CN116103313B - 一种拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因及其应用、蛋白质、重组载体和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因及其应用、蛋白质、重组载体和方法，属于基因工程技术领域。所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明利用农杆菌介导的遗传转化方法，将拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在杨树体内超量表达，通过对转基因杨树进行RNA水平鉴定与表型鉴定，成功获得金叶的84K杨树。本发明采用基因工程手段，与传统育种方式相比，大大缩短了育种年限，且育种效率高。本发明获得的‘金叶’杨树，在园林植物新资源培育具有创新性，丰富园林绿化彩叶植物，具有较高的经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因及其应用、蛋白质、重组载体和方法。
背景技术
在植物生命周期中，叶片的生长、发育以及衰老过程通常伴随着由色素沉积导致的明显的颜色变化，从浅黄色到绿色，然后从绿色到黄色或棕色，这主要是由叶绿素（Chl）含量最初的上升和随后的下降所致。Chl 是绿色植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，在光能捕获和能量传递以及叶色调控中起着重要作用。Chl主要被位于叶绿体类囊体膜上光系统I和II（PS I和PS II）核心及其外围的捕光复合物（light-harvesting complexes，LHC）蛋白所结合，Chl吸收光能并将激发能传递给相邻的色素分子进而在 PS 反应中心启动光化学反应。合成并积累足够数量的 Chl 对于叶绿体光合能力的建立是至关重要的，同时自由态的 Chl 及其代谢中间产物的降解调控对于 PS-LHC 释放的自由 Chl 解读至关重要。光捕获复合物（LHC）蛋白家族包括LHC家族、LHC-like家族和光系统II亚基S（Psbs），均都包含一个或两个保守的Chl结合基序。LHC-like家族包括早期光诱导蛋白（Elips）、类光捕获蛋白3 （Lil3s）、单螺旋蛋白（Ohps）和胁迫增强蛋白（Seps）。目前仅报道了Elips、Lil3s和Ohps的Chl结合能力和生物学功能，Seps的作用仍然未知。
对于Chl合成和代谢的深入研究有助于我们了解植物自身叶色表型调控的分子生理机制，而对这些关键调控基因的鉴定和功能解析则有助于观赏植物‘彩叶育种’的遗传改良利用。在园林造景中，彩叶树种种类较为稀缺。杨树因其生长特性以及所具有的多种抗性，在园林领域被广泛作为行道树和造景树应用，若能挖掘出影响Chl代谢的关键基因，通过基因工程调控该基因，获得Chl减少的‘金叶’杨树，将取得良好的应用前景和经济效益。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因及其应用、蛋白质、重组载体和方法，所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因具有改良杨树叶色的作用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因，所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在改良杨树叶色中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在降低杨树叶片叶绿素含量中的应用。
优选的，所述叶绿素包括叶绿素a和叶绿素b。
本发明还提供了上述技术方案所述的拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在降低杨树叶片类胡萝卜素含量中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在培育杨树具有金叶表型育种中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种重组载体，将上述技术方案所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因插入到植物表达载体pCAMBIA1300中得到。
本发明还提供了一种获取具有金叶表型杨树的方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述的重组载体采用农杆菌浸染法转化到杨树中，得到具有金叶表型的杨树。
优选的，所述农杆菌包括农杆菌EHA105。
本发明的有益效果为：
本发明利用农杆菌介导的遗传转化方法，将拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在杨树体内超量表达，通过对转基因杨树进行RNA水平鉴定与表型鉴定，成功获得金叶的84K杨树，84K杨树为最新一代白杨派杨树新品种，生根容易、苗期与幼树生长快、材质好、抗风能力及抗性强、适应性广。本发明采用基因工程手段，通过农杆菌介导的方法获得转基因杨树（见实施例2），从农杆菌侵染到获得转基因杨树幼苗只需要短短2-3个月，与传统育种方式相比，大大缩短了育种年限，且获得阳性植株概率较高，提高了育种效率。本发明获得的‘金叶’杨树，在园林植物新资源培育具有创新性，丰富园林绿化彩叶植物，具有较高的经济价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为植物表达载体1300图谱；
图2为AtSep2基因结构图；
图3为AtSep2基因序列及结构与分析；
图4为AtSep2克隆电泳图；
图5为84K杨树遗传转化过程；
图6为AtSep2转基因84K杨树鉴定电泳图；
图7为AtSep2转基因84K杨树表型；
图8为AtSep2转基因84K杨树叶绿素含量；
图9为AtSep2转基因84K杨树叶绿素荧光参数。
实施方式
本发明提供了一种拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因，所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
atggctatggctacgcgagcgattcgataccagttaccgtcaccgagatttagagctcctagatgcgaatcatcggaaccgattaagcagattcagatccagcaacgaccaagaggtggcgatttagccgagaacgggaagatcgtgctccaaccaaggctttgcacgctgagatcttatggatctgatatggtcatcgctaaaaaggacggcggagatggtggaggaggaggatctgatgttgagttagcgtctccgttttttgagacgcttacggattacatagagagttcgaagaagagtcaggatttcgaaaccatctccggtagactcgccatgattgtatttgcggtgacggtgacggaggagattgttacggggaactcgttgtttaagaaactagatgtggaaggattgagtgaagctattggagctggtctcgccgcgatgggatgcgcggcgatgtttgcttggttaacgatttctcggaacagagtcggacggatctttacagtgagttgcaactcgttcattgactcgttggttgatcagatcgttgatggactgttctacgataccaagcctagtgattggtctgatgatctttaa。
在本发明中，所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因是拟南芥第二条染色体上的一个光应答基因，基因编号为NP_565524.1（NCBI编号），AT2G21970（TAIR编号）。AtSep2基因组DNA全长687 bp，共有2个外显子1个内含子，外显子序列如SEQ ID No.3所示（黑色加粗字体），内含子序列如SEQ ID No.3所示（非加粗字体），其结构见图2。AtSep2含有两个跨膜结构域，与LHC-like家族成员一样，含有一个保守的叶绿素结合基序E/D××GR，其结构见图3。
SEQ ID No.3：
atggctatggctacgcgagcgattcgataccagttaccgtcaccgagatttagagctcctagatgcgaatcatcggaaccgattaagcagattcagatccagcaacgaccaagaggtggcgatttagccgagaacgggaagatcgtgctccaaccaaggctttgcacgctgagatcttatggatctgatatggtcatcgctaaaaaggacggcggagatggtggaggaggaggatctgatgttgagttagcgtctccgttttttgagacgcttacggattacatagagagttcgaagaagagtcaggatttcgaaaccatctccggtagactcgccatggtaattagacactaaaccttaaattagaaactcgatctcggttttagtcggtttaattcgtaaatttactgttttcagattgtatttgcggtgacggtgacggaggagattgttacggggaactcgttgtttaagaaactagatgtggaaggattgagtgaagctattggagctggtctcgccgcgatgggatgcgcggcgatgtttgcttggttaacgatttctcggaacagagtcggacggatctttacagtgagttgcaactcgttcattgactcgttggttgatcagatcgttgatggactgttctacgataccaagcctagtgattggtctgatgatctttaa。
在本发明中，所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因的获取方法优选包括：以拟南芥cDNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增，得到拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因。在本发明中，所述上下游引物的核苷酸序列具体如下：
AtSep2-F（SEQ ID No.4）：5-ATGGCTATGGCTACGCGAGC-3 20 mer；
AtSep2-R（SEQID No.5）：5-TTAAAGATCATCAGACCAATCACTA-3 25 mer；
本发明优选在拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因添加酶切位点的引物序列，添加的酶切位点分别为Kpn 1和Sal 1，其引物序列碱基具体如下：
AtSep2-F- Kpn 1（SEQ ID No.6）：
5-GGTACCATGGCTATGGCTACGCGAG-3 25mer；
AtSep2-R- Sal 1（SEQ ID No.7）：
5- GTCGACAAGATCATCAGACCAATCACT-3 27mer。
本发明还提供了上述技术方案所述的拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在改良杨树叶色中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在降低杨树叶片叶绿素含量中的应用。在本发明中，所述叶绿素优选包括叶绿素a和/或叶绿素b。
本发明还提供了上述技术方案所述的拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在降低杨树叶片类胡萝卜素含量中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在培育杨树具有金叶表型育种中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
MAMATRAIRYQLPSPRFRAPRCESSEPIKQIQIQQRPRGGDLAENGKIVLQPRLCTLRSYGSDMVIAKKDGGDGGGGGSDVELASPFFETLTDYIESSKKSQDFETISGRLAMIVFAVTVTEEIVTGNSLFKKLDVEGLSEAIGAGLAAMGCAAMFAWLTISRNRVGRIFTVSCNSFIDSLVDQIVDGLFYDTKPSDWSDDL。
本发明还提供了一种重组载体，将上述技术方案所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因插入到植物表达载体1300中，得到。本发明优选将所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因插入到植物表达载体1300的Kpn 1和Sal 1位点之间。本发明对所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因插入到植物表达载体1300中的方法没有特殊限定，本领域技术人员依据常规即可。
本发明还提供了一种获取具有金叶表型杨树的方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述的重组载体采用农杆菌浸染法转化到杨树中，得到具有金叶表型的杨树。在本发明中，所述农杆菌优选包括农杆菌EHA105。本发明对所述重组载体采用农杆菌浸染法转化到杨树中的方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规方法即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因（以下简称AtSep2基因）克隆与表达载体构建：
RNA提取
取适龄大小的拟南芥叶片于离心管中，液氮速冻，用组织研磨器研磨5次，每次30s。
向离心管中加入1 ml RNAiso Plus（TaKaRa 9108），用涡旋振荡仪混匀，冰上静置5 min。
像离心管中加入200 μl氯仿，震荡15 s，静置2-3 min。
将样品在4 °C，12000 r条件下离心15 min，此时产生相分离，取上层水相于新离心管中，并记录吸取上清的体积，RNA在该水相中。
向离心管中加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，静置10 min。
12000 r，4 °C离心10 min，去掉上清，此时管底有白色沉淀，即RNA。
加入500 μl DEPC水配置的75%酒精洗涤沉淀，并离心2 min，弃上清，重复两遍该步骤。
再次离心，用移液器吸走残留液体，将离心管开盖晾数分钟，直至管底液体无残留。
向沉淀中加入30 μl RNase free ddH2O溶解沉淀，即得到拟南芥RNA。
RNA浓度测定
用赛默飞超微量分光光度计测定RNA浓度。
3. 反转录
取2 μg拟南芥RNA进行反转录，反转录采用TaKaRa公司的PrimeScriptTM Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit。
4. 基因扩增
以cDNA为模板进行PCR，扩增体系如下：
表1 扩增体系
| 反应组分 | 体积（μl） |
| PreMix Extaq（TaKaRa） | 10 |
| AtSep2-F | 1 |
| AtSep2-R | 1 |
| cDNA | 1 |
| H2O | 7 |
PCR程序按照94℃预变性3 min；94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min。
之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图4，并对扩增产物进行回收。16℃过夜连接PMD-19T载体，并转化大肠杆菌，挑取阳性单克隆鉴定。并摇菌扩繁提出AtSep2-PMD19T质粒。
5. 构建表达载体
以AtSep2-PMD-19T质粒为模板进行PCR，扩增体系如下：
表2 扩增体系
| 反应组分 | 体积（μl） |
| PreMix Extaq（TaKaRa） | 10 |
| AtSep2-F- Kpn 1 | 1 |
| AtSep2-R-Sal 1 | 1 |
| cDNA | 1 |
| H2O | 7 |
PCR程序按照94℃预变性3 min；94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min。
之后进行琼脂糖凝胶电泳，并对扩增产物进行回收。16℃过夜连接PMD-19T载体，并转化大肠杆菌，挑取阳性单克隆鉴定。并摇菌扩繁提出AtSep2（Kpn 1、Sal 1）-PMD19T质粒。
将AtSep2（Kpn 1、Sal 1）-PMD19T质粒，1300空载体质粒进行双酶切，酶切体系如下：
表3 酶切体系
| 反应组分 | 体积（μl） |
| 质粒 | 20 |
| Kpn 1 | 1 |
| Sal 1 | 1 |
| Buffer | 5 |
| H2O | 23 |
37℃反应40 min，分别进行琼脂糖凝胶电泳，回收基因片段与载体片段。进行表达载体的连接，体系如下：
表4 连接体系
| 反应组分 | 体积（μl） |
| AtSep2片段 | 3 |
| 1300酶切产物 | 5 |
| T4 | 1 |
| Buffer | 1 |
16℃过夜连接，并转化大肠杆菌，挑取阳性单克隆鉴定，摇菌扩繁提出AtSep2-1300质粒。将测序正确的AtSep2-1300质粒转入农杆菌EHA105备用。
实施例
84K杨树的遗传转化与阳性苗鉴定
1. 84K杨树的遗传转化
将存好的转AtSep2-1300农杆菌活化，摇瓶（50 ml YEP + 50 μl Kana），菌液摇至OD值0.6-0.8待用。选取适龄大小的84K杨树组培苗若干瓶，将大小适合的叶片全部切下泡入液体分化培养基（wpm + 0.03 mg/L 6-BA+0.02 mg/L IBA + 0.001 mg/L TDZ）中，同时在平皿中倒入液体分化培养基，依次夹取叶片在平皿中切割，在叶片垂直叶脉处，叶柄处，叶片四周各切一刀，切好全部叶片备用。将菌液5000 rmp，常温10 min离心，去除上清，用液体分化培养基重悬菌液。析出平皿中原本培养基，加入重悬好的菌液侵染叶片25 min，侵染后的叶片放到固体分化培养基中，暗培养约三天。
三天洗去叶片表面农杆菌，分别用无菌水洗1遍，头孢水（200 mg/L）洗4-5遍，wpm洗1遍，之后将叶片放入固体筛选培养基（wpm + 0.03 mg/L 6-BA + 0.02 mg/L IBA +0.001 mg/L TDZ+ 200 mg/L头孢菌素、200 mg/L特美汀、3 mg/L潮霉素）中，暗培养。此后每周将叶片移入新的筛选培养基，至有白色抗性芽出现，将其放于光照下培养，根据情况依次减少TDZ浓度，直至抗性芽长大成苗，将其放到生根培养基（1/2 MS + 200 mg/L特美汀 + 3mg/L潮霉素 + 200 mg/L头孢）中，待长出根，成为一棵独立植株，进行鉴定。遗传转化过程如图5所示。
2. 84K杨树RT-PCR鉴定
取待鉴定杨树组织，按上述方法提取RNA，并进行反转录。
对反转录后cDNA进行下述PCR：
表5 反应体系
| 反应组分 | 体积μl |
| PreMix Extaq （TaKaRa） | 10 |
| AtSep2-F- Kpn 1 | 1 |
| 1300R（SEQ ID No.8） | 1 |
| cDNA | 1 |
| H2O | 7 |
SEQ ID No.8：gctgaacttg tggccgttta c。
PCR程序按照94℃预变性3 min；94℃变性30s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min。同时以杨树的Actin作为内参进行PCR，将PCR产物进行电泳，条带位置与阳性对照一致则为转基因植株，电泳结果如图6所示，得到三个转基因株系。
实施例3
转基因84K杨树表型观察与生理测定
过表达AtSep2基因的84K杨树，出现明显的‘金叶’表型，如图7所示，且新生叶片表型明显。
各取0.1 g叶片，剪碎放入95%乙醇中，4°避光提取叶绿素，待叶片发白，取上清并用分光光度计测定665 nm、949 nm、470 nm波长下的吸光值，根据公式计算出叶绿素a，叶绿素b与类胡萝卜素含量：
Ca=13.95A665-6.8A649
Cb=24.9A649-7.32A665
Cx.c=（1000A470-2.05Ca-114.8Cb）/248
如图8所示，转基因杨树的三个株系叶绿素a，叶绿素b和类胡萝卜素与野生杨树相比有极明显的降低（具体数值见表6）。与野生杨树相比，转基因杨树具有较低的最小光化学效率（F0，表示最小荧光产量，是PSII反应中心完全开放时时的荧光水平），但却具有较大的最大光合能力（Fv/Fm，最大光和量子产量，数值高意味着PSII反应中心原初光能转化能力强，对光能有较高的利用潜力），并且具有较高的非光化学淬灭指数（NPQ）（具体数值见表7），如图9所示，说明转基因杨树在具有金叶表型的同时，也具有较大的光保护能力。
表6 84K杨树光合色素含量
| Chl a（mg/g） | Chl b（mg/g） | Chl x.c（mg/g） | |
| WT | 0.549±0.010 | 0.182±0.003 | 0.126±0.002 |
| AtSep2#1 | 0.122±0.007 | 0.022±0.002 | 0.056±0.003 |
| AtSep2#2 | 0.117±0.002 | 0.023±0.001 | 0.045±0.001 |
| AtSep2#3 | 0.175±0.004 | 0.033±0.000 | 0.077±0.002 |
表7 84K杨树NPQ值
| WT | AtSep2 | |
| NPQ_L1 | 0.07±0.006 | 0.227±0.007 |
| NPQ_L2 | 0.367±0.030 | 0.837±0.019 |
| NPQ_L3 | 0.343±0.041 | 1.08±0.035 |
| NPQ_L4 | 0.287±0.032 | 1.097±0.054 |
| NPQ_Lss | 0.263±0.023 | 1.03±0.066 |
| NPQ_D1 | 0.267±0.020 | 0.46±0.041 |
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.一种拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在改良杨树叶色中的应用，其特征在于，所述杨树叶色改良为金叶表型，所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在降低杨树叶片叶绿素含量中的应用，所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述叶绿素包括叶绿素a和叶绿素b。
4.一种拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因在降低杨树叶片类胡萝卜素含量中的应用，所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.一种获取具有金叶表型杨树的方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组载体采用农杆菌浸染法转化到杨树中，得到具有金叶表型的杨树；所述重组载体通过将拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因插入到植物表达载体pCAMBIA1300中得到；所述拟南芥捕光色素结合蛋白AtSep2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述农杆菌包括农杆菌EHA105。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020252167A1 (en) * | 2019-06-11 | 2020-12-17 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods of producing plants with altered fruit development and plants derived therefrom |
| CN112625098A (zh) * | 2020-09-04 | 2021-04-09 | 西北农林科技大学 | 一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Heddad,M. 等.Arabidopsis thaliana stress enhanced protein 2 (SEP2) mRNA, complete cds * |
| Light stress-regulated two-helix proteins in Arabidopsis thaliana related to the chlorophyll ayb-binding gene family;Mounia Heddad 等;《PNAS》;第3741-3746页 * |
| nuclear gene for chloroplast product.《GenBank Database》.2000,Accession NO. AF133717.1. * |
| Sep2, a light-harvesting complex-like protein, is involved in light stress response by binding to free chlorophylls;Lulu Ren 等;《Environmental and Experimental Botany》;第1-11页 * |
| 拟南芥逆境响应蛋白SEP1的初步研究;董文丹 等;《上海师范大学学报（自然科学版）》;第461-467页 * |
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