를 주지 않고 유전자 포획의 효율을 극대화시킬 수 있음을 확인하였다.

(단계 2) 당대 식물의 꽃에서 GUS 유전자가 발현되는 라인의 선별

꽃에서 GUS 리포터 유전자가 발현되는 라인을 선별하기 위하여 pGA2707 및 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단 당대의 꽃에서 각각 11,189 라인과 5,489 라인을 유묘 상태에서와 같은 방법으로 분석하였고, 유전자 포획에 의한 GUS 리포터 유전자의 발현 빈도를 하기 표 5에 나타내었다.

기관	pGA2707	pGA2715
기관	라인의 수(n)	%	라인의 수(n)	%
소수축소지경내외영인피수술암술	225201329226322279	2.01.82.92.02.92.5	186248370117211156	3.44.56.72.13.82.8
총계	526	4.7 (526/11,189)	515	9.4 (515/5,489)

그 결과, pGA2707로 형질전환된 526 라인, pGA2715로 형질전환된 515 라인이GUS 발현을 보여 각각 4.7%와 9.4%의 효율로 GUS가 발현하였다. 즉, GUS 발현 빈도가 pGA2715로 형질전환된 라인이 pGA2707로 형질전환된 라인에 비해 2배 높게 나타으며, 꽃의 각 기관별 발현 빈도에서도 pGA2715 라인이 pGA2707 라인에 비해 두 배 정도 높게 나타났다. 이러한 결과는 유묘에서와 마찬가지로 꽃에서도 pGA2715 벡터가 유전자 포획에 더 효율적임을 증명하는 것이다. 도 4는 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단 중 꽃에서 GUS가 발현되는 라인의 예를 나타낸 것으로, A는 꽃가루에서, B는 수술 자루에서, C는 외영에서, D는 암술에서 GUS가 특이적으로 발현되는 라인들이다.

<실험예 3> 활성 표지에 의한 인접 유전자의 발현량 증가 조사

본 발명의 표지 벡터 pGA2715의 35S 인핸서가 염색체에 삽입되어 인접 유전자의 발현을 증가시키는 것을 확인하기 위해 pGA2715로 형질전환된 라인의 인핸서 주변 유전자의 RNA 발현량을 하기와 같이 측정하였다.

(단계 1) 활성 표지에 의해 인접 유전자의 발현량이 증가되는 라인의 선별

35S 인핸서에 의해 활성 표지된 라인을 찾기 위하여, 본 발명의 표지 벡터 pGA2715로 형질전환된 벼 식물체 집단 중 무작위적으로 100개 라인을 선별하여 T-DNA 주변 염기서열을 해독하였다. T-DNA 주변 염기서열을 분리하기 위해서 역위-PCR 방법을 사용하였다. 구체적으로, 형질전환체 식물의 성숙한 잎에서 게놈 DNA를 분리하고 이를 XhoI 제한효소로 절단한 후 16℃에서 16시간 동안 자가-연결(self-ligation) 시켰다. 자가-연결된 DNA는 T-DNA의 일부와 T-DNA와 인접한 벼 게놈을 일부 포함하게 되므로, T-DNA 부위에서 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하게 되면 T-DNA와 인접한 벼 게놈을 얻을 수 있다. 이와 같이 자가-연결된 DNA를 서열번호 5 및 6로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하였다.

상기 프라이머 쌍을 이용한 역위-PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 얻고 이의 염기서열을 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Applied Biosystems사, Foster City, CA, 미국)를 사용하여 결정하였다. 상기 DNA 단편의 염기서열에서 T-DNA의 왼쪽 끝 부근과 연결된 미확인 염기서열을 파악한 후 BLAST 데이터 검색(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)을 통해 염기서열의 유전자 상동성을 조사하였다. 상동성 조사에서 유전자가 5kb 이내에 가깝게 위치한 라인들 중 1B-00107과 1B-00223, 두 개 라인을 선택하였다. 1B-00107 라인은 벼의 브라시노스테로이드(Brassinosteroid) 호르몬의 수용체로 알려진OsBRⅠ1유전자의 뒤쪽에 T-DNA가 삽입되어 35S 인핸서로부터 유전자의 시작 지점이 4.5kb 떨어져 있었다. IB-00223 라인은 T-DNA가 가상 단백질(hypothetical protein)의 앞쪽 3kb 지점에 삽입되어 있었다. 도 5A 및 도 6A는 각각 1B-00107과 1B-00223 내 T-DNA의 삽입 위치와 주변 유전자를 도식화한 것이다.

(단계 2) 선별된 두 개 라인의 후세대에서의 T-DNA 분리비 결정

활성 표지에 의한 인접 유전자의 발현량 증가를 확인하기 위해, 상기 단계 1에서 선별된 두 개 라인의 T-DNA 삽입 유전형을 PCR을 통해 결정하였다. 각 라인 당 15 개체의 후세대를 전개하여 이들의 잎에서 게놈 DNA를 추출하였고 이를 PCR의 주형 DNA로 사용하였다. 이때, 프라이머로는 T-DNA에 특이적인 프라이머 및 삽입된 T-DNA와 인접한 DNA의 앞부분에 특이적인 프라이머 쌍(L 및 F)을 사용하거나,삽입된 T-DNA와 인접한 주변 DNA의 앞부분 및 뒷부분에 특이적인 프라이머 쌍 (F 및 R)을 사용하였다. 상기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 경우, T-DNA가 삽입되지 않은 야생형은 삽입된 T-DNA와 인접한 DNA의 앞·뒷부분에 특이적인 프라이머 쌍에 의해서만 PCR 증폭이 일어나고, T-DNA가 모두 삽입된 동형 접합체는 T-DNA에 특이적인 프라이머 및 인접한 DNA의 앞부분에 특이적인 프라이머 쌍에 의해서만 PCR 증폭이 일어나게 된다. 또한, 이형 접합체는 상기 두 종류의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 모두에서 DNA 절편이 증폭된다(도 5B 및 도 6B). 이러한 원리를 이용하여 상기 단계 1에서 선별된 1B-00107 및 1B-00223 라인의 후세대의 유전형을 결정하였다. PCR 반응은 1unit의 Thermus aquaticus DNA 중합효소(Takara사), 10mM dNTPs, 0.2 μM의 프라이머, 5㎕의 10X 반응 완충용액을 넣어 전체 부피 50㎕에서 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 1분, 62℃에서 1분, 72℃에서 1분을 1 주기(cycle)로 35주기를 수행하였다. 1B-00107 및 1B-00223 라인 모두 T-DNA 특이적인 프라이머는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하였고, 삽입된 T-DNA와 인접한 DNA의 앞·뒷부분에 특이적인 프라이머로, 1B-00107 라인은OsBRI1에 특이적인 서열번호 7 및 8의, 1B-00223 라인은 가상 단백질에 특이적인 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드을 이용하였다.

그 결과, 도 5B 및 도 6B에서 보는 바와 같이, T-DNA가 삽입되지 않은 야생형 개체에서는 인접 DNA의 앞·뒷부분에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 PCR 증폭에서만 DNA 절편이 검출되었고, T-DNA가 모두 삽입된 동형접합 식물체에서는 T-DNA 특이적인 프라이머와 인접 DNA의 한쪽 부분에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 PCR증폭에서만 DNA 절편이 검출되었다. 반면, 이형 접합체는 상기 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR 증폭 모두에서 DNA 절편이 검출되었다.

(단계 3) T-DNA 유전형에 따른 인접 유전자의 발현량 변화

활성 표지에 의한 RNA 발현량의 변화를 조사하기 위해, 선별된 두 라인의 후세대 야생형, 이형 접합체 및 동형 접합체의 잎으로부터 각각 RNA를 분리하여 하기와 같이 RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, RT-PCR을 위해 각 개체의 성숙한 잎을 갈아 RNA를 분리한 후, 역전사 효소와 서열번호 11의 올리고 dT 프라이머를 이용하여 한 가닥 cDNA를 만들고 35S 인핸서 인접 유전자에 특이적인 프라이머 쌍(1B-00107 라인의OsBRⅠ1: 서열번호 12 및 13의 프라이머 쌍; 1B-00223 라인의 가상 단백질: 서열번호 14 및 15의 프라이머 쌍)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR은 1/25 volume의 cDNA를 주형으로 하여 20 cycle(94℃에서 1 분, 62℃에서 1 분 및 72℃에서 1 분)의 반응을 수행하였다. RT-PCR 결과로 얻은 DNA 절편을 1.2% 아가로스 겔에 전기영동한 후, 나일론 막에 DNA를 전이시킨 후 RT-PCR 결과 자체를 프로브(probe)를 사용하여 통상적인 방법에 따라 서던 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 5C 및 도 6C에 나타난 바와 같이, 이형 접합체와 동형 접합체가 야생형에 비해 35S 인핸서 인접 유전자의 발현량이 훨씬 많이 증가하였다. 이러한 결과는 벼를 포함한 단자엽 식물체에서 최초로 35S 인핸서를 이용한 활성 표지 라인을 선별한 것으로서, 본 발명의 표지 벡터 pGA2715는 벼를 포함하는 단자엽 식물에서 활성 표지에 의한 우성 유전 돌연변이를 획득하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 T-DNA 표지 벡터를 이용한 단자엽 식물의 형질전환 방법은 벼를 포함한 단자엽 식물에서 최초로 기능획득 돌연변이체를 만들 수 있고, 유전자 포획을 통한 유전자 발현 관찰과 기능손실 돌연변이체를 동시에 얻을 수 있기 때문에 벼를 포함한 다양한 작물의 유전자 기능 분석 및 새로운 품종 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> POSTECH <120> THE METHOD FOR PREPARING TRANSFORMED MONOCOTYLEDON WITH T-DNA TAGGING VECTOR COMPRISING AN ENHANCER ELEMENT FOR ACTIVATION TAGGING AND A REPORTER GENE TRAPPING AND THE TRANSFORMANTS PREPARED BY THIS METHOD <130> 200207-0035 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 1 ggggatccga ggtaccaggt accaggtgag ttccatt 37 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 2 cgcccgggac ctgcatataa cctgcatata acctgtaaga tttag 45 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 3 ggaattctag aactagtgga tcc 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 4 ggaattcact gatagtttcg gatc 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 5 ctagagtcga gaattcagta ca 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 6 tggcactttt cggggaaatg tgc 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 7 cagtcaagag gctgacacag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 8 cgacctgtct agactgtgga 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 9 atgaacgcag agtactgcat ttg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 10 tttgatgtac ttactcttgc cga 23 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 11 tttttttttt tttttagc 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 12 cagcttggag gatgtgttgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 13 tcttcgagtc gaccgtcgac 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 14 ctcaggaacc caaacacgtt cac 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 15 tttgatgtac ttactcttgc cga 23

Claims

1) 활성 표지(activation tagging)를 위한 인핸서(enhancer) 및 유전자 포획(gene trapping)을 위한 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 T-DNA 표지 벡터(tagging vector)를 제조하는 단계;

2) 단계 1)에서 제조된 T-DNA 표지 벡터로 형질전환된 미생물과 단자엽 식물의 캘러스를 공배양하는 단계를 포함하는 단자엽 식물의 형질전환체를 제조하는 방법.

제 1 항에 있어서,

단계 1)의 T-DNA 표지 벡터에서 활성 표지를 위한 인핸서가 꽃양배추 모자이크 바이러스의 프로모터로부터 유래한 35S 인핸서이고, 유전자 포획을 위한 리포터 유전자가 GUS 유전자인 방법.

제 2 항에 있어서,

T-DNA 표지 벡터가 pGA2715 벡터인 방법.

제 1 항에 있어서,

단계 2)의 미생물이 아그로박테리움인 방법.

제 4 항에 있어서,

미생물이 아그로박테리움 튜마파시엔스 LBA4404(수탁번호: KCTC 1034BP)인 방법.

제 1 항에 있어서,

단자엽 식물이 벼인 방법.

제 1 항에 따른 방법으로 제조된 단자엽 식물의 형질전환체.

제 7 항에 있어서,

단자엽 식물이 벼인 형질전환체.