CN117925640A - 一种调控大白菜抽薹开花时间的孤基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控大白菜抽薹开花时间的孤基因及其应用，涉及生物技术领域。该孤基因为BrOG37基因，该BrOG37基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供该孤基因在延迟大白菜抽薹开花时间中的应用。本发明研究发现，BrOG37蛋白定位在细胞膜，其可以调控大白菜抽薹开花时间。本发明阐明了BrOG37参与调控大白菜开花的具体途径，BrOG37调控BrFLC这一开花从营养生长到生殖生长的关键基因的分子机制，为大白菜开花调控开辟了新思路和新基因，有利于培育大白菜耐抽薹新品种资源。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种调控大白菜抽薹开花时间的孤基因及其应用。
背景技术
十字花科芸薹属芸薹种作物(Brassica rapa)是我国栽培区域最广、面积最大和总产量最高的叶菜类蔬菜，包括大白菜、不结球白菜、青梗菜、芜菁和乌塌菜等以营养体为商品器官的多个栽培种群。芸薹种作物的早期抽薹开花导致营养生长周期变短，进而使其商品价值和食用价值大幅降低。未熟抽薹也是我国在高海拔地区夏季和北方地区春季大白菜生产的主要限制因素。因此，为满足市场需求，丰富淡季蔬菜种类，使生产者获得更高的经济效益，培育耐抽薹品种已经成为大白菜育种的重要目标。研究大白菜抽薹开花的分子机理对于培育耐抽薹大白菜品种具有重要的指导意义。
孤基因(Orphan genes，OGs)是一种与其他物种表达的已知基因序列不相似的物种或谱系特异性基因，通常是由于快速进化活动而产生的。迄今为止，在许多物种的基因组中鉴定了孤基因，包括麻藤、拟南芥、芸苔属、8个葫芦科物种、水稻和豇豆，由于OGs不包含可识别的结构域、功能基序或折叠模式，因此它们的功能往往不清楚，因此最终需要进行详细的功能分析。一些研究已经成功证明了特定孤基因作为代谢物合成介质的不同作用。这些特性使OGs成为植物育种的重要基因资源，旨在提高特定性状，提高植物抗逆性和品质。然而，迄今为止，特定的OGs调控开花时间的研究在很大程度上被忽视了。
开花时间是决定繁殖成功和作物产量的重要农艺性状。植物可通过复杂的调控网络调整开花时间以维持繁殖成功率。到目前为止，已经确定了五条开花调控途径，包括年龄、光周期、激素、自主和春化途径，它们是成花转变的重要调控因子。这些通路整合了与开花相关多种信号的输入，并最终调控控制开花时间的重要基因的表达，包括APETALA1(AP1、AT1G69120)、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1(SOC1，AT2G45660)、FLOWERINGLOCUST(FT，AT1G65480)和植物特异性转录因子TF(LFY，AT5G61850)。FLOWERINGLOCUS C(FLC，AT5G10140)是开花和春化的中心抑制因子，可以抑制茎尖分生组织(SAM)花过渡相关的TF表达。自主途径可以通过抑制FLC，以独立于开花时间长度的方式促进开花在光周期途径中，CONSTANS(CO、AT5G15840)和FT的日周期表达模式受到一系列正负调控因子的调控，从而影响蛋白-蛋白相互作用、染色质结构特性、蛋白质稳定性和转录活性。昼夜节律与光周期调控植物从营养生长向生殖生长的转变密切相关。尽管其他激素包括茉莉酸、油菜素内酯、脱落酸、细胞分裂素和乙烯也在这一环境中发挥调节作用，赤霉素(GA)通路信号是调节开花活性的主要激素机制。miR156-SPL(SQUAMOSA PROMOTER BINDINGPROTEIN-LIKE)和miR172-AP2(APETALA2,AT4G36920))模块已被认为是年龄途径中的关键调控枢纽，促进植物在非诱导条件下开花。虽然这些结果为控制开花时间的机制提供了重要的见解，但这些途径之间的机制联系以及它们之间的调节尚未得到详细报道。
结球是大白菜和甘蓝最重要的农艺性状之一，一直收到研究者的关注。早熟抽薹对大白菜等白菜类作物的产量和品质有严重的不利影响，限制了其种植地区和种植季节因此，迫切需要培育具有较强抗抽薹能力的新品种。BrHIS4.A04(Bra035673)编码的组蛋白H4通过ABA信号通路抑制干旱条件下大白菜光周期开花基因的表达，从而防止提前抽薹。SETDOMAIN GROUP 8(BrSDG8，BraA07g040740.3C)是大白菜早期抽薹的额外调节因子，当该基因的功能被破坏时，FLCH3K6甲基化活性增加。白菜中BrFLC5(Bra022771)的表达水平低于其他两个BrFLC基因，为培育耐抽薹白菜品种提供依据。
本发明拟通过对前期发现的128个孤基因进行验证，筛选出导致大白菜开花延迟的关键调控因子，从而为耐抽薹大白菜新品种的培育开拓新的思路与基因源。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控大白菜抽薹开花时间的孤基因及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现该孤基因可以调控大白菜抽薹开花时间，从而为大白菜开花调控开辟了新思路和新基因，有利于培育耐抽薹新品种大白菜资源。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种调控大白菜抽薹开花时间的孤基因，所述孤基因为BrOG37基因，所述BrOG37基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种重组表达载体，包括上述的孤基因。
进一步地，所述重组表达载体为pCAMBIA 1305重组表达载体。
本发明还提供一种重组微生物菌株，包括上述的重组表达载体。
进一步地，所述重组微生物菌株为重组农杆菌。
本发明还提供上述的孤基因、重组表达载体或重组微生物菌株在延迟大白菜抽薹开花时间中的应用。
进一步地，所述孤基因的表达量升高时，所述大白菜的抽薹开花时间延迟。
本发明还提供一种延迟大白菜抽薹开花时间的方法，包括将上述的孤基因导入大白菜植株中，构建得到过表达所述的孤基因的转基因植株的步骤。
本发明公开了以下技术效果：
本发明研究发现，BrOG37基因可以调控大白菜抽薹开花时间。初步实验发现，过表达的转基因拟南芥BrOG37OE具有最显著的抽薹耐受表型。该基因对抽薹开花的影响也在大白菜中得到验证，大白菜过表达BrOG37植株表现出明显的晚抽薹表型。拟南芥BrOG37过表达株系在长、短日照条件下开花较晚，春化和赤霉素可促进其开花。本发明观察到，与野生型的叶片相比，拟南芥BrOG37OE植株的叶片全部呈现向内卷曲的状态，在角果成熟阶段，BrOG37OE植株花器官雄蕊比野生型大很多，还发现野生型的雌蕊花丝顶端的花药通常高于柱头，而BrOG37OE植株的花丝顶端的花药与柱头平齐或者在柱头之下。BrOG37在拟南芥组织中普遍表达。BrOG37蛋白定位在细胞膜。
本发明阐明了BrOG37参与调控大白菜开花的具体途径，BrOG37调控BrFLC这一开花从营养生长到生殖生长的关键基因的分子机制，为大白菜开花调控开辟了新思路和新基因，有利于培育抗抽薹新品种大白菜资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为过表达转基因拟南芥BrOG37OE植株和野生型拟南芥WT的叶片和植株表型；
图2为过表达转基因拟南芥BrOG37OE植株和野生型拟南芥WT的花器官的表型及雄蕊雌蕊的长度，比例尺＝1mm，数据为平均值±SE(n＝10)；
图3为过表达转基因拟南芥BrOG37OE植株和野生型拟南芥WT的显微镜下叶表皮毛的表型，比例尺＝2000μm；
图4为拟南芥BrOG37OE植株开花途径关键基因的表达情况检测结果；WT为野生型拟南芥，WTL和BrOG37OEL分别代表野生型和突变型叶片(Leaf，L)，WTSA和BrOG37OESA分别代表野生类型和突变体茎尖(ShootApex，SA)，星号代表t检验的显著差异(*，p<0.05，***，p<0.01，***，p<0.001)；
图5为春化(+Vrn)和非春化(-Vrn)处理下的BrOG37OE播种后第46天的表型以及数据分析结果；其中(A)为表型图；(B)为数据统计图；星号(*)表示t检验有显著性差异(*，p<0.05)，实验至少重复三次(n≥30)；
图6为GA处理(+GA)和非GA处理(-GA)下的BrOG37OE播种后第46天的表型以及数据分析结果；其中(A)为表型图；(B)为数据统计图；星号(*)表示t检验有显著性差异(*，p<0.05)，实验至少重复三次(n≥30)；
图7为长日照(LD)和短日照(SD)处理下的BrOG37OE的播种后第46天的表型以及数据分析结果；其中(A)为表型图；(B)为数据统计图；星号(*)表示t检验有显著性差异(*，p<0.05)，实验至少重复三次(n≥30)；
图8为BrOG37基因的亚细胞定位和表达特性检测结果；其中，(A)是亚细胞定位的结果，p35S:：GFP是空对照，YFP是质膜标记；(B)为启动子融合GUS的表达分析结果；(A)中标尺均为20μm；
图9为BrOG37在不同大白菜组织中的表达分析结果；其中，(a)为耐抽薹大白菜品种(BR型)和不耐抽薹大白菜品种(BN型)的示例；(b)为抽薹期BrOG37在BR型和BN型中表达模式的qRT-PCR分析；GP代表短茎顶端，TP代表内叶顶端，TP作为对照；数据为三个生物重复的平均值±SE；(c)低温处理的BrOG37在大白菜中的表达。以大白菜自交系‘BR9’为材料，图表中的星号代表t检验发现的显著差异(*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001)；
图10为过表达转基因大白菜GTOG37OE植株的表型鉴定结果；其中，(A)为GTOG37OE植株潮霉素抗性PCR鉴定分析，1-19分别代表BrOG37过表达植株19棵，WT代表白菜野生型非转基因植株GT-24；(B)为BrOG37在GT-24和GTOG37OE植物中的表达分析结果；(C)为春化和非春化条件下GT-24和GTOG37OE的表型；(D)为GT-24和GTOG37OE植株在春化和非春化处理下的表型数据分析，星号表示t检验有显著性差异(*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001)；数据为平均值±SE(n＝18)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中使用的引物信息如表1所示：
表1引物信息
实施例1
1.材料与方法
1.1植物材料和生长条件
植物材料包括大白菜自交系‘GT-24’，野生型拟南芥‘Col-0’和拟南芥BrOG37过表达转基因植株‘BrOG37OE’，大白菜BrOG37过表达转基因植株‘GTOG37OE’和本氏烟草。
本发明中使用的野生型拟南芥‘Col-0’来自英国诺丁汉拟南芥储备中心(NASC)，属于Col-0的加入品种。拟南芥在含3％蔗糖和0.7％琼脂(2：1)的营养土壤上生长，22±2℃，相对湿度为60％。长日照(LD)定义为光照16小时和8小时黑暗，短日照(SD)定义为8小时光照和16小时黑暗。
大白菜自交系‘GT-24’已在文献“Jiang M,Zhan Z,Li H,Dong X,Cheng F,PiaoZ*.2020.Brassica rapa orphan genes largely affect soluble sugarmetabolism.Horticulture Research,7:181.”中公开。
1.2 BrOG37序列分析
使用CD-Search工具在NCBI保守域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中搜索BrOG37中的保守域。
利用SignalP 5.0服务器(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0)对BrOG37中预测的信号肽序列进行识别。通过植物转录因子PlantTFDB数据库(PlantTFDB v5.0,http://planttfdb.gao-lab.org/)和GPS(Group-based PredictionSystem)在线服务器对孤基因BrOG37进行预测。采用大白菜基因组1.5版本进行结构变异分析(http://brassicadb.cn/)。
1.3质粒的构建与植物的遗传转化
根据HD Cloning Kit(Clontech，大连，中国)载体构建试剂盒使用说明，从白菜DNA中扩增出BrOG37基因(435bp)片段，并克隆到35S red载体中进行拟南芥过表达。用农杆菌菌株GV3101，以拟南芥野生型‘Col-0’作为遗传转化材料，利用拟南芥沾花法进行遗传转化。在卡那霉素培养基板上筛选T0代转基因植株。用潮霉素特异性引物(表1中hyg-F/R)进行PCR扩增转基因阳性植物的DNA，用qRT-PCR检测BrOG37在转基因植物中的表达情况，引物见表1中BrOG37-F/R。采用T3代纯合子进行后续试验。
以大白菜野生型‘GT-24’作为遗传转化材料，利用已建立的成熟稳定的大白菜转基因技术体系进行BrOG37基因的遗传转化，将目的基因克隆到pCAMBIA 1305载体中进行大白菜过表达转基因实验。采用农杆菌介导法在大白菜野生型‘GT-24’中进行遗传转化。采用PCR和Sanger测序对转基因植株进行分子鉴定，筛选出BrOG37纯合转基因植株‘GTOG37OE’。通过qRT-PCR检测以上转基因植株中BrOG37目标基因的表达水平，确保筛选出过表达的‘GTOG37OE’转基因植株。
BrOG37基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)如下：
ATGTTCACAAGAGCGTACACATGGGCACTCACCGGAGTGTACACAAGCGCATACACTGGAGCGTACACTACAGTGTACACTAGAGTGTACACGGTTGTACACCATATTGTACACCATAGTGTACACCATAGCGTACATTATGGTGTACATCGGAGTGTACACTGTAATGTACATGTGAGCGTACACTGGAGCGTCACATGTGCGTACACGTCGTACACCTTAGCGTACACTAGGGTGTACACTATAGCGTACACTAGGGTGTACACTATAGCGTACACTAGGGTGTACACTATAGCATACACTAGGTTGTACATCAGAGCGTACACGTTAGCGTACACTAGAGCATACACGGCGAACACCGGCGTACACATGGCATACATTTGGGCGTACATAGGAGTGCACACCAGACGTATATTACAATGTACAACACCATAG。
1.4开花时间测量
记录莲座叶的数量，抽薹时间以及第一朵花可见的天数(即为开花时间)。开花当日测量薹长和茎长。利用稳定的纯合T2代转基因植株进行表型观察，对转基因植株三个株系进行调查。这些植物是在长日照或短日照条件下种植的。当所比较的器官处于同一发育阶段时，测量突变体和野生型植物的叶片、花和种子的大小。每次测量和统计处理每个株系至少测量30-50株植物并取平均值。
1.5春化和赤霉素(GA)处理
对于GA处理，每周对长日照的植株喷洒两次20μM的GA，直到第一朵花出现。对于春化处理，将拟南芥的种子进行6周的4℃黑暗处理，然后转移到长日照条件下生长。每次测量和统计分析至少测量了20株植物并取平均值。采用单因素方差分析进行统计学分析(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
1.6总RNA提取和qRT-PCR
为了研究开花相关基因的表达水平，本发明收集了3周龄和4周龄的植株。植物只取样一次，并在生长室灯照4h后收集植株组织。总RNA用Trizol试剂提取，用不含RNase的DNase I处理。以第一链cDNA合成的500ng的RNA作为模板，进行qRT-PCR和半定量RT-PCR。热循环条件为：95℃30s；95℃5s，60℃20s，40个循环；95℃15s，65℃15s，检测熔融曲线。根据2-ΔΔCt方法，用Actin基因对相对转录水平进行归一化。qRT-PCR中使用的所有引物(AtFLC-F/R、AtFT-F/R、AtSOC1-F/R、AtLFY-F/R、AtVIN3-F/R、AtFRI-F/R、Actin-F/R)均列在表1中。
1.7 BrOG37的组织特异性表达
克隆BrOG37启动子序列(2kb)，构建到pCAMBIA 1305.1载体GUS基因上游，利用浸花法转化拟南芥，获得纯合植株进行GUS染色。将样品收集在离心管中，并将其放置在冰上的90％丙酮中15分钟，然后用染色缓冲液(50mM sodium phosphate，pH 7.2，0.2mM K3Fe(CN)6，0.2mM K4Fe(CN)6和0.2％Triton X-100)洗涤两次，然后加入含有终浓度2mM X-Gluc的染色缓冲液并在37℃下培养过夜，之后在70％乙醇中洗涤30分钟，最后在激光共聚焦显微镜下观察。
1.8 GFP融合蛋白的细胞定位分析
使用含GFP的pCAMBIA1302-GFP载体和BrOG37基因序列，构建35S-BrOG37-GFP瞬时表达载体，载体构建引物BrOG37OE-F/R见表1。构建完成的质粒转化农杆菌感受态GV3101，用于亚细胞定位实验。采用手动注射法，将携带35S-BrOG37-GFP和YFP Marker质粒的农杆菌混入烟草叶片中，利用激光共聚焦显微镜观察荧光。
1.9统计分析
实验至少重复3次。采用SPSS19.0软件对数据进行t检验或单因素方差分析。数据表示为平均值±SE。
2.结果
2.1 BrOG37序列分析结果
BrOG37属于无内含子基因，基因全长为435bp。在NCBI-CDD(Conserved DomainDatabase)和Pfam数据库搜索后发现此基因没有任何结构域；利用SignalP在线网站进行搜索，发现BrOG37蛋白无任何信号肽和剪切位点；在植物转录因子PlantTFDB数据库预测此基因并不属于转录因子；同时利用GPS(Group-based Prediction System)在线服务器进行预测，发现此基因并不具有激酶活性。该预测结果说明，BrOG37是一个全新的功能未知基因，可能作为膜受体蛋白传递信号或物质，具体功能有待于深入研究。
2.2 BrOG37延迟拟南芥抽薹开花及关键开花基因的表达分析
检测发现，长日照条件下的过表达BrOG37的拟南芥转基因植株BrOG37OE显著延迟开花时间，开花时间平均延后33天(表2)。
表2 BrOG37OE拟南芥植株的表型数据
| 表型 | WT | BrOG37OE |
| 开花时间(天数) | 30.6±0.6 | 63.3±1.5*** |
| 开花时间(莲座叶数) | 16.2±0.5 | 31.7±0.7*** |
| 莲座半径(毫米) | 89.9±2.1 | 63.2±1.8*** |
| 茎高(厘米) | 48.3±3.0 | 49.8±3.7 |
| 角果长度(毫米) | 12.6±0.2 | 5.4±0.2*** |
| 种子/长角果(个) | 53.7±0.7 | 14.1±1.0*** |
| 叶长(毫米) | 30.6±3.1 | 20.6±1.7** |
注：测量值为每株18株植物的平均值±SE。
BrOG37OE植株的叶片全部呈现向内卷曲的状态，在角果成熟阶段，BrOG37OE植株比野生型(WT)植株矮，见图1。BrOG37OE植株花的大小与WT相比没有太大差异，但BrOG37OE植株的雄蕊比WT大很多。WT的雌蕊花丝顶端的花药通常高于柱头，而BrOG37OE植株的花丝顶端的花药与柱头平齐或者在柱头之下。花器官(花瓣、花瓣、雄蕊和雌蕊)的数目与WT是相同的，见图2。进一步观察WT和BrOG37OE植株的莲座叶上的表皮毛发育状况，发现与WT相比没有明显差别，均以3-4分支为主，见图3。
为了研究开花时间延迟是否与开花调节因子的表达变化有关，采用qRT-PCR比较了拟南芥BrOG37OE过表达植株和WT叶片与茎尖中的开花相关基因的表达水平，结果见图4。分析表明开花途径关键基因的表达量均与延迟开花的表型一致。在BrOG37OE植株的叶片和茎尖中，AtFT和AtSOC1的表达均显著下调，并且AtLFY在突变体的茎尖中的表达与AtFT和AtSOC1相似，而AtLFY在BrOG37OE和WT叶片中的表达均未检测到。此外，AtFLC在叶片和茎尖中相比于WT分别显著增加了近58倍和13倍，且春化途径的AtFRI和AtVIN3在茎尖中均显著下调，推测BrOG37可能通过春化途径激活了AtFLC转录来延迟开花。
2.3 BrOG37OE植株响应春化和GA处理
为了检测BrOG37OE对春化的响应，将BrOG37OE种子进行催芽并在4℃条件下生长6周，然后转移到正常温度条件。春化处理的BrOG37OE植株比未经春化处理的植株开花早得多，大约在34天左右开花，总莲座叶数平均为10；未经春化处理的植株开花天数约为52天。未经春化处理的BrOG37OE植株的莲座叶数平均为18片，春化处理也缩短了突变体的开花时间(图5)。春化不能完全恢复开花时间可能是由于春化促进开花的两种机制：依赖FLC的途径和不依赖FLC的途径。
为了分析GA对突变体开花的影响，每周对植株喷洒两次20μM GA溶液，直到开花。在GA处理下，WT和BrOG37OE植株在10-13片莲座叶时开花。BrOG37OE和WT植株的平均开花天数分别为41天和30天。未进行GA处理的BrOG37OE植物和WT植株的开花天数分别为50天和37天，莲座叶的平均数量分别为18和13(图6)。结果表明GA极大地刺激了BrOG37OE植株的开花。
这些观察结果表明，BrOG37OE植株对春化和GA都有积极响应。因为自主途径突变体的开花可以被春化或GA逆转，猜测BrOG37可能参与了自主或春化途径。
2.4 BrOG37OE在LD和SD处理中的开花时间分析
为了确定拟南芥BrOG37OE植株的晚开花表型是否与光周期途径有关，在LD和SD条件下测量了WT和BrOG37OE植株的开花时间(图7)。在LD条件下，WT植株在播种后34天左右开始产生花序，而BrOG37OE植株在播种后73天左右开始产生花序。在SD条件下，BrOG37OE植株比WT植株开花时间晚得多。众所周知，延迟开花的植株在开花时会形成更多的莲座叶。无论是在LD还是SD条件下，BrOG37OE植株的莲座叶数约为23，WT的莲座叶数约为16。因此，在LD和SD条件下，BrOG37OE植株抽薹开花时间均晚于WT，而总的莲座叶也更多。这表明BrOG37OE不参与开花控制的光周期途径。
2.5 BrOG37的亚细胞定位
为了确定BrOG37的亚细胞定位，将携带35S-BrOG37-GFP和YFP Marker质粒的农杆菌混合注射烟草叶片中，利用激光共聚焦显微镜观察荧光。细胞中瞬时表达的融合蛋白的荧光信号分布表明，BrOG37定位在细胞膜上，见图8中(A)。
2.6 BrOG37的表达模式分析
将BrOG37启动子序列(2kb)克隆并构建到pCAMBIA1305.1载体的GUS基因上游，利用浸花法转化拟南芥，获得纯合植株进行GUS染色。结果表明在BrOG37启动子驱动下，GUS报告基因在茎尖、叶脉、雄蕊、雌蕊和种子中高亮表达，见图8中(B)。
2.7 BrOG37在大白菜中的表达分析
由于孤基因BrOG37在拟南芥中表现出明显的晚抽薹现象，接着本发明又观察了BrOG37在大白菜中的表达情况。对耐抽薹和不耐抽薹的大白菜品种中BrOG37的表达量进行分析。本发明实验室培育的大白菜自交系分为两类：耐抽薹型(BR型)和不耐抽薹型(BN型)。耐抽薹品种的大白菜生长点表现为短茎圆顶，而不耐抽薹品种的大白菜生长点表现为长茎尖顶。选取10个BR型品种和10个BN型品种，分析了BrOG37在结球期的表达模式。以生长点顶端(GP)和内叶顶端(TP)进行比较，TP做为对照，如图9中(a)所示，BrOG37在BR型的所有材料中的表达量均显著增加，但在BN型中显著下调，见图9中(b)。这些结果进一步证实了BrOG37与大白菜耐抽薹相关。
以大白菜自交系‘GT-24'为材料，低温(4℃)处理，分析BrOG37的表达模式。处理后，BrOG37表达相对于对照显著下调。春化处理大白菜后BrFLC的表达也受到抑制，促进了大白菜从营养生长向生殖生长的转变，见图9中(c)。
2.8大白菜过表达植株GTOG37OE的表型鉴定与分析
对BrOG37过表达的大白菜T2代GTOG37OE植株进行了PCR验证，发现19棵均为阳性植株，见图10中(A)；又验证了GT-24和GTOG37OE植株中BrOG37基因的表达量，发现在GTOG37OE植株中BrOG37基因的表达量显著升高，进一步验证GTOG37OE是阳性株系，见图10中(B)。
为了进一步了解孤基因BrOG37对大白菜表型的影响，对大白菜野生型(GT-24)和GTOG37OE植株在春化与未春化条件下进行表型调查，结果见图10中(C)。无论是春化还是未春化处理，GTOG37OE植株的抽薹时间和开花时间均晚于GT-24植株，GT-24植株开花时的莲座叶数多于GTOG37OE植株，GT-24植株的茎长与薹长均高于GTOG37OE植株，见图10中(D)。
综上所述，本发明研究发现，BrOG37基因可以调控大白菜开花时间。初步实验发现，过表达的转基因拟南芥BrOG37OE植株具有最显著的耐抽薹表型。该基因对抽薹开花的影响也在大白菜中得到验证，大白菜过表达BrOG37植株GTOG37OE也有延迟抽薹开花的表型。拟南芥BrOG37过表达植株在长、短日照条件下均开花较晚，春化和赤霉素可促进其开花。本发明观察到，与野生型的叶片相比，拟南芥BrOG37OE植株的叶片全部呈现向内卷曲的状态，在角果成熟阶段，BrOG37OE植株花器官雄蕊比野生型大很多，还发现野生型的雌蕊花丝顶端的花药通常高于柱头，而BrOG37OE植株的花丝顶端的花药与柱头平齐或者在柱头之下。BrOG37在拟南芥组织中普遍表达。BrOG37定位在细胞膜。
本发明阐明了BrOG37参与调控大白菜开花的具体途径，为大白菜开花调控开辟了新思路和新基因，有利于培育抗抽薹新品种大白菜资源。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种调控大白菜抽薹开花时间的孤基因，其特征在于，所述孤基因为BrOG37基因，所述BrOG37基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的孤基因。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pCAMBIA1305重组表达载体。
4.一种重组微生物菌株，其特征在于，包括权利要求2或3所述的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组微生物菌株，其特征在于，所述重组微生物菌株为重组农杆菌。
6.一种如权利要求1所述的孤基因、权利要求2或3所述的重组表达载体或权利要求4或5所述的重组微生物菌株在延迟大白菜抽薹开花时间中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述孤基因的表达量升高时，所述大白菜的抽薹开花时间延迟。
8.一种延迟大白菜抽薹开花时间的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的孤基因导入大白菜植株中，构建得到过表达所述的孤基因的转基因植株的步骤。
Priority Applications (1)
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