CN108588112B - 番茄SlMPK20基因在创建番茄核雄性不育系中的应用 - Google Patents

番茄SlMPK20基因在创建番茄核雄性不育系中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了番茄SlMPK20基因在创建番茄核雄性不育系中的应用。利用CRISPR/Cas9敲除系统对番茄SlMPK20进行定点敲除，获得SlMPK20基因特异敲除的番茄转基因株系，SlMPK20的敲除导致花粉粒完全败育，只有少量单性结实的果实形成，但SlMPK20的敲除对植株营养生长与雌性生殖器官发育无明显影响，SlMPK20专一性地作用于番茄花药发育过程。利用SlMPK20的敲除创建的番茄核雄性不育系，不育率100％；遗传分析表明，其属于隐性核不育，利用相应的野生型番茄作为保持系可繁育核不育系。通过后代筛选，得到不含转基因成分的不育系。该不育系可与大量番茄育种材料(恢复系)杂交，用于杂种一代的制种。该方法可快速地将不育性状导入普通番茄育种材料，在番茄杂交育种中有广泛应用前景。

Description

番茄SlMPK20基因在创建番茄核雄性不育系中的应用
技术领域
本发明属于蔬菜分子育种和植物基因工程领域，尤其涉及番茄SlMPK20基因在创建番茄核雄性不育系中的应用。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum L.)是茄科番茄属植物，其适应范围大、产量高、营养丰富，在我国的蔬菜生产与消费中占有重要地位。杂种优势利用是提高农作物产量的重要有效途径，利用不育系能更好的发挥杂种优势，因而目前对番茄雄性不育的研究日趋增多。利用番茄雄性不育系进行育种，不仅可以节约育种中的人力、物力，还能提高育种的效率和保证种子的纯度。
核雄性不育育种是作物杂交育种利用的重要途径之一，尤其是隐性核不育系表现稳定，不受外部环境因子的影响，恢复谱极其广泛，易选配强优组合，近年来在大田作物中已成功应用。但目前对于调控番茄育性的关键基因还鲜见报道，且其调控番茄花粉发育的分子机制并不清楚。
花粉发育过程涉及到许多的生理生化反应及大量基因的表达调控，任一环节出问题都有可能导致雄性不育。作物花粉正常发育过程受到阻碍往往会影响到正常坐果及种子发育，在生产上会造成巨大的经济损失。因此，对于作物花粉发育的研究具有重要的实践意义。植物花粉发育的有序进行，需要精确的信号转导系统来接收和传递复杂的胞内和胞外信号，包括促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase,MAPK)级联途径信号系统。在过去数年中，有相关研究通过RNA干涉(RNAi)等生物学技术手段进行MAPKs与花粉育性之间的相关性研究。但是以上技术手段不能完全抑制MAPKs在作物中的转录和翻译，获得的转基因材料不能完全败育；且由于在模式植物拟南芥与水稻中已经鉴定的并且功能明确的MAPK基因均为遍在表达基因，因而将其干涉或敲除掉不仅对生殖发育有影响，而且也会影响的植株的营养生长、抗逆性及抗病性，所以限制了其在雄性不育材料创制方面的应用。
CRISPR/Cas9(Clustered,Regularly Interspaced,Short PalindromicRepeats-associated Endonuclease 9)技术是近几年新发展起来的一种基因组定向编辑技术，其已成功应用于模式植物基因功能鉴定，抗病作物种质创建等多个方面。由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点，CRISPR/Cas9基因编辑系统作为一项高效植物遗传改良和育种研究的分子操作技术手段，应用前景十分广阔。但是，目前尚无运用该技术敲除番茄基因改良育性相关基因的报道。
发明内容
本发明针对上述技术中存在的不足，提供番茄SlMPK20基因在创建番茄核雄性不育系中的应用。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对SlMPK20进行定点敲除，其对番茄营养生长和雌性生殖生长都没有明显影响，但纯合敲除植株可育花粉完全消失，造成番茄雄性不育，不育率达到100％。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：番茄SlMPK20基因在创建番茄核雄性不育系中的应用，所述SlMPK20的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
具体为：对番茄基因组中的SlMPK20进行定点敲除，获得栽培番茄SlMPK20基因特异敲除的纯合转基因株系。
SlMPK20的敲除，可利用CRISPR/Cas9基因编辑方法，还可以采用T-DNA插入、EMS诱变等方法；且载体导入方法不局限于通过农杆菌转化方法，还包括通过花粉管导入作物细胞、愈伤组织、组织或器官中获得的植株。
观察发现SlMPK20的敲除导致花粉粒完全败育，将野生型花粉授在SlMPK20敲除转基因植株柱头上，转基因植株能够正常坐果与结籽，且种子能正常萌发，表明SlMPK20的敲除对植株营养生长与雌性生殖生长并无明显影响，SlMPK20专一地作用于番茄雄性生殖发育过程中。SlMPK20的敲除导致番茄雄性不育，不育率100％。
此外，本发明还通过转录组分析、生化分析以及分子生物学等手段证实了SlMPK20敲除转基因植株同野生型相比，花药中糖运输和糖代谢相关基因显著下调表达，同时大量生长素等植物激素生物合成与信号传导基因表达下调，不育植株中雄蕊中生长素与茉莉酸含量明显降低，从而使得游离小孢子不能进行第二次有丝分裂，单核期游离小孢子不能转变为双核期花粉，导致花粉完全败育，造成番茄雄性不育，所以敲除SlMPK20从转录水平上调控糖代谢与生长素等植物激素信号相关基因的表达水平从而诱导番茄花粉败育，该推断为利用生化手段调控作物花粉育性提供了新思路。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用基因编辑技术，通过遗传转化手段，将SlMPK20基因在番茄中特异敲除，经一系列实验证明，与野生型对照番茄植株相比，SlMPK20敲除转基因植株花粉粒完全败育，更通过大量生理生化、分子生物学实验探明了其调控机理，表明其通过下调糖运输和糖代谢、植物激素合成和信号转导相关基因的表达，从而调控番茄花粉的发育，证实其在单核期游离小孢子转变为双核期花粉过程中发挥关键的作用，这一最新发现的作用途径完全不同于先前报道的植物MAPK作用机制，且可以发展形成100％不育的番茄雄性不育系。所以SlMPK20的敲除导致番茄雄性不育，创建了一个番茄隐性核雄性不育系，为番茄杂种优势利用提供了新途径。
该技术可以用于普通番茄优良育种材料的雄性不育系的转育，具有简便且快速的特点。
附图说明
图1为SlMPK20在番茄雄蕊四分体时期至双核期优势表达。
(a)SlMPK20在番茄根、茎、叶、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊和果实中的表达水平。(b)SlMPK20在番茄不同发育时期雄蕊中的表达量。R，根；S，茎；L，叶；Se，花萼；Pe，花瓣；St，雄蕊；Pi，雌蕊；Fr，幼果。Ⅰ-Ⅵ代表番茄雄蕊发育的6个时期：分别为胞母细胞时期、四分体时期、单核早期、单核中后期、双核期、成熟期。方差利用±SDs表示，三次生物学重复。(c)原位杂交分析番茄不同发育时期雄蕊中SlMPK20的表达情况。c1-c6,SlMPK20反义探针分别和番茄不同花粉发育时期的花药横切片杂交(10μm)。c7-c12,SlMPK20正义探针分别和番茄不同花粉发育时期的花药横切片杂交(10μm)。c1和c7，胞母细胞时期；c2和c8，四分体时期；c3和c9，单核早期；c4和c10，单核中后期；c5和c11，双核期；c6和c12，成熟期。标尺100μm。(d)SlMPK20启动子在拟南芥花中的表达活性。d1，拟南芥野生型花序中检测不到GUS染色。d2，SlMPK20启动子在拟南芥花中的表达活性。d3，SlMPK20启动子在拟南芥双核期花粉粒中的表达活性。(d1-d2)标尺为500μm；(c1-c12与d3)标尺为100μm。
图2为SlMPK20基因敲除纯合突变体植株突变类型统计。CRISPR/Cas9-介导的敲除SlMPK20的纯合子的代表序列。顶部为野生型(WT)序列，目标靶序列用红色显示，PAM序列也用下划线标记。6个和7个sgRNA-SlMPK20纯合子株系分别缺失19bp和65bp碱基。
图3为SlMPK20转基因植株与对照植株花粉观察。(a-c)FDA染色鉴定WT、RNAi-6、和CR-9植株花粉活力。(d-f)为(a-c)相应的白场。(g-i)WT、RNAi-6、和CR-9植株花粉体外萌发实验。(j-o)扫描电镜观察WT、RNAi-6、和CR-9植株花粉形态。(p)有活力花粉所占比率,(q)花粉萌发率，(r)形态正常花粉粒所占比率。方差利用±SEs表示，18次生物学重复。
图4为番茄植株结实情况观察。a-c，WT与SlMPK20RNAi、SlMPK20敲除纯合转基因植株形态观察。d，WT果实形态观察。e，SlMPK20RNAi转基因植株果实形态观察。f，SlMPK20敲除植株果实形态观察。g，将WT番茄花粉授在SlMPK20敲除植株的发育形成的果实。标尺＝1cm。
图5为野生型与CR-9转基因植株花粉超薄透射电镜观察。a-d与i-l，野生型植株花粉粒切面。e-h,m-p表示CR-9转基因植株花粉粒切面。在小孢子母细胞阶段(a和e)、四分阶段(b和f)和单核早期(c和g)，没有观察到差异。(d和h)单核中期，(i和m)单核晚期。(j和n)双核期。(k和o)双核大液泡时期。(l和p)成熟期。Ex,外壁；GN，生殖细胞核；In,内壁；v，液泡；VN，营养细胞核。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：qRT-PCR分析SlMPK20在番茄不同组织器官中的时空表达
利用qRT-PCR技术研究SlMPK20的时空表达模式，结果发现，SlMPK20在不同组织中均有表达，在雄蕊中表达量最高，根、茎、叶和幼果中只有微量表达。SlMPK20在番茄雄蕊发育的6个时期均有表达，SlMPK20基因表达量在单核中后期至双核期表达量最高(图1a，1b)。具体方法如下：
以根、茎、叶、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊、绿熟期果实及不同时期的花蕾(Bud I-Ⅴ)和完全开放花(F)的cDNA为模板，采用TAKARA公司SYBR Premix Ex Taq定量试剂盒于荧光实时定量PCR仪(CFX96，Bio-Rad，USA)上进行。根据SlMPK20基因的特异性序列设计的引物为(DL-SlMPK20-F：5'-GATGCGAGCTGG AGTTACA-3'；DL-SlMPK20-R：5'-ATCCTGGACATACCATACTGA-3')。实验重复3次。目的基因相对表达量按照2-△△Ct方法进行分析。
实施例2：原位杂交分析番茄不同发育时期雄蕊中SlMPK20的表达情况
为进一步精确定位SlMPK20转录本在雄蕊中的位置，本发明克隆了SlMPK20中302bp的特异片段，上下游引物分别为Yw-SlMPK20-F：5'-GCTCTAGAGCTTGGAACGCCTTCAATGG-3'；Yw-SlMPK20-R：5'-CGGGATCCCCTCCTTCGTCACTCTTCGC-3'，利用组织原位杂交技术分析SlMPK20在野生型番茄‘Micro-Tom’Ⅵ雄蕊中的表达，即胞母细胞时期、四分体时期、单核早期、单核中后期、双核期、成熟期。结果表明，杂交信号在四分体时期开始出现，在单核早期及单核中后期较弱，在双核期又观察到较强的杂交信号。在胞母时期、成熟期以及用正义探针进行杂交的对照中均没有观察到杂交信号(图1c)。原位杂交实验的结果与qRT-PCR观察到的SlMPK20在番茄雄蕊不同发育中的时空表达相吻合。
实施例3：SlMPK20启动子序列的分离与表达活性分析
本研究在番茄SGN数据库中分离了SlMPK20上游2000bp的启动子序列。以番茄雄蕊cDNA为模板，设计特异引物扩增SlMPK20基因上游1964bp的启动子序列(如SEQ ID No.2所示)；Pro-SlMPK20-F：5'-CCAAGCTTGACAATCACCTTTTCTACGTGTTC-3'；Pro-SlMPK20-R：5'-CTAGTCTAGACCGAATCGAGTGATCCAAGT-3')，将其连接到pBI121上，构建了启动子载体pBI121-SlMPK20Pro-GUS。SlMPK20能启动在花序中的表达(图1d)。进一步确认SlMPK20的启动子活性，发现明显的信号最先出现在四分体时期，而在单核期，外围组织信号较强而花粉粒中的信号减弱，双核期花粉粒也能检测到明显的GUS信号。而在胞母细胞时期(图1d2)、成熟期(图1d3)及用作对照的野生型拟南芥(图1d1)中也观察不到GUS信号。
实施例4：SlMPK20CRISPR/Cas9敲除载体的构建及SlMPK20
CRISPR/Cas9敲除转基因植株的获得
为验证SlMPK20缺失对番茄植株生长发育的影响，我们设计SlMPK20的靶基因序列，通过酶切连接构建pCAMBIA1301-U6-26-sgRNA1-SlMPK20-35S-cas9SK载体，利用CRISPR/Cas9技术敲除SlMPK20来进行研究。
首先，利用CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计SlMPK20基因的靶序列sgRNA1：5'-CTGATGCGGCACGGATCCTC-3'。将合成的sgRNA1序列(单链)进行退火，形成双链sgRNA1，同时其两端具有Bbs I限制性内切酶酶切位点。将形成的sgRNA1与Bbs I限制性内切酶酶切过的AtU6-26SK载体进行连接，提取阳性质粒备用，命名为U6-26-sgRNA1-SlMPK20-SK。利用Kpn I与Sal I限制性内切酶同时对U6-26-sgRNA1-SlMPK20-SK和35S-Cas9SK载体进行双酶切，将各自酶切产物回收并将的酶切过的U6-26-sgRNA1-SlMPK20片段连接到同样酶切过的35S-Cas9SK载体上。菌液PCR检测引物为，U6-26-F：5'-GACGGCCAGTGAATTGTA-3'，U6-26-R：5'-TATCTAAGCGA TGTGGGACT-3'，测序验证阳性克隆，提取阳性质粒备用，命名为U6-26-sgRNA1-SlMPK20-35S-cas9SK。利用Kpn I与Xba I限制性内切酶同时对U6-26-sgRNA1-SlMPK20-35S-cas9SK和pCAMBIA1301载体进行双酶切，U6-26-sgRNA1-SlMPK20-35S-cas9SK回收约6kb的条带，即U6-26-sgRNA-SlMPK20-35S-cas9片段，连到酶切过的pCAMBIA1301载体上。连接产物转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞，挑取单菌落，于含50mg/L卡那霉素(Kan)的液体LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。在pCAMBIA1301载体的5’端设计引物进行菌液PCR检测(～550bp)，上下游引物分别为，U6-26-Cas9-F：5'-GCTCGTATGTTGTGTGGAAT-3'，U6-26-Cas9-R：5'-TATCTAAGCGATGTGGGACT-3'。测序验证阳性克隆，提取阳性质粒备用，命名为pCAMBIA1301-U6-26-sgRNA1-SlMPK20-35S-cas9SK。
为排除CRISPR/Cas9脱靶造成的基因效应，进一步明确SlMAPK20的基因功能，我们同时构建了SlMPK20基因的RNAi载体。根据SlMPK20的DNA序列和重组载体pLAT52::pCAMBIA1301的多克隆酶切位点，选取特异片段，分别设计了长为528bp的正义片段和320bp的反义片段。正义片段引入Sma I和BamH I酶切位点，上下游引物分别为，SlMPK20-Sma I-正义-U：5′-TCCCCCGGGCTATATGATGCGAGCTGGAGT-3′，SlMPK20-BamH I-正义-D：5′-CGGGATCCCGTGATGAGAGGAACGAACT-3′。反义片段引入Xba I和BamH I酶切位点，上下游引物分别为，SlMPK20-Xba I-反义-U：5′-TGCTCTAGACTATATGATGCGAGCTGGAGT-3′，SlMPK20-BamHI-反义-D：5′-CGGGATCCTGCAGATTCTCCTGCCTGTAC-3′。以生长健壮的野生型番茄基因组DNA为模板，用KOD高保真酶，扩增正反义片段。将正反义扩增片段分别连至pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，测序验证。将连有番茄花粉特异启动子LAT52的pLAT52::pCAMBIA1301载体质粒用Sma I和Xba I进行37℃双酶切3h。将已连接到pGEM-Teasy载体的正义链质粒用限制性内切酶Sma I和BamH I双酶切，37℃，3h。将已连接到pGEM-T easy载体的反义链质粒用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切，37℃，3h。1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离已酶切的目的片段，凝胶回收试剂盒回收，各用30μL无菌双蒸水溶解备用。将已酶切过的正义片段、反义片段和经Sma I和Xba I双酶切的pLAT52::pCAMBIA1301载体质粒大片段以体积比3:3:2，4℃连接过夜。大肠杆菌DH5α感受态细胞转化，涂布于含50mg/L卡那霉素(Kan)的固体LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落，于含50mg/L卡那霉素(Kan)的液体LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，提取质粒进行限制性内切酶双酶切鉴定。阳性质粒命名为pLAT52::SlMPK20-RNAi。通过冻融法将阳性质粒转入农杆菌GV3101，与甘油1:1混合，-70℃保存。
上述载体利用“叶盘法”通过GV3101农杆菌侵染普通番茄子叶，分别获得转化pCAMBIA1301-U6-26-sgRNA1-SlMPK20-35S-cas9SK敲除载体以及pLAT52::SlMPK20-RNAi干涉载体的抗性芽系，移栽后获得相应植株。
经统计，利用PCR和GUS染色筛选阳性SlMPK20敲除转基因植株，共获得sgRNA1-SlMPK20-1301转基因芽系43个，其中23个芽系为纯合子，约占58.13％。在这些纯合子中，缺失19-和65-bp分别有6个与7个芽系(图2)。选取缺失19-bp的一个株系CR-9为代表进行园艺学性状以及细胞学特征观察。
另外，我们还获得SlMPK20RNAi转基因植株的26个芽系，选取其中12个阳性芽系用于自交产生T1代，选取其中的RNAi-6株系为代表，便于进行表型以及细胞学特征观察。
实施例5：观察SlMPK20基因对番茄育性的影响
对SlMPK20番茄转基因植株的花粉活力与花粉萌发率进行观察及统计。通过FDA染色观察花粉活力，结果显示，对照植株番茄的花粉活力良好，而T1代SlMPK20RNAi的转基因株系花粉83.90％的发生败育。而SlMPK20敲除转基因株系T0代花粉完全败育，无法产生种子，获得后代。花粉体外萌发观察发现只有SlMPK20干涉转基因植株中13.56±4.33％的花粉可以在体外萌发，远远低于同样萌发条件下的野生型花粉的体外萌发率(66.67％)。SlMPK20敲除转基因植株无花粉萌发(图3)。以上数据均表明，SlMPK20可直接调控花粉发育。通过扫描电镜(SEM)对WT、RNAi-6与CR-9转基因番茄植株的花粉形态进行观察，发现相比于正常野生型花粉粒为饱满的椭圆形，具有清晰、分布均匀的萌发沟，SlMPK20RNAi与SlMPK20敲除转基因番茄植株败育的花粉粒呈现崩塌、皱缩的形态(图3)。具体方法如下：
FDA染色：取生长状况良好的转基因植株与对照番茄植株的开放花，用镊子将花粉粒轻轻抖落于载玻片上，在载玻片上滴20μL FDA染液，小心盖上盖玻片，不要产生气泡。在室温、保湿、避光放置15min后，用绿色荧光灯的显微镜(DMLB，Leica，Germany)进行拍照观察。有活力的花粉显示绿色荧光，根据荧光染色情况，对番茄植株花粉活力进行生物学统计。FDA染液母液配制(2mg/mL)：2mg FDA+1mL丙酮，避光、4℃保存。FDA工作液：用15％的蔗糖溶液按1:1000的比例稀释。
花粉体外萌发观察：取不同类型番茄植株开放花，轻轻抖落花粉粒于载玻片上，在50μL的花粉萌发培养基中将花粉粒均匀分散开，将制片放入垫有湿吸水纸的培养皿，25℃避光，培养1h后用显微镜(DMLB，Leica，Germany)进行拍照观察。对番茄植株花粉活力进行生物学统计。花粉体外萌发液配置：120g/L蔗糖+50mg/L H3BO3+300mg/L Ca(NO3)2·4H2O+200mg/L MgSO4·7H2O+100mg/L KNO3+0.1％琼脂粉。每次实验设计3个重复。对所有测量数据进行统计分析，并用SPSS软件对数据进行显著性分析(p-value<0.05)。
花粉形态扫描电镜观察：取生长状况良好的转基因植株与对照番茄植株的开放花，轻轻抖落花粉粒于贴有双面胶的金属载物台上，用牙签轻轻将花粉涂布均匀(小心不要产生划痕)，在Eiko IB5离子喷射仪中喷镀金粉4-5min，随后在Hitachi Model TM-1000型扫描电镜下观察花粉形态。
实施例6：番茄植株结实情况观察
为探明SlMPK20对番茄植株果实生长发育的作用，我们比较了SlMPK20RNAi与SlMPK20敲除转基因植株的果实与WT植株果实的差异。对生长状况良好的转基因植株与对照番茄植株整体及其开放花、雄蕊、雌蕊、花瓣及萼片进行拍照比对分析。每组实验设置3个生物学重复，每次重复包含从10个单株中随机选取的20朵开放花。发现SlMPK20的抑制或敲除导致番茄果实的大小、单果重与单果种子数量均受到严重影响，其根本原因应为花粉败育最终导致番茄受精不良造成果实大小差异。统计分析显示，WT中每个番茄果实内的种子数达到25.6颗，而SlMPK20RNAi植株中平均每个果实只有3.68粒种子，SlMPK20敲除转基因植株果实中没有种子形成。
为进一步确认抑制或敲除SlMPK20植株雌蕊发育是否正常，对SlMPK20敲除转基因植株CR-6与WT进行了正反交试验。若将WT番茄花粉授在SlMPK20敲除转基因植株的柱头上，果实可以正常发育，且形成的果实大小、形态同野生型相似，果实内种子发育正常，种子数目同野生型相似，且均可正常萌发,说明SlMPK20专一性地影响番茄雄性育性，对番茄雌性器官发育没有明显影响(图4)。因而该不育系可以非常方便地用于番茄杂交组合配制。
实施例7：SlMPK20基因敲除番茄材料花粉败育过程的细胞学观察
利用超薄透射电镜(TEM)观察WT与SlMPK20敲除植株花粉粒的超微结构，结果显示：SlMPK20敲除转基因植株花粉粒在小孢子母细胞时期、四分体时期及单核早期发育正常。然而，当小孢子发育进入单核中期，CR-9转基因植株的小孢子细胞质中开始出现了大量的小液泡，呈现高度液泡化，这种现象在小孢子单核后期变得越来越明显。在双核期小孢子阶段，WT的小孢子含有饱满的细胞质及正常营养和与生殖核，而SlMPK20敲除转基因植株花粉粒中大部分细胞质与细胞核降解，在双核大液泡时期，没有发现可以辨认的膜系统，只观察到微量的细胞质内含物。成熟期，SlMPK20敲除转基因植株花粉粒中的细胞质完全降解。然而花粉粒的外壁仍然存在，这说明花粉外壁的发育并没有受到明显影响(图5)。进一步证实了SlMPK20转基因植株的花粉粒败育发生在从单核小孢子向双核小孢子转变的过程中。具体操作如下：
将在树脂中包埋好的番茄雄蕊样品在Richard超薄切片机中切片，厚度为50nm。用具有Fovara膜的铜镍载网捞片，随后用醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液和柠檬酸铅溶液各染色15min，干燥后于Hitachi Model H-7650型透射电镜下拍照观察。
综合以上研究，本发明发现了SlMPK20特异调控减数分裂后花粉发育，其敲除可导致番茄雄性不育。
最后，以上所述的仅是本发明的若干个具体实施例。本发明并不局限于以上实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，均应属本发明专利的保护和涵盖范围。
序列表
<120> 番茄SlMPK20基因在创建番茄核雄性不育系中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1866
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgcagcctg atcaccgaaa gaaaagttca gcagagatgg acttcttctc tgaatatggt 60
gatgcaaata gatacaaaat tcaagaagtc atagggaaag gaagctatgg tgtcgtttgc 120
tcagccattg acacgcacac tggtgaaaaa gtcgcaatta aaaaaattca tgacatcttt 180
gaacatatat ctgatgcggc acggatcctc cgggagataa agcttttgcg acttctgcgc 240
catcctgata tagttgaaat caagcatatt atgttgccac cttcgaggag ggattttaaa 300
gatatttatg ttgtttttga gctcatggag tcagatctac accaagttat caaggctaat 360
gatgacttga ctcgggaaca ttatcagttt ttcctttatc agttgcttcg tgccttaaaa 420
tatatacaca cagctaatgt ctaccataga gatttaaagc cgaaaaatat cttggcaaat 480
gcaaattgca agctcaagat ctgtgatttt ggattggcca gagttgcatt caatgataca 540
cctaccacaa tattttggac ggattatgta gctactagat ggtatagagc tccagagtta 600
tgcggttcat tttactccaa gtatacccct gcaattgata tatggagcat aggctgtatc 660
tttgctgagg ttcttacggg gaagccgctc tttcctggaa aaaatgtagt tcaccaactg 720
gatttaatga ctgatctgct tggaacgcct tcaatggata caatttctcg tgtgcgtaat 780
gacaaggcta ggagatacct aactagcatg agaaagaagc agcctgtttc ttttgctcag 840
aaatttccaa atgctgatcc tttgtccctt aaacttcttg aaagattact tgcttttgac 900
cccaaggacc gacccactgc tgaggaggca ctagctgatc cttattttaa gggtctggct 960
aaatctgaaa gggaaccatc atgcaagtca atttcaaaaa tggagttcga atttgagagg 1020
cgaagagtga cgaaggagga tctcagggaa ttaatattcc gggagatact agaatatcat 1080
cctcagctga ggaaggatta cttgaatggt gtagaaagga ctaattttct gtatccgagt 1140
gctgttgatc aattcaggaa acagttcgct cacttggaag agaacggtgg taatggcgtt 1200
ccagtggttc cgatggacag gaagcatgtc tctcttccaa ggtctacagt tgtacattca 1260
aatccaaacc ctttgaaaga acagcctatt gttgccaata tgagagaccg acaaaatggt 1320
gaagagtctt gcagtagaaa ctgcagagat tctgaaggcc ttgcaagtag tctaacaaga 1380
accctacagg ctcagccaag aaatgcttta gcagccaaac caggaaaagt tgttggtccc 1440
ggtttggctt atgattcggg aaatagagaa aaatatgatc ctaggtctca agtcaggaat 1500
gcagtaggcc cccctcagat tatgtcttca gtttacagct acgacagaag tggggtggtg 1560
aaacaagaaa ggtctgttga gacagagagg gatatgaatt gtcattcaaa gccaatggca 1620
ccatgtggaa tggctgctaa gttagcccca gatattgcta taaatattga tagcaaccca 1680
ttctatatga tgcgagctgg agttacaaaa ccagatcgtg ttgatgaccg aatcaccata 1740
gacacaaact tattgcaggc taaatcccaa tatggtggaa ttggagttgc ggcggcagca 1800
gctactagtg gtgcagctca taggaaagta gggactgttc agtatggtat gtccaggatg 1860
tactag 1866
<210> 2
<211> 1964
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
gacaatcacc ttttctacgt gttccctaat ttcatggcac tgcttctgaa attttgtctt 60
tggttacata attaaagtgg aatacaaaaa gttattgcaa gttgcttaaa ctatttctaa 120
tacaattttt ttttctcata ataaaatgta tattataacc taaaatttca attactaatg 180
ttttgtttac attattaagt tggattagaa aaaaagaaac acaactagac aacattgtag 240
tttgaatgtc acatcttaaa caatagatta actcttgata taaataatgt agtaattttt 300
tcccataata attgtactct ttcttctgta ttgaattatt aaaattaaat tatttgattt 360
gatataatta tttatcacga ataaataatt actattcttt tcatatcatt cattaataaa 420
tatgttttca gttaaaatga aatgatgata tacactagtc atttaggaaa ataactattt 480
aatatcttta ttaatttgct atattcaagc gtctcgaaga tttttaaaaa caattttttt 540
atttaaatta aaatattgtc ataattatta atagtagacc aagttgaaag gtgcatgcaa 600
ccacaatatt actcaaactt tccaaactaa taacacacca accaattttg tggtgctctt 660
ataagcacgg agataccttt ctttttcatt attttatgta aaatagtaat tttagtactc 720
ataaaaataa ttaaatttat gtttttaatc attaataaac ttctaactct aattaacaaa 780
ataagaatat ctttatgtta atctacttct caaagctatt gcctattagt attagtattt 840
aacataaatt aatattaaaa tttagaatat atatatatat atatattttt ttttttgcct 900
cttttgcgtg tgttgaatgc acacgccgct tggatgtcac taatgtattg tatatacaga 960
taagatacac tcacatcaca tgcacctaat aaaatataat acatgaagta ctttatacta 1020
atattattat tctattatta acaatgaata atgtattata aattttgtcc tttaatttac 1080
tttcatctaa tatttatgtg tgtattataa caagatattt aatttgtata acattgaaca 1140
aataaataca gataatttac ttgacgtttt atgcaacatt ttatgtaatg ttctacacat 1200
attttgatat acagaataaa tgtgtctagt gattgatttt tataaagtgt ctaattattt 1260
cattaattat cgatgtgaga cccatcacat taatcacaca agagactttt gtcattcttt 1320
aaaactccat ctcacactcg gtgcttgata tcataaatgt taattgagac agatttaaac 1380
tatttgagtt tgaatctctt aaaaaggtcc cgaatgtaaa tcttataatt tataatttat 1440
ttttttcgta ttctaatatg aatattttga ttttttttaa atatcgaaca tcgaatagat 1500
agattaaaat aaatataggt gctttatatt tgtattgtat ttctcctttc tctttctaac 1560
acaaccaccc tacagttcca accccacctc aatattgtcg gtgtcagatc tccctcttcc 1620
ccaccagcta gggtttcttc agatccacat atctctttga tttcatactc cattattaat 1680
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aggatcagga taacgtgata ataataatac cagttttgga caatttgaag aggattaggt 1860
gggactggga ctgttctttc gccatccgta gcagaggacg ttggggtaaa tgcggctgaa 1920
tttctgaatt caacactctt gtctacttgg atcactcgat tcgg 1964

Claims (3)

1.番茄SlMPK20基因在创建番茄核雄性不育系中的应用，所述SlMPK20的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：对番茄的SlMPK20进行定点敲除。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述敲除的手段包括CRISPR/Cas9基因编辑技术。
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