CN110106171A

CN110106171A - 长链非编码rna及其在调控植物耐低温中的应用

Info

Publication number: CN110106171A
Application number: CN201810102148.4A
Authority: CN
Inventors: 赵敏桂; 张文浩; 任立飞; 杨晨格
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2038-02-01
Also published as: CN110106171B

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA及其在调控植物耐低温中的应用。本发明所提供的长链非编码RNA，为如下任一：1)SEQ ID No.2所示RNA；2)将SEQ ID No.2所示序列经过一个或几个核苷酸残基的取代、缺失和/或添加且具相同功能的RNA；3)与1)或2)限定序列具99％、95％、90％、85％或80％以上同源性且具相同功能的RNA。本发明通过对Mt‑lncRNA208基因超表达株系与其野生型苜蓿R108进行比较研究，发现Mt‑lncRNA208超表达株系耐低温能力均高于野生型；表明Mt‑lncRNA208增强了植物耐低温胁迫的能力。本发明对于培育耐低温植物新品种具有重要意义。

Description

长链非编码RNA及其在调控植物耐低温中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种长链非编码RNA及其在调控植物耐低温中的应用。

背景技术

对真核细胞中非编码RNA及其基因的发掘和功能研究，有可能揭示一个由非编码RNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网络，从不同于蛋白质编码基因的角度注释和阐明基因组的结构与功能，深入阐明生命活动的本质和规律。非编码RNA是由基因组转录产生的一类不同于mRNA的遗传信息分子。本世纪初，以“人类基因组计划”为代表的研究工作揭示：编码蛋白质的基因约占人类基因组2％，而98％以上是功能未知的非蛋白质编码序列，其中可能蕴藏着数目巨大的非编码RNA基因。由于非编码RNA没有编码蛋白质的读码框架，在基因组中难以发现和鉴定。非编码RNA不仅广泛地存在于各种生物中，而且，随着生物复杂度的升高，基因组中的非编码序列的比例也相应增大，提示非编码RNA在生物进化过程中的重要意义。根据表达特征，非编码RNA被分为持家非编码RNA和调控非编码RNA。调控非编码RNA仅在生物体的特定组织和发育阶段表达，或者对应激环境产生应答反应后特异表达，这种特异表达调控着各种生物过程。长链非编码RNA(lncRNA)是指长度在200nt以上的调控非编码RNA，没有长的开放阅读框(ORF)，不具备编码蛋白质的功能，但是在特定的条件下有些lncRNA可以编码功能性寡肽。lncRNA的作用机制和生物学功能极其多样,通过影响其它RNA或蛋白质的稳定性来调节基因的表达，参与剂量补偿、基因组印记、X染色体失活等生物过程。哺乳动物中已发现了大量的lncRNA参与基因表达调控，在细胞周期调控、免疫监视和胚胎干细胞多能性等过程发挥作用。近期的研究证明，多种疾病与lncRNA的异常表达或突变相关。lncRNA的功能已经引起了人们广泛的关注，对lncRNA功能的研究已经成为目前分子生物学的研究热点和前沿。

豆科植物是重要的经济、能源和粮食作物。但是，大多数豆科栽培植物基因组大且结构复杂,缺乏有效的遗传转化体系,难以进行分子生物学分析。模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)又不能满足豆科生物学和基因组学研究的需要。一年生蒺藜苜蓿与大多数豆科植物遗传关系近，具有二倍纯合体、基因组小、生长周期短、易于人工繁殖和基因转化、已完成基因组测序等优点，使其成为豆科分子生物学研究的模式植物。然而，近年来利用蒺藜苜蓿的研究主要侧重于生物固氮分子机理的研究，对苜蓿抗逆分子机理的研究非常有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种长链非编码RNA及其在调控植物耐低温中的应用。

第一方面，本发明要求保护一种长链非编码RNA。

本发明所要求保护的长链非编码RNA，可为如下任一：

(a1)SEQ ID No.2所示的RNA；

(a2)将SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA；

(a3)与(a1)或(a2)所限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的RNA。

第二方面，本发明要求保护能够转录成所述长链非编码RNA的DNA。

进一步地，所述DNA可为如下中任一：

(b1)SEQ ID No.1所示的DNA；

(b2)将SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA；

(b3)与(b1)或(b2)所限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的DNA。

第三方面，本发明要求保护含有所述长链非编码RNA或所述DNA的表达盒、重组载体或重组菌。

其中，所述表达盒由启动子、所述DNA和转录终止序列组成。所述重组载体可为重组表达载体或重组克隆载体。

在本发明中，所述重组载体具体为将所述DNA替换pMDC32载体中酶切位点AscI和PacI之间的小片段后得到的重组质粒。

第四方面，本发明要求保护所述长链非编码RNA或所述DNA或所述表达盒或所述重组载体或所述重组菌在调控植物耐低温中的应用。

在所述应用中，所述长链非编码RNA或所述DNA在所述植物中的表达量越高，所述植物的耐低温性越强；所述长链非编码RNA或所述DNA在所述植物中的表达量越低，所述植物的耐低温性越弱。

第五方面，本发明要求保护两种方法。

方法I：一种培育耐低温性增强的植物的方法，可包括使受体植物中所述长链非编码RNA的表达量升高的步骤。

方法II：一种培育耐低温性减弱的植物的方法，可包括使受体植物中所述长链非编码RNA的表达量降低的步骤。

在所述方法I中，所述使受体植物中所述长链非编码RNA的表达量升高可通过向所述受体植物中导入所述DNA来实现。

进一步地，可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。如通过重组载体的形式将所述DNA导入所述受体植物中。

所述重组载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCMDC32、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

更进一步地，在本发明中，所述重组载体具体为将所述DNA替换pMDC32载体中酶切位点AscI和PacI之间的小片段后得到的重组质粒。

在所述方法II中，所述使受体植物中所述长链非编码RNA的表达量降低可通过对所述受体植物中所述DNA进行敲除或抑制表达来实现。

进一步地，可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述DNA进行特异性编辑，从而敲除其在所述受体植株中的表达，或者通过RNAi手段对所述DNA进行抑制表达。

在所述方法I和所述方法II中，将携带有所述DNA的所述重组载体或者用于对所述受体植物中所述DNA进行敲除或抑制表达时采用的基因编辑工具导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在以上第四方面所述的应用和第五方面所述的方法中，所述植物可为双子叶植物。

进一步地，所述双子叶植物可为豆科植物。

更进一步地，所述豆科植物可为苜蓿属植物。

更加具体地，所述苜蓿属可为苜蓿。具体如蒺藜苜蓿R108。

本发明通过对Mt-lncRNA208基因超表达株系与其野生型苜蓿R108进行比较研究，发现Mt-lncRNA208超表达株系耐低温能力均高于野生型；表明，Mt-lncRNA208增强了植物耐低温胁迫的能力。本发明对于培育耐低温植物新品种具有重要意义。

附图说明

图1为Mt-lncRNA208基因对低温胁迫的响应。

图2为超表达株系中Mt-lncRNA208基因表达量的增加。

图3为Mt-lncRNA208超表达株系冷冻半致死温度。

图4为Mt-lncRNA208超表达株系冷冻存活率。

各图中*表示与对照相比在P<0.05水平上差异显著。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

蒺藜苜蓿R108：记载于“李根.蒺藜苜蓿生态型A17和R108对缺铁响应的比较研究.中国科学院大学,2013年硕士论文”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。

蒺藜苜蓿A17：记载于“李根.蒺藜苜蓿生态型A17和R108对缺铁响应的比较研究.中国科学院大学,2013年硕士论文”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。

pMDC32载体：记载于“冯雪,王甜甜,郝怀庆等.高粱SbHKTs基因的克隆及其在拟南芥中的功能验证.植物生理学报,2015,51(9):1513-1523”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。

实施例1、Mt-lncRNA208转基因植株的获得

一、Mt-lncRNA208基因的获得

本发明前期借鉴蒺藜苜蓿分子遗传信息，系统开展了苜蓿抗逆分子机理的研究，取得了一些研究进展。前期研究发现，蒺藜苜蓿具有低温驯化特性，但对其低温驯化响应分子机理的认识非常有限。为了能从非编码RNA的水平揭示苜蓿低温驯化响应的分子基础，本发明利用高通量测序技术和生物信息学分析手段，对蒺藜苜蓿低温驯化响应lncRNA进行鉴定。发现蒺藜苜蓿叶片中有6753条lncRNA对低温驯化响应，根中对低温驯化响应的lncRNA是5053条。通过构建lncRNA与其靶基因关系图谱，获得了一些参与调节CBF转录因子的lncRNA。其中，一个命名为Mt-lncRNA208的基因的序列为SEQ ID No.1，其能够转录得到SEQID No.2所示的长链非编码RNA。

二、Mt-lncRNA208基因在低温胁迫下的表达量

野生型蒺藜苜蓿R108播种，培养21天后，经过4℃低温处理不同时间(0到168小时)后，提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，通过荧光定量PCR进行表达量检测。用到的引物序列由Invitrogen公司合成，具体如下：Mt-lncRNA208的正向引物：5′-TAC TCT TGC GGG AGGTTC ATA AT-3′；反向引物：5′-GTC ATA TCG AGG TTTTCG TGT TC-3′。

定量PCR反应在ABI Stepone Plus instrument上进行，每个基因每次设三个重复，定量PCR分析通过SYBR Green荧光染料与DNA双链(目的片段的PCR产物)结合，并利用实时定量PCR检测仪在72℃步骤检测荧光强度，来判定PCR产物的量。因为每个样品中RNA含量不同，样品中的cDNA的量需用同一个样品所检测到的MtActin cDNA(MtActin扩增正向引物：5′-ACG AGC GTT TCA GAT G-3′；反向引物：5′-ACC TCC GAT CCA GAC A-3′)的含量来确定。

定量PCR反应体系：

反应条件为：95℃10分钟；[95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒]×40个循环。

结果如图1所示，可以看出，低温胁迫迅速诱导Mt-lncRNA208基因表达，低温处理2小时后Mt-lncRNA208基因的表达量是不进行低温处理(低温处理0小时)的8倍，说明Mt-lncRNA208基因与低温胁迫有关。

三、Mt-lncRNA208超表达株系的构建

(一)苜蓿DNA的提取

1.取约100mg的蒺藜苜蓿A17叶片于1.5mL离心管中，用液氮研磨成粉末；

2.加入200μL CTAB提取液，充分混匀。

CTAB提取液配方如表1所示：

表1CTAB提取液配方

CTAB	2％(m/v)
		Tris-Cl(pH 8.0)	100mM
EDTA(pH 8.0)	20mM
		NaCl	1.4M

3.65℃水浴，30分钟，期间混匀几次；

4.自然冷却后，加入200μL氯仿轻轻混匀，12000转/分钟，室温，离心15分钟；

5.将上清液吸入新的离心管，加等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10分钟，12000转/分钟，室温，离心10分钟；

6.弃上清液，加入200μL 75％乙醇清洗沉淀，7500转/分钟，室温，离心2分钟，重复上述操作一次；

7.弃上清液，7500转/分钟，室温，离心2分钟，吸掉管内残余乙醇，室温开盖晾干约10分钟，使残余乙醇完全挥发；

8.加入30μL ddH₂O使DNA完全溶解；

9.取2μL DNA溶液，用1％的琼脂糖凝胶电泳，通过电泳亮度检测DNA的提取质量。样品于-20℃保存备用。

(二)质粒提取和酶切产物回收

质粒提取和酶切回收，均选用天根生化公司的相应试剂盒，按照内置说明书中的操作步骤进行提取。最后一步产物洗脱时，用65℃温育的ddH₂O，取2μL产物，琼脂糖凝胶电泳鉴定质量。

(三)Mt-lncRNA208表达载体的构建

1.Mt-lncRNA208基因的克隆

以蒺藜苜蓿A17的DNA为模板，用Takara公司PrimeHSDNA聚合酶进行扩增。Mt-lncRNA208基因扩增正向引物：5′-TCG GCG CGC CAG GCA TAA TTG TCC CTC TC-3′(下划线处为酶切位点AscI)，反向引物：5′-TTA ATT AAT CTG TCA CTT GGT TTC AAA ATT T-3′(下划线处为酶切位点PacI)。

反应体系如表2所示。

表2克隆Mt-lncRNA208基因的PCR反应体系

5×PrimeSTARTM Buffer	10μL
		dNTP Mixture(2.5mM)	4μL
Forward Primer(10μM)	2μL
		Reverse Primer(10μM)	2μL
PrimeSTARTM HS DNA Polymerase(2.5U/μL)	0.5μL
		Template cDNA	2μL
ddH<sub>2</sub>O	补足至50μL

反应条件为：95℃ 10分钟；[95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒]×30个循环；72℃延伸，10分钟；4℃停止。

2.产物末端加A

PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收，取适量产物加A。体系如表3所示。

表3PCR产物末端加A反应体系

3.载体连接

连接体系如表4所示。

表4连接体系

体系中T载体与加A产物的摩尔比一般要求1:7，具体可根据说明书中所述优化条件，提高连接效率。

4.连接产物转化大肠杆菌并鉴定

(1)取50μL冰上融化的感受态细胞，加入步骤3中连接的产物，轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟。

(2)42℃水浴热激30s，然后迅速将离心管转移到冰上，冰浴2分钟。

(3)向每个离心管中加入500μL无菌的YEB培养基(不含抗生素)，混匀，置于摇床中，37℃，200转/分钟恢复1小时。此处用到的YEB培养基配方如表5所示。

表5YEB培养基配方

牛肉粉	5g
		Yeast extract	1g
Tryptone	5g
		蔗糖	5g
MgSO4·7H<sub>2</sub>O	0.5g

定容至1L，调pH7.0，如果配固体培养基，则加入0.8％(m/v)的琼脂粉，高压蒸汽灭菌(220℃，20分钟)后备用。

(4)梯度吸取不同体积的上述已转化菌液，涂布在加入羧苄青霉素(CarBenicillin,CB)的培养基上，在超净台中，将培养基表面的菌液吹干后，置于37℃培养箱中，倒置过夜培养。

(5)次日挑取单克隆，加入50μg/mLCB的液体YEB培养基中，37℃，200转/分钟，震荡3小时后，进行菌液PCR鉴定。选取阳性克隆，送去基因公司测序，测序正确的菌液加入15％的甘油后保存于-80℃。

5.表达载体构建

(1)将步骤4中保存的T载体菌液和pMDC32载体菌液以1:100的比例，分别加入含有50μg/mL CB和50μg/mL硫酸卡纳霉素(Kanamycin monosulfate,Kan)的YEB培养液中，37℃，220转/分钟，过夜震荡，次日用质粒提取试剂盒提取质粒。

(2)酶切连接

用限制性内切酶AscI和PacI，对T载体和pMDC32表达载体分别进行双酶切，体系如表6所示。

表6T载体和pMDC32表达载体的酶切体系

酶切完成后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，T载体切取目标片段Mt-lncRNA208(591bp)，pMDC32表达载体切取大片段，将两个片段用试剂盒回收，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳确定提取质量和浓度。用Promega公司T4DNA Ligase对酶切产物进行连接，体系如表7。

表7T载体和pMDC32表达载体的连接体系

10×Ligase Buffer	2μL
		T4DNA Ligase	1μL
pMDC32表达载体	1μL
		Mt-lncRNA208片段	12μL
ddH<sub>2</sub>O	补足至20μL

4℃或16℃过夜连接。连接产物按照步骤4的方法，转化大肠杆菌，最后涂布在含50μg/mL Kan的平皿上，倒置培养。次日进行菌液PCR鉴定，选择阳性克隆进行测序，并将测序正确的菌液加15％甘油存于-80℃备用。

将经测序表明，将pMDC32载体中酶切位点AscI和PacI之间的小片段替换为SEQIDNo.1所示Mt-lncRNA208基因后得到的重组质粒命名为pMDC32-lncRNA208。

6.工程载体转化农杆菌EHA105

将上述含有超表达工程载体pMDC32-lncRNA208的大肠杆菌，按照常规方式震荡过夜后，提取质粒，用电击法转化农杆菌，具体步骤如下：

(1)将电击杯用75％的酒精浸泡清洗；

(2)带手套，用1mL移液枪吸取无水乙醇，吹打清洗电击杯3次；

(3)将电击杯放在滤纸上，超净台内吹干并同时紫外灭菌30分钟；

(4)将吹干无菌的电击杯盖上盖子，放在冰盒内预冷；

(5)向干净的EP管中加入600μL的YEB培养液(无抗生素)；

(6)向50μL EHA105感受态中加入0.2-0.5μL质粒，迅速混匀；

(7)将步骤(6)中混匀的液体迅速加入电击杯狭缝底部，保证没有气泡；

(8)2000V电压电击50ms左右；

(9)将电击过的液体迅速加入步骤(5)中的液体中；

(10)28℃，100转/分钟，预培养1小时以上；

(11)取100μL菌液涂板，YEB平板加抗生素50μg/mLKan和100μg/mL利福平(Rifarnpin,Rif)，28℃倒置培养。

一般两天后会长出菌斑，挑单克隆进行菌液PCR验证，选取阳性克隆菌液加15％甘油后-80℃保存备用。

7.农杆菌感受态制备

实验室自行制备EHA105感受态，具体方式如下：

(1)蘸取EHA105菌液，在加入Rif的YEB平板上划线活化，划出单克隆；

(2)挑取EHA105单菌落于4mL加入100μg/mL Rif的YEB培养基中，28℃震荡培养至对数期；

(3)以1：200转接入50mL新鲜的YEB液体培养基中，28℃震荡培养至OD600为0.8左右，转移入50mL离心管中，冰浴30分钟；

(4)4℃，4000转/分钟，离心10分钟收集菌体，用10mL预冷的ddH₂O重悬菌体；

(5)4℃,4000转/分钟离心10分钟收集菌体，用10mL预冷的10％甘油重悬菌体；

(6)4℃,4000转/分钟离心10分钟收集菌体，用2mL预冷的10％甘油重悬菌体，每管50μL分装后，存于-80℃保存备用。

(四)农杆菌介导的苜蓿转化

用农杆菌介导法，将含有外源基因Mt-lncRNA208的表达载体pMDC32-lncRNA208，转入蒺藜苜蓿R108，方法参考网站http://www.noble.org/medicago-handbook/中关于农杆菌转化苜蓿的方法手册：Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation andin vitro plant regeneration of M.truncatula.

1.苜蓿组织培养和转化过程中用到的培养基及其组分

培养转化过程中用到的培养基，都是在SH培养基的基础上进行调整。

实际操作中大量元素(50×)、微量元素(1000×)、维生素(1000×)、铁盐(50×)、CaCl₂(50×)配成浓缩的母液储存备用，肌醇和蔗糖以固体的形式现配现加，然后用KOH调pH5.8，最后定容。

培养过程中会用到下面几种配方的培养基：

重悬培养基：SH培养基+AS+2,4-D+BAP

共培养培养基：SH培养基+AS+2,4-D+BAP+0.3％植物凝胶

诱导培养基：SH培养基+2,4-D+BAP+Hyg+Cef+特美汀+0.3％植物凝胶

分化培养基：SH培养基+Hyg+0.8％琼脂

生根培养基：1/2SH培养基-维生素-肌醇-蔗糖+1％琼脂

其中，各培养基配方中的％表示g/100mL。

SH培养基基本组分如表8所示。

表8SH培养基基本组分

培养中常用激素和抗生素的工作浓度如表9所示。

表9培养中常用激素和抗生素的工作浓度

AS	20mg/L
		2,4-D	4mg/L
BAP	0.5mg/L
		Hyg	20mg/L
Cef	300mg/L
		特美汀	500mg/L

2.农杆菌的培养

蘸取预存的农杆菌菌液，在加有50μg/mL Kan和100μg/mL Rif的YEB平板上划线，保证划出单克隆。挑取单克隆用YEB+Kan+Rif重悬后，菌液PCR鉴定，吸取阳性菌液，以1:100比例，在YEB+Kan液体中重悬，摇床100转/分钟，培养至OD600＝0.5，菌液离心(4000转/分钟，10分钟)后，用重悬培养基重悬至OD600＝0.3备用。

3.苜蓿叶片准备

剪取4-6周的蒺藜苜蓿R108新鲜叶片，用75％酒精和10％NaClO依次进行消毒处理，用手术刀切除叶片边缘，置入步骤2中准备好的农杆菌悬浮液中。

4.共培养

将步骤3中的混合液抽真空10分钟后，放入摇床，87转/分钟，浸染1小时，之后将沾有农杆菌菌液的叶片正面向上，平铺于共培养培养基上，24℃暗处共培养3天。用无菌水清洗叶片，多次清洗尽量将菌液清洗干净，将叶片平铺于诱导培养基上，继续在24℃避光培养。

5.愈伤组织诱导和分化

两周更换一次培养基，更换几次后，可以视生长情况，逐次减半头孢和特美汀的用量，一般两个月左右愈伤组织就可长成蚕豆大小。此时可将愈伤组织块转移入分化培养基，分化培养基放入温度24℃(白天)/20℃(晚上)，光照时间16小时(白天)/8小时(晚上)的无菌条件下培养，继续每两周更换一次培养基。一般在分化培养基上培养2-3周左右，愈伤组织块会出现绿点，此后的分化培养基要去掉Hyg，愈伤组织会慢慢分化出叶片和根。

6.转基因植株的获得

将分化较好的小苗转入盛有生根培养基的小瓶中，使其更好地分化长大为完整的转基因苗，待小苗生长比较壮硕以后，就可以将其从瓶中移出。一般先移到水培中覆膜培养一周，小苗适应外界环境后再移入蛭石中培养。

7.转基因植株的鉴定

从DNA和RNA两个水平上对转基因植株进行鉴定。

DNA水平鉴定，主要是进行潮霉素基因的扩增，因为只有转化成功的植株体内才会带有表达载体上的潮霉素基因。使用特异引物鉴定潮霉素基因：正向引物：5′-GAA GTG CTTGAC ATT GGG GAG TT-3′，反向引物：5′-GAT GTT GGC GAC CTC GTA TTG G-3′。

RNA水平鉴定，主要是mRNA表达量的鉴定。通过设计特异的Mt-lncRNA208基因的引物，以野生型为对照，用qRT-PCR的方法鉴定表达量，表达量明显上升的株系认为转化成功。内参选用MtActin基因，引物序列：正向引物：5′-ACG AGC GTT TCA GAT G-3′，反向引物：5′-ACC TCC GAT CCA GAC A-3′。Mt-lncRNA208表达量鉴定引物序列：正向引物：5′-TACTCT TGC GGG AGG TTC ATA AT-3′，反向引物：5′-GTC ATA TCG AGG TTT TCG TGT TC-3′。定量PCR反应在ABI Stepone Plus instrument上进行，每个基因每次设三个重复。定量PCR反应体系：

从DNA鉴定阳性的转基因植株中随机选取两个，命名为208OE-1-3和208OE-8。对其进行RNA水平鉴定。结果如图2所示，Mt-lncRNA208基因超表达株系208OE-1-3和208OE-8中，Mt-lncRNA208表达量分别是野生型的57和39330倍。

实验同时设置了向蒺藜苜蓿R108中转入pMDC32载体的空载对照。其RNA水平鉴定结果显示空载对照中Mt-lncRNA208表达量与野生型基本一致，无统计学差异。

实施例2、Mt-lncRNA208转基因植株功能的鉴定

一、冷冻半致死温度的测定

分别选取野生型苜蓿R108、空载对照和Mt-lncRNA208基因超表达株系(208OE-1-3和208OE-8)的第2、3片新展开的三出叶打孔，随机选取3片叶圆片(直径8mm)放入15mL玻璃试管中，在低温循环水浴装置中进行处理。0℃静置1小时后向试管中加入200μL的冰晶(PCR管中加入200μL的ddH₂O预先冻制)，继续0℃平衡1小时后温度调至-1℃，之后以2℃/小时的速率下降至所需温度，每个温度点停留30分钟，分别在-2、-4、-6、-10、-12、-14、-16℃时取出5管，放于4℃冰柜中恢复过夜，次日向每管中加入6mL ddH₂O，200转/分钟，25℃条件下摇晃12小时使之充分摇匀，测定电导率值(C1)(雷磁DDS-307电导率仪)，测毕，将各试管盖塞封口，置高压锅中高压处理10分钟，杀死植物组织。取出试管后自然冷却至室温，摇匀，测其电导值(C2)。相对电导率＝C1/C2×100％。将电解质泄露50％的电导率值所需要的温度定义为半致死温度(LT₅₀)，用LT₅₀来表示植物对低温的抗性，LT₅₀值越低说明植物耐低温能力越强。

结果如图3所示，野生型苜蓿R108的LT₅₀为-8.4±0.3℃；Mt-lncRNA208基因超表达株系208OE-1-3和208OE-8的LT₅₀分别为-13.5±0.1℃和-12.7±0.2℃；可以看出，与野生型相比，Mt-lncRNA208基因超表达株系208OE-1-3和208OE-8的半致死温度比野生型下降5.1℃和4.3℃。这表明，超表达Mt-lncRNA208基因会提高植物对低温胁迫的耐受性。另外，空载对照株系的半致死温度与野生型相比基本一致，无统计学差异。

二、存活率

将Mt-lncRNA208基因超表达株系(208OE-1-3和208OE-8)、空载对照和野生型苜蓿R108植株播种，培养21天后，放在低温培养箱中(Tenney Environmental Test Equipment,made in United States)进行冷冻处理：先在0℃平衡6小时，调至-6℃处理10小时，再在4℃过夜恢复；次日将材料转移到正常条件下，继续生长7天后对存活率进行统计。

结果如图4所示，野生型苜蓿R108的存活率为18.29％；Mt-lncRNA208基因超表达株系208OE-1-3和208OE-8的存活率分别为73.61％和66.67％；可以看出，与野生型相比，Mt-lncRNA208基因超表达株系208OE-1-3和208OE-8的存活率比野生型高55.32％和48.38％。这表明，超表达Mt-lncRNA208基因会提高植物对低温胁迫的耐受性。另外，空载对照株系的存活率与野生型相比基本一致，无统计学差异。

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 长链非编码RNA及其在调控植物耐低温中的应用

<130> GNCLN180346

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 582

<212> DNA

<213> 苜蓿（Medicago truncatula L.）

<400> 1

aggcataatt gtccctctca accaaaacct tgttataatg cttttgggtt aggtctatat 60

caaccaaaat acgtacatag tggccaagta gacggttttt tgtggattca tcaatggaaa 120

gaggggcgtc cacactagat gcaatttcaa aaagcaatgt tggtctctaa tactcttgcg 180

ggaggttcat aattcgaatc caaacttgtg catgtgaaag tttttgcttg gatggattga 240

agtcctttgt cgaacacgaa aacctcgata tgactggttt gagactcaac taccttaaag 300

accatatttt tcgcatctct tcaactgtgt taaattggcc atagagagga caatttcatg 360

taaagatcac gtgtggttag gggagaatct cccttttgaa gagttaacct atcgtgtaag 420

cttcgattac catcctctaa ctttaattca tacttctgct gagagatttt cacaataaca 480

cagtcccctt tagccatgaa attttatggg caaaatatga aaatcaacca aatcgaatca 540

acagttaaaa gaacgaaata aattttgaaa ccaagtgaca ga 582

<210> 2

<211> 582

<212> RNA

<213> 苜蓿（Medicago truncatula L.）

<400> 2

aggcauaauu gucccucuca accaaaaccu uguuauaaug cuuuuggguu aggucuauau 60

caaccaaaau acguacauag uggccaagua gacgguuuuu uguggauuca ucaauggaaa 120

gaggggcguc cacacuagau gcaauuucaa aaagcaaugu uggucucuaa uacucuugcg 180

ggagguucau aauucgaauc caaacuugug caugugaaag uuuuugcuug gauggauuga 240

aguccuuugu cgaacacgaa aaccucgaua ugacugguuu gagacucaac uaccuuaaag 300

accauauuuu ucgcaucucu ucaacugugu uaaauuggcc auagagagga caauuucaug 360

uaaagaucac gugugguuag gggagaaucu cccuuuugaa gaguuaaccu aucguguaag 420

cuucgauuac cauccucuaa cuuuaauuca uacuucugcu gagagauuuu cacaauaaca 480

caguccccuu uagccaugaa auuuuauggg caaaauauga aaaucaacca aaucgaauca 540

acaguuaaaa gaacgaaaua aauuuugaaa ccaagugaca ga 582

Claims

1.长链非编码RNA，为如下任一：

(a1)SEQ ID No.2所示的RNA；

2.能够转录成权利要求1所述长链非编码RNA的DNA。

3.根据权利要求2所述的DNA，其特征在于：所述DNA为如下中任一：

(b1)SEQ ID No.1所示的DNA；

4.含有权利要求1所述长链非编码RNA或权利要求2或3所述DNA的表达盒、重组载体或重组菌。

5.权利要求1所述的长链非编码RNA或权利要求2或3所述的DNA或权利要求4所述表达盒、重组载体或重组菌在调控植物耐低温中的应用。

6.一种培育耐低温性增强的植物的方法，包括使受体植物中权利要求1所述的长链非编码RNA的表达量升高的步骤。

7.一种培育耐低温性减弱的植物的方法，包括使受体植物中权利要求1所述的长链非编码RNA的表达量降低的步骤。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述使受体植物中权利要求1所述的长链非编码RNA的表达量升高是通过向所述受体植物中导入权利要求2或3所述的DNA来实现的；

进一步地，所述DNA是通过重组载体的形式导入所述受体植物中的。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述使受体植物中权利要求1所述的长链非编码RNA的表达量降低是通过对所述受体植物中权利要求2或3所述的DNA进行敲除或抑制表达来实现的。

10.根据权利要求5-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物。