CN112625098A - 一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39及其应用 - Google Patents

Abstract

提供一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39及其应用，所公开的基因完整开放阅读框序列全长741bp，编码247个氨基酸。构建了pCAMBIA2300‑35S‑VvMADS39过量表达载体和其在番茄中同源编辑载体CRISPR/Cas9‑SlMADS39，并通过叶盘转化法将其转入模式植物番茄Micro‑Tom。结果发现过量表达VvMADS39的转基因番茄果实和种子变小，其同源敲除植株番茄无法形成正常的果实和种子。研究发现VvMADS39基因是通过与VvMADS21相互作用共同调控种子的发育。所公开的发明是基因VvMADS39用于葡萄无核新品种开发的应用。

Description

一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39及其应用

技术领域

本发明属植物生长发育基因的鉴定及基因工程技术领域，具体涉及一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39。

背景技术

MADS-box基因编码的蛋白是一类成员数目众多且广泛存在于真核生物体中的转录因子家族,该家族基因都含有一段50～60个氨基酸序列高度保守的“MADS盒子”,由于此保守结构最早在酵母MCM 1、拟南芥的AGAMOUS、金鱼草花器官特征基因DEFICIENS及人类血清应答因子SRF4中发现,因此以这四类家族成员的第一个字母将其命名为MADS-box基因。实验表明,该家族基因通过与其他转录因子相互作用形成同源或异源二聚体,在植株生长发育的诸多方面起重要调控作用：例如决定根的生长发育和顶端分生组织的分化、调控开花时间和花器官的发育、影响果实成熟和裂区的形成、影响胚珠及果实的发育。其实,MADS-box转录因子的功能已涉及到了植物生长发育的各个方面,决定着植物的产量、品质、抗性等多种农艺性状,其功能是通过与其他转录因子相互作用形成高度有序的同源或异源二聚体的方式实现的,其机理是相当复杂的,因此我们要加大力度研究其作用机理,要从整体水平上弄清MADS-box转录因子的上游和下游基因,形成一个综合的调控网络。

葡萄是世界性普遍栽种的经济果树之一，尤其在人们证实葡萄浆果中的白藜芦醇为各类水果之首及白藜芦醇在防治心血管疾病及预防癌症方面的重要医疗保健作用后，更加促进了市场对葡萄及相关产品的消费。国际市场上，无核葡萄已成为产业发展及育种研究的热点方向。目前存在的突出问题是无核品种单一，特别缺乏优质大粒、红色无核葡萄新品种。因此，挖掘葡萄无核基因并阐述其调控机理，对于通过转基因技术培育无核葡萄新品种、创建无核葡萄新种质，具有重要的理论和育种实践意义。

在高等双子叶植物中，最早对植物MADS-box基因功能的研究主要集中在花上,研究发现它调控了植株从营养生长到生殖生长的转换、对光周期的反应、开花时间、花器官的形成、花粉的发育及育性等等。从营养生长向生殖生长的转变一直到心皮和种子的发育，MADS-box基因家族参与了全部的过程。近年来，通过对矮牵牛和拟南芥研究发现了一些与胚珠发育相关的基因，并发现其中许多都属于MADS-box基因。除此之外，研究者指出葡萄种子形态发生调控基因VviAGL11上的Arg197Leu突变与无籽果实性状完全关联。由此可见，MADS-box转录因子在植物花，果实和种子发育过程中都发挥着重要调控作用，为本实验的开展提供了理论支撑。

关于葡萄无核基因、无核性状形成的分子机理，无核性状形成过程中差异表达基因数量、种类及其调控路径等重要科学问题仍不清楚。建立在新一代Illumina高通量测序平台基础上RNA-Seq技术已成为基因表达和转录组分析的重要手段。通过参考转录组结果以及种子发育相关的同源基因功能分析，对无核性状相关基因的发现具有重要意义。

本研究以课题组前期有核，无核葡萄杂交后代胚珠发育关键时期的转录组为依据，筛选出MADS-box家族基因。在此基础上，进行了VvMADS39在有核葡萄品种红地球和无核品种无核白中的组织器官及胚珠发育不同时期的定量表达。结果发现VvMADS39在无核品种中较有核品种高表达，这暗示着该基因参与植物的生长并且对葡萄无籽的形成贡献较大。原位杂交实验也说明该基因调控葡萄胚珠发育过程。遗传转化番茄获得稳定的过表达株系及基因编辑株系，旨进行基因功能研究及VvMADS39基因对果实和胚珠发育的调控机制，为转基因技术培育无核葡萄新品种提供理论依据。

发明者将携带VvMADS39基因编码区的过量表达载体转入番茄中，分析转基因番茄表型及基因功能。与未转基因番茄相比较，转基因番茄在果实和种子大小上存在显著性差异，转基因株系果实比较小，并且种子也变小。通过敲除VvMADS39在番茄中的同源基因发现，编辑株系在生理发育过程中与转基因株系未见不同，但进入生殖期之后表型出现明显差异。显微观察发现，敲除株系花粉粒发育畸形，活力低，几乎不能正常授粉受精。除此之外，编辑株系不能形成正常的花瓣，在畸形果实的基础上再次形成二次花，二次果，无法形成种子。综合上述结果推测VvMADS39基因调控了生殖生长，参与了果实和种子的发育。

基因处于一个复杂的调控网络之中，通常会协同发挥作用。特别是MADS-box基因家族会通过与其他转录因子相互作用形成高度有序的同源或异源二聚体的方式实现对发育过程的调节。与MADS-box蛋白转录因子结合的不仅可以是一般的结构基因，而且也可以是MADS-box基因家族本身。在本研究中，通过酵母双杂交筛选出侯选互作基因VvMADS21，并且通过BiFC和Co-IP技术手段进行了验证。在MADS-box基因家族中，VvMADS21与VviAGL11同属于AP3-PI亚家族，同源相似性较高，而近年来VviAGL11上的Arg197Leu突变与无籽果实性状完全关联，确实了VviAGL11上这个氨基酸替换所导致的种子败育是栽培中葡萄无籽的主要原因。因此推测VvMADS39与VvMADS21的相互作用，共同调控了葡萄果实和胚珠的发育。

发明内容

本发明解决的技术问题：提供一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39，并证明了该基因在产生无核葡萄新种质的潜在功能。

本发明采用的技术方案：一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39，其编码区序列如下：

还提供了这种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39的应用，用于通过转基因技术培育无核葡萄新品种、创建无核葡萄新种质的应用。

本发明与现有技术相比的优点：

1、本发明首次构建了pCAMBIA2300-35S-VvMADS39过量表达载体和同源编辑载体CRISPR/Cas9-SlMADS39，并通过叶盘转化法将其导入模式植物番茄，研究了VvMADS39在过量表达和基因敲除情况下对果实和胚珠生长发育的影响，剖析其功能。

2、本发明的胚珠发育相关基因VvMADS39过表达番茄能明显减小果实和种子大小。切片分析发现该表型可能是由于在胚胎或种子成熟过程中，肉质和种皮细胞分裂或伸长生长收到抑制，阻碍了正常生长发育，产生了较对照相对小的果实和种子，因此表明VvMADS39基因调控了生殖生长，参与了果实和种子的发育。

3、本发明研究发现与对照相比，基因编辑株系不能正常的授粉受精，虽然可以结果，但果实内完全被花器官组织占据，无种子形成。除此之外，与VvMADS39互作的VvMADS21基因，与调控胚珠败育基因VvAGL11序列相似。以上结果都表明葡萄VvMADS39存在重要的潜在功能，VvMADS39与VvMADS21的相互作用，共同调控了葡萄果实和胚珠的发育。

附图说明

图1是葡萄VvMADS39与其他植物MADS-box氨基酸序列比对及进化分析。A图为VvMADS39高度保守的氨基酸残基序列与其它物种植物MADS-box的氨基酸残基序列多重序列比对；B图为VvMADS39在染色体上的定位及基因结构；C图为VvMADS39与其它物种植物MADS-box氨基酸序列的系统进化分析。

图2是VvMADS39在葡萄各组织器官和胚珠发育不同时期的定量表达及VvMADS39亚细胞定位。A图为VvMADS39分别在红地球和无核白葡萄品种中不同组织器官﹑花器官及胚珠发育不同时期的表达模式分析。B图为VvMADS39在拟南芥原生质体中的亚细胞定位，标尺为7.5μm。

图3是VvMADS39在红地球和无核白胚珠不同发育时期的原位杂交。DAF10表示盛花期后10天，标尺为500μm。

图4是将VvMADS39过量异源转化番茄所得转基因株系表型及相关数据统计。A图为未转基因对照和转基因株系番茄植株整体表型图。标尺为2cm。B图为未转基因和转基因株系成熟果实比对图。标尺为1cm。C图为未转基因和转基因株系种子表型观察情况。标尺为2mm。D图是对未转基因和转基因株系种子数量，重量及果实大小的数据统计分析，*表示与未转基因株系相比有显著差异。

图5是VvMADS39对应番茄中的同源基因编辑敲除株系表型图。A图为编辑敲除株系形态学图片，标尺为2cm。B图为编辑株系花器官的表型图片。标尺为10mm。图片右上角所示为正常花器官。C图为雄蕊形态图片。左侧为非转基因表型，右侧为转基因表型。标尺为1mm。D图为显微镜下花粉管生长情况。左侧为非转基因表型，右侧为转基因表型。标尺为100μm。E图为对编辑敲除株系花粉粒的微观观察图片。标尺为30μm。F为编辑敲除株系子房发育形态图。G为编辑敲除株系果实发育过程系列图。标尺为1cm。

图6是VvMADS39与侯选互作基因VvMADS21的进化树分析及基因结构比较。A图为VvMADS39，VvMADS21与其它物种植物MADS-box氨基酸序列的系统进化分析。B图为VvMADS39，VvMADS21及VvAGL11基因结构比对。

图7是VvMADS39和VvMADS21蛋白互作验证。A图为VvMADS39和VvMADS21蛋白的点对点回复验证。B图为VvMADS39-nYFP和VvMADS21-cYFP共同转化烟草的BiFC实验图。标尺为25μm。C图为验证VvMADS39和VvMADS21蛋白互作的Co-IP实验图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述

发明人利用同源克隆技术，根据欧洲葡萄黑比诺基因组序列采用反转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，以欧亚葡萄品种无核白和红地球总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，首次在这两个品种中扩增了VvMADS39，该基因完整开放阅读框序列全长741bp，编码247个氨基酸。

葡萄VvMADS39氨基酸序列与其他物种植物存在共同的高度保守结构域MADS-box以及K1、K2、K3结构域。进化分析及多重序列比对表明，VvMADS39氨基酸序列与拟南芥AtSEP2同源性最高，且他们均属于MADS-box家族中的SEP组亚家族。对VvMADS39序列结构进行分析，结果发现它定位于17号染色体，包含8个外显子片段，是典型的MIKC型结构。

在表达模式分析试验中，发明人发现VvMADS39在葡萄各个组织器官中都有表达，这说明该基因参与了植物发育整个阶段。而作为花发育ABCDE模型的基因家族，无论是在红地球或是无核白中，VvMADS39都是在花器官中表达较为丰富。除此之外，发明人惊喜的发现，该基因在两个葡萄品种胚珠发育不同时期存在差异性表达，根据前人的研究，葡萄胚珠败育发生在花后30-40天，而恰好在这个期间，VvMADS39在无核白中的表达量较红地球要高，这也暗示着VvMADS39可能参与胚珠败育的过程。通过对不同发育时期胚珠的原位杂交结果来看，VvMADS39在种皮中有表达信号，随着发育过程的不断推进，信号越来越弱，在花后50天的胚珠中，只有无核白品种中尚存在微弱的表达。这些结果都说明VvMADS39可以调控胚珠的生长发育。

为了进一步研究葡萄VvMADS39在植物调控中的具体功能，发明人构建了pCAMBIA2300-35S-VvMADS39(酶切位点为XbaI和KpnI)超表达载体，将其在野生番茄Micro-Tom中过量表达，分析转基因番茄发现过表达株系在生理生长和生殖生长期间与非转基因株系并无表型差异，而通过对番茄果实和种子的对比发现，转基因株系的果实和种子都较非转基因小，果实大小和种子重量的相关数据统计分析表明过表达株系和对照株系之间存在显著性差异。

为了进一步了解VvMADS39在调控胚珠生长发育的作用机制，本研究构建了番茄同源编辑载体CRISPR/Cas9-SlMADS39。结果表明在敲除同源基因后，编辑株系可正常生理生长，但进入生殖生长期，出现与对照显著差异的表型。编辑株系花器官发育畸形，花粉粒形态干瘪，活力较低，很难进行授粉受精。早期花瓣，雄蕊及子房发育异常滞后，与对照相比，无法正常转色，表现为浅白绿色。单性结实后，果皮颜色较浅，果实内无种子，而是被花组织所占据。后期果实开裂，果实内花器官继续发育，形成二次花。

综合以上结果，发明人认为VvMADS39除了参与花器官发育之外，对于调控胚珠和种子的生长发育贡献可观，为转基因技术培育无核葡萄新品种提供理论依据。

以下是葡萄基因VvMADS39的编码区序列以及调控胚珠发育相关实验验证的具体步骤。

A、结合前期转录组数据分析，以及胚珠发育侯选基因在有核、无核两个葡萄品种胚珠发育不同时期的定量表达基础上，利用同源克隆技术，以无核白和红地球胚珠总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，扩增得到了VvMADS39序列，基因序列在这两个品种中无差异，该基因VvMADS39的编码区序列如下：

B、将葡萄基因VvMADS39序列的完整开放阅读框插入CaMV35S启动子下游，构建了植株过量表达载体并将其通过叶盘转化法导入野生型番茄Micro-Tom。通过PCR鉴定，筛选获得了表现型良好的VvMADS39转基因T1代株系(2#、7#和36#)。通过NCBI网站找到与VvMADS39同源的番茄基因，SlMADS39。借助CRISPR/Cas9系统，构建基因编辑载体，同样利用叶盘法转化Micro-Tom。成苗后，通过PCR技术手段鉴定出阳性转基因植株，随后对阳性植株进行测序，确定出编辑成功株系(25#和86#)。

C、参见图4图5，发明人鉴定了VvMADS39过表达株系(2#、7#和36#)和基因编辑株系(25#和86#)。通过对转基因株系表型的观察，可以确定该基因确实参与了胚珠的生长发育过程。以上结果都表明VvMADS39基因调控了胚珠的生长途径。

以下是发明人给出的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。

实施例1：VvMADS39的表达模式分析及亚细胞定位

为了分析VvMADS39的表达模式，本研究分析了包含葡萄根、茎、叶、花、须、果实以及不同发育时期的胚珠(图2A)。结果发现，VvMADS39基因在葡萄的各个组织中都有表达，这说明该基因参与整个葡萄发育过程。值得注意的是，VvMADS39作为花发育模型基因中的一员，相对于其他组织，该基因在葡萄花组织器官中存在较为丰富的表达，这也暗示着基因在不同物种之间的保守功能性。通过对VvMADS39在不同葡萄品种胚珠发育不同时期的表达模式来看，该基因同样参加胚珠的生长发育，并且在无核品种无核白葡萄中表达较为丰富。盛花期后30-40天为胚珠败育时期，在此期间VvMADS39在无核白中的表达量较红地球中高，推测该基因参与了胚珠败育过程。构建PBI221-GFP-VvMADS39载体并转化拟南芥原生质体，结果表明该蛋白存在于细胞核中(图2B)。

实施例2：VvMADS39在红地球和无核白葡萄胚珠不同发育时期的原位杂交

取红地球和无核白葡萄盛花后10天﹑25天和50天的胚珠样品，用设计好的探针分别对两个品种进行杂交。如图3所示，在盛花后10天的无核白和红地球胚珠中，都有杂交信号(黄色方框内为胚珠)，并且在无核白葡萄的果皮中也有信号表达，结果说明VvMADS39参与胚珠的种皮层和果皮细胞的发育。盛花后25天，在两个品种种皮中依旧存在表达，在无核白中的信号强度较红地球要强。胚珠发育到第50天时，发明人没有在红地球胚珠中观察到信号，这可能是由于生长发育，种皮的木质化程度较高，组织RNA量很难富集。而在无核品种无核白的胚珠中仍然有微弱的信号表达。

实施例3：VvMADS39的生物信息学分析

通过NCBI网站及相关参考文献，获得与VvMADS39同源的其他物种氨基酸序列。对VvMADS39及其他MADS-box物种氨基酸序列进行多重序列比对，结果发现他们的氨基酸序列中都包含一个MADS-box的高度保守结构域，这暗示着基因功能在不同物种中的保守性(图1A)。对VvMADS39序列结构进行分析，结果发现它定位于17号染色体，包含8个外显子片段，是典型的MIKC型结构(图1B)。与其他已研究的植物氨基酸序列的系统进化树分析结果表明，VvMADS39氨基酸序列与拟南芥AtSEP2氨基酸序列同源性最高，且他们均属于MADS-box家族中的SEP组亚家族(图1C)。而SEP亚家族作为花发育模型中的E类基因，是胚珠发育的身份基因。

实施例4：过量表达VvMADS39和基因编辑株系的表型观察分析

为了进一步分析葡萄VvMADS39的功能，发明人构建了pCAMBIA2300-35S-VvMADS39过量表达载体和同源编辑载体CRISPR/Cas9-SlMADS39。通过叶盘转化法，经PCR鉴定获得过表达阳性植株2#、7#和36#(图4A)。通过观察可以看出，在生理生长和生殖生长期间，过表达株系与对照相比无明显差异。不同的是，转基因VvMADS39番茄的果实偏小(图4B)，对照组平均单粒果实直径大约是过表达株系的1.5倍，与对照组之间存在显著性差异(图4D)。如图4C所示，右侧转基因株系的种子明显较对照株系小，通过对单粒果实内种子数量及种子百粒重的统计得出，过表达株系果实中种子数量明显减少并且变小(图4D)，转基因单粒果实内平均种子数约为13粒，每百粒种子重量约为220mg，与对照相比，存在显著性差异。这些数据表明，VvMADS39参与了果实表皮细胞的生长，同时也调控了胚珠的发育，抑制了了果实及种皮细胞的发育，表现出较对照组偏小的表现型。这也与VvMADS39在无核白葡萄盛花后10天胚珠的原位杂交结果一致，在果皮和胚珠中都有表达信号。

同样地，经过PCR筛选出阳性转基因株系，再利用测序鉴定出同源编辑载体CRISPR/Cas9-SlMADS39株系KO39-25#和86#。如图5A所示，CRISPR/Cas9-SlMADS39转基因番茄在生理生长期间与对照组番茄表型上无明显差异。然而，进入生殖生长开始，便出现明显的差异变化。如图5B所示，整个花器官发育异常，花苞不能自然闭合，呈分裂状。萼片变多变大发育成叶片或苞片状结构。花瓣丢失或不能正常发育(图5B右上角为正常花器官)，而表现出来的是类似于萼片一样的浅绿色畸形花瓣。雄蕊发育受阻，较对照组番茄明显矮小且不能正常转色(图5C)。对雄蕊所产生的花粉粒的研究发现，花粉活力显著降低且在扫描电镜下观察到花粉粒形态干瘪(图5E)，这种异常的发育导致花粉粒在柱头上不能正常的萌发(图5D)，授粉受精受阻。较对照组株系相比，子房不能正常转色且其前段呈尖状(图5F)。随着发育的进行，子房膨大，最终发育成橘黄色果实，果实内部并非常规的果肉和种子，而是被畸形的花器官组织所占据，随着进一步的生长，这些花器官会挤裂果实继续成长为新的花组织，形成二次花，二次果，无种子形成(图5G)。

实施例5：VvMADS39酵母双杂互作基因VvMADS21的进化分析与基因结构分析

为了获得更加精准的实验研究结果，发明人通过酵母文库筛选出侯选互作基因VvMADS21。图6A为VvMADS39，VvMADS21与其它物种植物MADS-box氨基酸序列的系统进化分析。通过图6A所示的进化树分析来看，VvMADS21与目前公认的葡萄胚珠身份基因VvAGL11进化关系较近，同时与拟南芥的STK,SHP1,SHP2处于较近的分支进化结构中，而这些基因正是参与胚珠，种子正常发育不可或缺的关键基因。图6B为VvMADS39，VvMADS21及VvAGL11基因结构比对。分析发现，它们的结构略有不同。VvMADS39和VvAGL11结构相似，都包含8个外显子片段，而VvMADS21拥有7个外显子片段。基因结构的不同暗示着在功能上会有所差异。

实施例6：VvMADS39互作蛋白的筛选与验证

由于胚珠发育调控网络的复杂性，发明人认为还有其他相关基因协同VvMADS39发挥作用。为了进一步了解VvMADS39调控路径，本研究构建了胚珠发育时期的酵母文库，通过酵母双杂筛选出VvMADS39的互作基因VvMADS21。如图7A所示，酵母点对点验证结果表明，VvMADS39和VvMADS21存在互作关系。除此之外，分别构建了pEarleyGate201-VvMADS39-YN-HA和pEarleyGate201-VvMADS21-YC-Flag载体。将这两种菌液混匀注射到烟草中，2天后，激光共聚焦下可以观察到YFP在核内有信号(图7B)。另外，Co-IP实验再次证明了VvMADS39和VvMADS21是一对互作蛋白(图7C)。序列比对结果显示，在MADS-box基因家族中，VvMADS21与VviAGL11同属于AP3-PI亚家族，序列相似性非常高，而近年来VviAGL11的Arg197Leu突变已经被证明是种子败育的关键原因。因此发明人推测VvMADS21与VviAGL11的功能相似，参与了胚珠生长发育过程，VvMADS39与VvMADS21的相互作用，共同调控了葡萄果实和胚珠的发育。

上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述内容所做的等效变化，均应包括在本发明权利要求范围之内。

序列表

<120> 一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39及其应用

<140> 2020109209874

<141> 2020-09-04

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 741

<212> DNA

<213> 葡萄种子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atggggagag gaagagtgga gctgaagagg atagagaaca aaattaacag gcaggtgaca 60

tttgctaaga gaaggaatgg tcttctcaag aaagcttatg agctctctgt tctctgtgac 120

gctgaggttg ctctcatcgt tttctctagc cgtggcaaac tctatgagtt ctgcagcggc 180

cctagcatgg cgaaaacact tgagaagtac caaaagtgca gctatggtgc attggaagcc 240

agccaacctg tctatgaact cactcagagc agctatcagg agtatttgaa gctaaagaca 300

agagtggagg tcctacagcg gtctcagaga caccttcttg gggaagactt ggacccgcta 360

aacacaaagg agcttgagca gcttgagcat caactcgaga tgtccctgaa gcaaattagg 420

tccacaaaga ctcaaaatat gcttgatcaa ctagcagatc ttcaaaataa ggaacatatg 480

ctaattgaag ctaacaatgc cctgagaagg aagctggaag aatctaatgg aaaacatccc 540

cttcaacagt catgggaagc ggcaggaaac agtgctctct acagtcgcct tcctgctcaa 600

tcagaggggt ttttccagcc tctggaacgc aattccacat tggaaatggg atacaatgct 660

gcaggatcca atgagataac tcttgcggcc ccatcccaaa atgacaatgg atttggcccc 720

ggatggatgc tttggatata a 741

Claims (2)

1.一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39，其特征在于：该基因的编码区序列为：

2.根据权利要求1所述的一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39的应用，其特征在于：用于通过转基因技术培育无核葡萄新品种、创建无核葡萄新种质的应用。

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