CN116790625A - 槟榔erf116基因及其在植物器官脱落中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种槟榔ERF116基因，其CDS序列如SEQ ID No.1所示。本发明首次从槟榔中克隆获得槟榔ERF116基因，ERF116定位在细胞核，在槟榔落果顶峰期表达量达到最高，说明ERF116基因能够调控植物器官脱落，例如，将AcERF116基因转化番茄，能够促进番茄花梗脱落。而且本发明的AcERF116能够与AcPME启动子互作，通过调控AcPME的表达，进而影响植物器官脱落。本发明克隆的AcERF116基因具有促进植物器官脱落的功能，在作物遗传育种提供新的基因资源和技术支持，具有非常广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种槟榔ERF116基因及其在植物器官脱落中的应用。
背景技术
槟榔(ArecacatechuL.)棕榈科槟榔属常绿乔木，茎直立，乔木状，高10多米，最高可达30米，有明显的环状叶痕，雌雄同株，花序多分枝，子房长圆形，果实长圆形或卵球形，种子卵形，花果期3-4月。花果脱落是一个高度程序化的生理过程，与作物的产量密切相关，幼果异常脱落严重影响产量，是槟榔种植产业中亟待解决的问题。因此在槟榔中开展植物器官脱落相关基因的研究，对于槟榔产业的发展具有重要的意义。
本发明以“热研1号”槟榔幼果离层组织为试验材料，克隆得到AcERF116基因的CDS序列，并分析其在幼果脱落进程中的表达模式；构建植物超表达载体，通过农杆菌介导法转化Micro-Tom番茄过量表达，证明其促进了番茄花梗的提前脱落。另外，克隆和研究槟榔中有关器官脱落的基因有助于提高作物遗传育种的效率，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种槟榔ERF116基因及其在植物器官脱落中的应用。
本发明的第一个方面是提供一种槟榔ERF116基因，其CDS序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述槟榔ERF116基因编码的蛋白。
本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述槟榔ERF116基因的编码区的重组载体或宿主菌。
其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pCAMBIA1302，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的槟榔ERF116基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白、或者本发明第三个方面所述的重组载体或宿主菌在调节植物器官脱落中的应用。
本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的槟榔ERF116基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白、或者本发明第三个方面所述的重组载体或宿主菌在促进果实脱落中的应用。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的槟榔ERF116基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白、或者本发明第三个方面所述的重组载体或宿主菌在促进植物花梗脱落中的应用。
本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的槟榔ERF116基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白、或者本发明第三个方面所述的重组载体或宿主菌在调控AcPME表达中的应用。
其中，槟榔ERF116基因编码的蛋白与AcPME启动子互作，抑制AcPME启动子活性，从而调控AcPME表达，所述AcPME启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的槟榔ERF116基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白、或者本发明第三个方面所述的重组载体或宿主菌在抑制AcPME启动子活性中的应用，所述AcPME启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的第九个方面是提供一种引物对，所述引物对包括：AcERF116-Fprimer：CAGATCTATGCTCCTGCTCGACATGCT(下划线的碱基为酶切位点和保护碱基，下同)，和AcERF116-Rprimer：CCCATGGTCACCAAGGGCCAGAAGAAACCT(下划线的碱基为酶切位点和保护碱基)。
本发明首次从槟榔中克隆获得槟榔ERF116基因，AcERF116定位在细胞核，在槟榔落果顶峰期表达量达到最高，说明ERF116基因可调控植物器官脱落，例如，将ERF116基因转化番茄，能够促进番茄花梗脱落。而且本发明的AcERF116能够与AcPME启动子互作，通过调控AcPME的表达，进而影响植物器官脱落。本发明提供的槟榔ERF116基因可为植物尤其是槟榔的品种改良和选育提供方向和技术支持。
附图说明
图1为亚细胞定位情况。
图2为槟榔ERF116基因在槟榔幼果脱落过程中的表达情况。
图3为转槟榔ERF116基因番茄花梗脱落表型分析情况。
图4为转槟榔ERF116基因番茄花梗脱落率。
图5为显微镜观察转槟榔ERF116基因番茄果实与花梗连接部位。A-B：野生型，C-D：转槟榔ERF116基因番茄。
图6为酵母单杂交验证结果。
图7为双荧光素酶实验结果。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一、槟榔ERF116基因的获得
提取槟榔幼果离层RNA，反转录成cDNA，以所得cDNA为模板，采用基因克隆全长引物AcERF116-Fprimer：CAGATCTATGCTCCTGCTCGACATGCT，和AcERF116-R primer：CCCATGGTCACCAAGGGCCAGAAGAAACCT，进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增程序：98℃5分钟；98℃10秒钟，58℃10秒，72℃40秒，32个循环；72℃5分钟。
回收扩增产物，送测序。通过PCR方法扩增获得槟榔ERF116基因(也称为AcERF116基因)，其CDS序列如SEQ ID No.1所示。
二、AcERF116亚细胞定位
设计含有接头的AcERF116基因特异性引物(F：ActagggtctcGctccATGCTCCTGCTCGACATGCT；R：ActagggtctcTaccgTCACCAAGGGCCAGAAGAAACCTC)，以实施一中所得cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增程序：98℃5分钟；98℃10秒钟，58℃10秒，72℃40秒，32个循环；72℃5分钟。
将PCR产物进行回收、测序正确后，通过BsaI-HF酶切和T4DNAligase连接反应，将其片段连入pEGOEP35S-H-GFP载体中，分别将重组质粒pEGOEP35S-H-GFP-AcERF116和pEGOEP35S-H-GFP转入农杆菌GV3101中。将含有35S：GFP、35S：GFP-AcERF116和带有核定位标记SV40-mCherry的空载体分别注射到本氏烟草(N.benthamiana)叶片背面，弱光培养2天后于激光共聚焦显微镜488nm和561nm激发光中观察绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白RFP的表达，由此确定AcERF116的亚细胞定位。结果如图1所示，空载体中GFP绿色荧光蛋白在细胞膜、细胞质、细胞核中均可检测到荧光信号，而pEGOEP35S-H-GFP-AcERF116的绿色荧光蛋白只定位于细胞核，由此证明AcERF116是核转录因子。
三、AcERF116在槟榔不同组织中和在果实脱落过程中的表达
采用植物总RNA提取试剂盒(上海生工，B518631)提取槟榔幼果离层总RNA(其方法参照说明书)。以总RNA为模板，使用cDNA合成试剂盒(TaKaRa,PrimeScriptTMRTreagent Kitfor qPCR,RR047Q)进行基因组DNA的去除和反转录反应(其方法参照说明书)。
我们采用qPCR方法检测了AcERF116基因在果实脱落过程中的表达情况，结果显示，在落果顶峰期(雌花开放后21天)其基因表达量达到最高，随后呈现下降的趋势(图2)。表明AcERF116在槟榔幼果脱落过程发挥了关键作用。
本实验qPCR所用引物为AcERF116-qF primer:TCGAACTCGGGCCAGCCCAAAG和AcERF116-qRprimer:AATGCCGTGCCGGGTCGAGT。
反应体系为：
PCR扩增程序：50℃2分钟；95℃2分钟；95℃15秒钟，58℃15秒，72℃60秒，40个循环；72℃5分钟，熔解曲线反应条件为95℃15秒钟，60℃60秒，95℃15秒。
四、过表达AcERF116加速了番茄花梗的脱落
植物表达载体的构建：将实施一中获得的AcERF116基因CDS片段连接至pMD19-T质粒(参考pMD-19-TVectorCloneKit说明书，TaKaRacode：6013)中，转化感受态DH5α大肠杆菌，提取质粒，用XbaⅠ和NcoⅠ双酶切线性化质粒pMD19-T-AcERF116和植物表达载体pCAMBIA1302，回收片段后进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选PCR检测正确的克隆测序，得到植物表达载体pCAMBIA1302-AcERF116。
农杆菌转化：取1μL重组质粒加入50μLGV3101农杆菌感受态细胞中，充分混匀后吸取至电转杯中，电转后加1mLLB液体培养基，充分混匀后吸取至1.5mL离心管中，于摇床30℃、180rpm振荡培养30min，将活化好的农杆菌菌液吸取50μL接种于LB固体培养基(含50mgL-1利福平和50mgL-1卡那霉素)上，30℃暗培养48h，挑取单菌落摇菌，经目的基因PCR检测确认重组质粒成功转入农杆菌中。
外植体的制备：“Micro-Tom”番茄种子经消毒后播种于萌发培养基中，23℃暗培养2d，待种子露出白发芽后，置于23℃、16h/8h光照/黑暗培养4～5d。萌发的番茄苗，待子叶完全展开，用手术刀切除子叶柄及子叶尖，留中间部分切为2～3段接种于预培养基，23±2℃预培养1～2d。
农杆菌介导番茄转化：挑取农杆菌于LB培养基中培养过夜，离心收集菌体，用新鲜LB培养基重悬菌体至OD600值为0.6，将预培养好的外植体放入农杆菌重悬液中浸染10～15min，将晾干的外植体接于共培培养基中，23±2℃暗培养2d。
转基因植株的再生：将共培后的外植体用1g/L的头孢水清洗两次，15min/次，接种于恢复培养基中，23℃、16h/8h光照/黑暗培养3～5d；将恢复培养的愈伤接种于筛选培养基，23℃、16h/8h光照/黑暗培养15-30d；筛选出的愈伤接种于分化培养基，23℃、16h/8h光照/黑暗培养30-40d。待分化的幼苗生长至2-3cm左右，将其从愈伤上切除，接种于生根培养基，23℃、16h/8h光照/黑暗培养10-15d。
转基因植株的检测：采用CTAB法提取番茄基因组DNA(提取方法参照TaKaRaMiniBEST PlantGenomicDNAExtractionKit，Takara，Code：9768)，利用潮霉素抗性基因Hyg+引物(F：ATGTAGGAGGGCGTGGAT；R：CTTCTGCGGGCGATTTGT)进行PCR检测，确认其植株为转基因植株。
为评估AcERF116基因对番茄花梗脱落的影响，本研究选取过表达AcERF116转基因植株及对照WT植株当日开放的花器官，调查花梗外植体脱落率。结果如图3-4所示，转基因植株35S:AcERF116-1、35S:AcERF116-2和35S:AcERF116-3在去除花12h后离层部位形成明显的断痕(图3)，48h时脱落率达到100％(图4)；而WT在去除花后12h未见明显断痕(图3)，48h时脱落率为72％，显著低于转基因植株同时期脱落率(图4)。
本实验选取转基因植株和野生型植株同一阶段的花梗离区制备石蜡切片观察其离区解剖结构的差异，结果显示，野生型番茄植株在去除花12h后离层细胞未见分离，呈圆形或椭圆形，明显小于临近细胞，细胞质浓厚(图5A、5B)，转基因植株在去除花12h后离层部位处于部分脱落状态(图5C、5D)，细胞间隙变大，排列松散，离层细胞间隙染色较少。
四、酵母单杂验证
从槟榔基因组数据库库中下载AcPME基因启动子(ATG上游1657bp片段，如SEQ IDNo.4所示)作为目标序列，设计带有EcoRI和SacI酶切位点的引物(F：GGAATTCCGTCGGCAAAGGTCACGGACTTCG；R：CGAGCTCTTGGATGGTCCGGAAATTCCCCGA)，以槟榔叶片与幼果的混合DNA为模板进行PCR扩增得到含有AcPME基因启动子的序列。
PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增程序：98℃5分钟；98℃10秒钟，58℃10秒，72℃100秒，32个循环；72℃5分钟。
将PCR产物进行回收、测序正确后，通过EcoRI和SacI酶切、回收，将AcPME启动子序列连接插入pHis2载体中构成酵母单杂交Bait载体。
设计带有EcoRI和BmHI酶切位点AcERF116的CDS序列引物(F：CGGAATTCATGCTCCTGCTCGACA；R：CGGGATCCTCACCAAGGGCCAGA)，以实施一中获得的cDNA为模板进行扩增，PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增程序：98℃5分钟；98℃10秒钟，58℃10秒，72℃40秒，32个循环；72℃5分钟。
将PCR产物进行回收、测序正确后，通过EcoRI和BmHI酶切、连接插入到pGADT7载体中构成Prey载体，分别转入大肠杆菌中，PCR确定阳性克隆后送测序，提取质粒取5μl转入Y187酵母感受态细胞，涂布相应的缺陷型筛选平板，30℃恒温培养3-4天进行背景浓度筛选检测。
将实验组pHis2-ProPME+pGADT7-AcERF116，对照组pHis2-ProPME+pGADT7，阳性对照pHis2-p53+pGAD53m验证成功的单菌落，用2ml的ddH2O水重悬，调OD600＝0.002，浓度设置为三个梯度100、10-1、10-2，吸取10ul做点板实验，分别点到SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+40mM3AT培养基上，每个板点三个点，30℃恒温培养3-5天。
结果显示，pHis2-ProPME+pGADT7-AcERF116和阳性对照pHis2-P53+pGAD53m在SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+40mM3AT平板均能生长良好，而对照组pHIS2-ProPME+pGADT7在SD-TL、SD-TLH平板能正常生长，在SD-TLH+40mM 3AT平板则不能生长(图6)。表明AcERF116能与AcPME启动子互作，调控AcPME的表达，进而影响植物器官脱落。
五、双荧光素酶实验
载体构建：设计含有In-fusion特异位点AcERF116基因扩增的全长引物(F：ggaga ggacagcccaccaccATGCTCCTGCTCGACATGCTCG；R：agagactggtgatttcagcgTCACCAAGGGCCAGAAGAAACCTC)，以实施一中获得的cDNA为模板，扩增CDS全长。
PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增程序：98℃5分钟；98℃10秒钟，58℃10秒，72℃40秒，32个循环；72℃5分钟。
然后将AcERF116基因连入用BsaI和Eco31I双酶切线性化质粒pGreenII 62-SK-ccdb上，构建双荧光素酶实验的effector载体，经测序鉴定正确后用于双荧光素酶实验。以槟榔叶片与幼果的混合DNA为模板，设计含有In-fusion特异位点的AcPME基因启动子ATG上游1657bp片段的引物(F：cgaggtcgacggtatcgataCGTCGGCAAAGGTCACGGAC；R：gcgtcttccatg gtcccccgTTGGATGGTCCGGAAATTCCCCG)，进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增程序：98℃5分钟；98℃10秒钟，58℃10秒，72℃100秒，32个循环；72℃5分钟。
将目的片段连入用BsaI和Eco31I双酶切线性化质粒pGreenII0800-LUC-ccdb上，构建双荧光素酶实验的reporter载体，经测序鉴定正确后用于双荧光素酶实验。
烟草转化：播种烟草种子，培养月1个月左右备用。将含有重组质粒的农杆菌进行划线培养复苏，单菌落接种至含有50mgL-1利福平和50mgL-1卡那霉素的LB液体培养基中，于摇床30℃、180rpm振荡培养至菌液混浊，接着按照1:50比例扩大培养至OD600值为0.6左右，4000rpm/min，离心5min，去上清，用10mMMgCl2(含120uMAS)悬浮液重悬菌体，调OD600至1.0左右，28℃静置1h以上。将转录因子effector与启动子reporter按体积比1：1的比例混合共转染注射至标记好的叶片中，避光培养2天，即可检测。
荧光值检测：使用Vazyme公司的Duo-LiteLuciferaseAssaySystem双荧光素酶报告基因检测试剂盒(DD1205-01)，转录因子激活结构基因启动子的活力通过测定萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase，LUC)活力，用CaMV:35S驱动的海肾萤光素酶(Renillaluciferase，REN)作为对照，酶活力测定方法参考试剂盒操作方案,用萤火虫荧光素酶(LUC)测定得到的值除以海肾荧光素酶(REN)测定得到的值，即实验结果为Luc/Ren。
结果显示,pGreenII-62-SK-AcERF116和pGreenII-0800-proAcPME-LUC共转后其LUC/REN值显著低于对照组(pGreenII-62-SK+pGreenII-0800-proAcPME-LUC)(图7)，表明AcERF116可以抑制AcPME启动子的活性，进而影响细胞壁的重塑，导致植物器官的脱落。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种槟榔ERF116基因，其特征在于，其CDS序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述槟榔ERF116基因编码的蛋白。
3.含有权利要求1所述槟榔ERF116基因编码区的重组载体或宿主菌。
4.如权利要求1所述的槟榔ERF116基因、或者权利要求2所述的蛋白、或者权利要求3所述的重组载体或宿主菌在调节植物器官脱落中的应用。
5.如权利要求1所述的槟榔ERF116基因、或者权利要求2所述的蛋白、或者权利要求3所述的重组载体或宿主菌在促进植物果实脱落中的应用。
6.如权利要求1所述的槟榔ERF116基因、或者权利要求2所述的蛋白、或者权利要求3所述的重组载体或宿主菌在促进植物花梗脱落中的应用。
7.如权利要求1所述的槟榔ERF116基因、或者权利要求2所述的蛋白、或者权利要求3所述的重组载体或宿主菌在调控AcPME表达中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，槟榔ERF116基因编码的蛋白与AcPME启动子互作，抑制AcPME启动子活性，从而调控AcPME表达，所述AcPME启动子的核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
9.如权利要求1所述的槟榔ERF116基因、或者权利要求2所述的蛋白、或者权利要求3所述的重组载体或宿主菌在抑制AcPME启动子活性中的应用，所述AcPME启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
10.一种引物对，其特征在于，所述引物对包括：AcERF116-Fprimer：CAGATCTATGCTCCTGCTCGACATGCT，和AcERF116-Rprimer：CCCATGGTCACCAAGGGCCAGAAGAAACCT。
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