CN106893723B - 植物双向启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物启动子BIGDB4及其应用。该启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。实验证明，将本发明的BIGDB4插入载体pMOA34‑G/L中的GUS和LUC之间后转化拟南芥和水稻，获得的转基因植株中均能检测到GUS和LUC的表达，说明启动子BIGDB4具有双向驱动目的基因转录的功能。利用本发明所提供的启动子BIGDB4能够保证多基因在表达量、表达时间和位置同一性的同时，避免多基因插入所引起的基因沉默的现象。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域中的一种植物双向启动子及其应用。
背景技术
通过导入外源基因使植物获得新的性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的。花椰菜病毒CaMV 35S启动子作为稳定、高效的外源启动子，一直被人们广泛的使用。然而在转基因过程中由于重复序列的出现会引起基因沉默现象，尤其是进行多个基因导入时，这种现象会更严重，从而严重影响了转基因植株的获得和后代的稳定性。而在进行两个或两个以上基因导入时，通常需要这些基因在表达量、表达时间和位置方面的同一性，进而确保转入基因行使正常的功能，使用35S启动子很难达到这样的要求。这些都是植物基因工程中亟待解决的问题。
对于转基因引起的基因沉默现象人们已经有了比较深入的认识，引起转基因沉默有多种因素，其中最主要的就是重复序列的产生，尤其是多个基因导入时，更人为的造成了多个35S启动子插入的情况，对此至今尚无有效的解决方法。随着基因组学的发展，多种生物基因组测序已完成，经过生物信息学分析人们发现了双向启动子的存在，这为我们利用植物自身的双向启动子进行转基因操作，从而避免多基因插入引起的基因沉默现象提供了可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种植物双向启动子。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种DNA分子。
上述DNA分子为植物启动子BIGDB4，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其核苷酸序列如下1)或2)或3)所示：
1)序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
2)在高严谨条件下与序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；
3)与所述1)或2)的核苷酸序列具有65％以上的同一性，且具有启动子活性的核苷酸序列；具体的，所述同一性为90％以上；再具体的为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。
其中，序列表中的SEQ ID No.1所示的核苷酸序列由546个脱氧核糖核苷酸组成。
上述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12h；弃杂交液，加入洗膜液Ⅰ(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液Ⅱ(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。
本发明的DNA分子(启动子活性片段)还包括与序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列互补的核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之意。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的调控片段的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的调控片段的核苷酸序列65％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的DNA分子的核苷酸序列具有65％或更高，优选地75％或更高，更优选地85％或更高，甚至更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
为了解决上述问题，本发明还提供了含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组微生物。
上述表达盒中含有两个目的基因；上述DNA分子位于上述两个目的基因之间；上述DNA分子启动上述两个目的基因转录。
上述两个目的基因可为相同或不同基因。
上述目的基因可为报告基因如GUS基因、GFP基因或LUC基因。
上述重组载体可为重组克隆载体或重组表达载体。
上述重组表达载体可为将上述DNA分子或表达盒构建到现有植物表达载体上得到。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。
所述重组载体具体可为pMOA34-G/L-BIGDB4或pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)，是将SEQID No.1所示的核苷酸序列插入到中间载体pMOA34-G/L的多克隆位点间得到的；所述中间载体pMOA34-G/L是将GUS基因和LUC基因分别插入pMOA34载体的多克隆位点得到的。
上述转基因细胞系不包括繁殖材料。
上述重组微生物可为重组菌或重组病毒。
本发明还提供了上述DNA分子在作为启动子中的应用。
上述应用中，所述启动子为双向启动子。
本发明还提供了上述DNA分子和含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在驱动目的基因在植物体内转录中的应用。
上述应用中，所述驱动目的基因在植物体内转录为双向驱动两个目的基因在植物体内转录。
本发明还提供了上述DNA分子和含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在培育转基因植物中的应用。
上述应用可通过重组载体pMOA34-G/L-BIGDB4或pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)导入植物中实现。
上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥；所述单子叶植物具体为水稻。
本发明通过实验证明，启动子BIGDB4可同时启动两个基因的高效转录，具有双向驱动目的基因转录的功能。利用本发明所提供的启动子能够保证多基因在表达量、表达时间和位置等方面同一性的同时，避免多基因插入所引起的基因沉默的现象。为植物的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1为pMOA34-G/L-BIGDB4植物双元载体图谱。
图2为转基因拟南芥GUS染色结果。
A为四叶真叶期幼苗；B为花序；C为子叶期幼苗；D为两片真叶期幼苗。
图3为转基因拟南芥LUC分析结果。
图4为转基因水稻GUS染色结果。
A为转BIGDB4水稻植株；B为转BIGDB4(REV)水稻植株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia-0生态型：Arabidopsis BiologicalResource Center(ABRC)，种子号：CS28166。
载体pMOA34(Barrell,P.J.and Conner,A.J.(2006)Minimal T-DNA vectorssuitable for agricultural deployment of transgenic plants.Biotechniques.41(6):708-10.)公众可从中科院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
载体pCambia1300-221(Gao T,Wu Y,Zhang Y,Liu L,Ning Y,Wang D,Tong H,Chen S,Chu C and Xie Q.(2011)OsSDIR1overexpression greatly improves droughttolerance in transgenic rice.Plant Mol Biol.76(1-2):145-56.)公众可从中科院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、启动子BIGDB4序列的获得
提取拟南芥Columbia-0的基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增引物如下：
BIGDB4-F:5'-GAGCTCTAGAGCGGCCGCTCCTCTTCCGTCAACATCTTCTTCACC-3；
BIGDB4-R:5'-ACGCGTCGACGAGAGATCGTCGTAGCACTGTAGTG-3'。
其中，引物BIGDB4-F序列中的下划线部分为NotⅠ的识别位点，引物BIGDB4-R序列中的下划线部分为SalⅠ的识别位点。
扩增产物进行琼脂糖电泳分离，回收纯化目的条带，将其连接到pEASY-T1(全式金公司)克隆载体上进行测序。测序结果表明：该扩增片段含有SEQ ID No.1所示的核苷酸片段，将SEQ ID No.1所示的核苷酸片段命名为BIGDB4启动子。将连接有该扩增片段的载体命名为重组克隆载体pEASY-T1-BIGDB4。
实施例2、重组表达载体(pMOA34-G/L-BIGDB4和pMOA34-G/L-BIGDB4(REV))的构建
一、带标记基因的中间载体(pMOA34-G/L)的构建
1、GUS基因的获得
以pCambia1300-221载体为模板，利用引物GUS-F:5'-ACGCGTCGACATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAAC-3'和GUS-R:5'-CAGCCGACCGGTTCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3'进行PCR扩增，扩增得到1812bp的扩增产物，经测序鉴定该扩增产物含有GUS基因。
2、中间载体pMOA34-G的构建
用SalⅠ和AgeⅠ双酶切步骤1中的扩增产物，回收含有GUS基因的酶切产物，与经SalⅠ和AgeⅠ双酶切中间载体pMOA34-G获得的载体pMOA34的骨架片段连接，获得中间载体pMOA34-G。经酶切和测序证实，中间载体pMOA34-G在pMOA34的多克隆位点SalⅠ和AgeⅠ间插入了GUS基因片段。
3、中间载体pMOA34-G/L的构建
将pGL3-Enhancer Vector(Promega公司)经XbaⅠ酶切后补平，再进行XhoⅠ酶切回收含有LUC基因的片段。
将中间载体pMOA34-G经SpeⅠ酶切后补平，再进行XhoⅠ酶切，得到中间载体pMOA34-G的骨架片段。
将含有LUC基因的片段与pMOA34-G的骨架片段连接，获得中间载体pMOA34-G/L。经酶切和测序证实，中间载体pMOA34-G/L在pMOA34-G的SpeⅠ和XhoⅠ位点间插入了LUC基因片段，且LUC基因位于GUS基因上游。
二、重组表达载体pMOA34-G/L-BIGDB4的构建
用SalⅠ和NotⅠ分别双酶切实施例1获得的重组克隆载体pEASY-T1-BIGDB4和中间载体pMOA34-G/L，分别回收含有BIGDB4启动子的酶切片段和中间载体pMOA34-G/L的骨架片段，将二者用T4DNA连接酶连接获得重组表达载体。经酶切和测序证实，该重组表达载体为将中间载体pMOA34-G/L的NotⅠ和SalⅠ位点间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段(即启动子BIGDB4)，将该重组表达载体命名为pMOA34-G/L-BIGDB4，其结构示意图见图1。该重组表达载体pMOA34-G/L-BIGDB4的T-DNA区中表达盒自RB向LB依次含有LUC基因、BIGDB4启动子(正向序列)和GUS基因。
三、重组表达载体pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)的构建
以实施例1获得的重组克隆载体pEASY-T1-BIGDB4为模板，利用引物BIGDB4-F2:5'-GAGCGTCGACTCCTCTTCCGTCAACATCTTCTTCACC-3'和BIGDB4-R2:5'-ACGCGCGGCCGCGAGAGATCGTCGTAGCACTGTAGTG-3'(引物BIGDB4-F2序列中的下划线部分为SalⅠ的识别位点，引物BIGDB4-R2序列中的下划线部分为NotⅠ的识别位点。)进行PCR扩增，得到含有BIGDB4启动子的扩增产物。经测序鉴定后，用SalⅠ和NotⅠ分别双酶切含有BIGDB4启动子的扩增产物和中间载体pMOA34-G/L，分别回收含有BIGDB4启动子的酶切产物和中间载体pMOA34-G/L的骨架片段，并将二者相连，获得重组表达载体。经酶切和测序证实，该重组表达载体为将中间载体pMOA34-G/L的NotⅠ和SalⅠ位点间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段的反向序列(即启动子BIGDB4的反向序列)，将该重组表达载体命名为pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)。该重组表达载体pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)的T-DNA区中表达盒自RB向LB依次含有LUC基因、BIGDB4启动子(反向)和GUS基因。
实施例3、BIGDB4启动子的功能验证
一、转基因拟南芥的获得及表型鉴定
(一)转基因拟南芥的制备
1、将重组表达载体pMOA34-G/L-BIGDB4和pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)以及中间载体pMOA34-G/L(空载体对照)分别电击转化农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pMOA34-G/L-BIGDB4、EHA105/pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)和EHA105/pMOA34-G/L。
2、28℃过夜培养步骤1的重组农杆菌并调整其浓度为OD600＝1.0的菌液。
3、分别利用重组农杆菌EHA105/pMOA34-G/L-BIGDB4、EHA105/pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)和EHA105/pMOA34-G/L通过花序真空渗透法转化拟南芥Columbia-0(即Col-0)，转化后的拟南芥植株用塑料膜覆盖1天，保持湿润。然后将转化后的拟南芥植物放于22-25℃的光照条件下使其正常生长。分别收获转化重组表达载体pMOA34-G/L-BIGDB4、pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)和中间载体pMOA34-G/L的拟南芥植株所结的种子。
4、将收获得到的转化重组表达载体pMOA34-G/L-BIGDB4、pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)和中间载体pMOA34-G/L的拟南芥植株所结的种子分别播种于含潮霉素(20mg/L)的1/2MS培养基上进行筛选，得到具有潮霉素抗性的T1代转BIGDB4和转BIGDB4(REV)的拟南芥植株和转空载体的对照植株。分别收获T1代转BIGDB4和转BIGDB4(REV)的拟南芥植株和转空载体的对照植株的所结的种子，得到T2代转BIGDB4和转BIGDB4(REV)的拟南芥种子和转空载体对照植株的种子。
(二)转基因拟南芥中BIGDB4启动子的功能验证
1、GUS染色鉴定
分别选取上述步骤中获得的10个不同株系的转BIGDB4和转BIGDB4(REV)的拟南芥的T2代种子，于1/2MS培养基上萌发并生长。分别选取子叶期、两片真叶期及四叶真叶期的拟南芥幼苗全株和成株期拟南芥的花序进行GUS染色。同时选取相对应时期的野生型拟南芥Col-0和T2代转空载体对照植株的全株及器官(各10株)作为阴性对照，进行GUS染色。结果表明转BIGDB4和转BIGDB4(REV)的拟南芥植株，在不同发育时期以及不同组织部位均被染成蓝色，染色结果见图2。而转空载体对照植株的表型与Col-0一致，其所对应的发育时期和组织部位均未被染色。由此可知，BIGDB4启动子确实可以双向驱动GUS基因在拟南芥体内转录。
2、LUC发光分析
分别选取GUS表达的5个不同株系的转BIGDB4和转BIGDB4(REV)的拟南芥以及野生型拟南芥Col-0和转空载体对照植株的T2代种子，于1/2MS培养基上萌发并生长，选取生长2周幼苗进行LUC发光分析。
结果表明：转BIGDB4和转BIGDB4(REV)的拟南芥植株中均检测到LUC表达(请参见图3)。转空载体对照植株与野生型拟南芥Col-0的表型一致，其体内均未检测到LUC表达。由此可知，BIGDB4启动子确实可以双向驱动LUC基因在拟南芥体内转录。
二、转基因水稻的获得及表型鉴定
(一)转基因水稻的制备
利用步骤一中获得的重组农杆菌EHA105/pMOA34-G/L-BIGDB4、EHA105/pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)和EHA105/pMOA34-G/L分别转化日本晴水稻愈伤组织，在愈伤组织分化出的芽长至3-5cm时，移入附加50mg/L潮霉素的生根培养基(MS+50mg/L潮霉素)中，26±1℃光照培养生根；幼苗长至约8-10cm高，培养瓶开盖炼苗1-2天，洗去根部植物凝胶，种植于田间，常规管理，成熟收种，分别获得T1代转BIGDB4、转BIGDB4(REV)和转空载体对照的水稻种子。
(二)转基因水稻中BIGDB4启动子的功能验证
分别选取野生型、T1代转BIGDB4、T1代转BIGDB4(REV)和T1代转空载体对照的水稻种子，于1/2MS培养基上萌发并生长。待叶片长到3-5cm时各取幼苗5株进行GUS染色分析。
结果表明：转BIGDB4和转BIGDB4(REV)的水稻植株幼苗，均有GUS表达，但是在转BIGDB4和转BIGDB4(REV)的水稻植株幼苗中，GUS表达的部位有所不同。染色结果见图4。而野生型水稻与转空载体对照水稻植株的表型一致，其各个组织部位均未被染色。由此可知，BIGDB4启动子确实能够双向驱动GUS基因在水稻体内转录。
Claims (10)
1.DNA分子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示。
2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒中含有两个目的基因；所述DNA分子位于所述两个目的基因之间；所述DNA分子启动所述两个目的基因转录。
4.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。
5.含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞系。
6.含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物。
7.权利要求1所述的DNA分子在作为启动子中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述启动子为双向启动子。
9.权利要求1所述的DNA分子、权利要求2或3所述的表达盒、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的转基因细胞系或权利要求6所述重组微生物在驱动目的基因在植物体内转录的应用。
10.权利要求1所述的DNA分子、权利要求2或3所述的表达盒、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的转基因细胞系或权利要求6所述重组微生物在培育转基因植物中的应用。
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| Searching for bidirectional promoters in Arabidopsis thaliana;Quan Wang等;《BMC Bioinformatics》;20090130;第10卷(第Suppl I期);第1-10页 * |
| 小盐芥HKT1基因家族的结构和表达研究;邵琳;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20150115;第A006-308页 * |
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