CN113234720A - 小麦长链非编码RNAlncR156及其在调控小麦响应干旱胁迫中的应用 - Google Patents

小麦长链非编码RNAlncR156及其在调控小麦响应干旱胁迫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种小麦长链非编码RNAlncR156及其在调控小麦响应干旱胁迫中的应用。本发明克隆得到小麦lncR156，lncR156在小麦干旱胁迫条件下表达量显著提高。通过病毒诱导的基因沉默技术，构建VIGS沉默载体，转染小麦叶片，获得了小麦lncR156基因沉默株系，其沉默株系lncR156的表达量显著降低，耐旱性下降。小麦lncR156在烟草中过表达，过表达株系在干旱胁迫处理后根长明显增加，耐旱性增强。结果表明小麦长链非编码RNA lncR156有干旱胁迫响应的功能，可以应用于后续抗旱小麦培育。

Description

小麦长链非编码RNAlncR156及其在调控小麦响应干旱胁迫中 的应用
技术领域
本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种小麦长链非编码RNA及其在植物耐旱功能中的应用。
背景技术
小麦是世界上总产量位居第二的粮食作物。干旱严重影响小麦产量和质量，造成巨大经济损失，研究抗旱相关基因功能及干旱应答分子机制来改良小麦性状，对于提升小麦育种质量及保证粮食安全具有重要的现实意义。
长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）占全部非编码RNA的80%以上，其分子长度在200 nt以上，不具备编码蛋白质的功能，但其通过转录水平或转录后水平调控基因表达，产生相应的生物学功能，近年来研究发现植物lncRNA主要通过多种调控机制，参与植物开花、雄性不育、营养代谢、生物和非生物胁迫等生物学过程。尽管近年来植物lncRNA的研究取得了一定进展，多个物种的lncRNA被分离鉴定并开展了部分功能机制研究，但是整体看来植物lncRNA的研究仅仅是冰山一角，目前小麦lncRNA的研究还很有限，其功能及机制研究不够深入。开展小麦lncRNA研究，有助于解析lncRNA在小麦抵御逆境胁迫下的功能及调控机制，为培育优良抗性小麦提供新思路。
发明内容
本发明提出了一种小麦长链非编码RNAlncR156及其在植物耐旱功能中的应用。
本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种小麦长链非编码RNAlncR156，所述lncR156的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。SEQ ID NO:1所示的序列为非编码RNAlncR156的转录组序列，SEQ ID NO:2所示的序列为非编码RNAlncR156的基因组序列。lncR156在小麦干旱胁迫条件下表达量显著提高，为小麦干旱响应基因。
用于扩增上述一种小麦长链非编码RNAlncR156的引物对，引物序列为：
lncR156-1F：5’-GGCAGCTGTCCGCCGACCAAG-3’；
lncR156-1R：5’-TTGTACAGTATAAGATAATGGT-3’。
第二方面，本发明提供上述小麦长链非编码RNAlncR156在植物响应干旱胁迫中的应用。
具体的，过表达lncR156的转基因植物抗旱性能提高，转基因植株表现为根长增加。lncR156基因沉默株系中植物抗旱性能降低，表现为植株相对含水量、叶绿素含量、可溶性糖含量降低。
第三方面，本发明还提供小麦长链非编码RNAlncR156在小麦抗旱品种选育中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明发现了小麦长链非编码RNA，lncR156，并构建了基因沉默表达载体及过表达载体，分别获得了小麦lncR156基因沉默株系和转化烟草的过表达株系。分析发现lncR156基因沉默株系中抗旱功能降低，而过表达株系中抗旱功能增强，表明lncR156具有正向调控小麦的抗旱功能。本发明的lncR156可用于改良小麦抗旱性能，对于培育抗旱小麦新品种具有重要的意义。
附图说明
图1 为小麦lncR156 克隆PCR扩增电泳图；图中第一泳道为DL2000 DNA Marker，第二泳道为lncR156。
图2为小麦lncR156基因结构分析图。
图3为小麦lncR156器官特异性表达结果图。种子中基因表达量设为1，其他器官以相对表达量显示，*表示差异显著(p<0.05); **表示差异极显著(p<0.01)。
图4为小麦lncR156在不同胁迫处理下的表达情况图。对照组中基因表达量设为1，其他处理组以相对表达量显示，*表示差异显著(p<0.05); **表示差异极显著(p<0.01)。
图5为基因沉默重组表达载体鉴定结果图，A，酶切鉴定结果，第一泳道为DL2000DNA Marker，第二泳道为重组质粒pTRV2-lncR156，第三泳道为重组质粒pTRV2-lncR156酶切产物。B菌液PCR鉴定结果，第一泳道为DL2000 DNA Marker，第2～5，8～10泳道为阳性转化子，6～7为阴性转化子。
图6为小麦不同株系中lncR156相对表达量，其中，WT表示野生型，VC表示转入空载体的对照株系，VIGS:IncR156表示小麦lncR156基因沉默株系。
图7为小麦不同株系干旱控水2周后表型图。其中，WT表示野生型，Vector表示转入空载体的对照株系，VIGS:IncR156表示小麦lncR156基因沉默株系。
图8为小麦不同株系干旱胁迫2周后的生理指标相对水含量、叶绿素含量、可溶性糖含量检测结果图。其中，WT表示野生型，VC表示转入空载体的对照株系，VIGS:IncR156表示小麦lncR156基因沉默株系。
图9为lncR156转基因株系基因组鉴定（A）和转录组鉴定（B）结果图。图中，35S:IncR156表示转基因株系。A中第一泳道为DL2000 DNA Marker，第2～11泳道为待转基因株系，其中2-3,8-11为阳性株系，4-7为阴性株系。B中WT表示野生型，VC表示转空载体的对照株系。
图10为不同株系在甘露醇处理下的根长。WT表示野生型，VC表示转空载体的对照株系，35S:IncR156表示转基因株系。
图11为不同株系在干旱处理下表型。WT表示野生型，VC表示转空载体的对照株系，35S:IncR156表示转基因株系。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
一、材料
1. 小麦为中国春品种（Triticumaestivum L. Chinese Spring）。
2. 所用试剂、载体、细胞为常规实验材料。
二、方法与结果
1. 小麦lncRNA克隆
1）小麦lncR156克隆
使用植物RNA提取试剂盒（天根生物）提取小麦叶片总RNA，取2μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳方法检测总RNA完整度。利用反转录试剂盒（大连宝生物）进行cDNA第一链的合成，作为模板备用。同时用植物DNA提取试剂盒（天根生物）提取小麦DNA作为模板备用。根据前期转录组测序数据（ Liu et al. 2015， BMC Plant Biology 15:152）筛选到一个小麦lncRNA，命名为lncR156，如SEQ ID NO:1所示，依据其序列设计基因全长扩增引物，用小麦cDNA和DNA分别做模板进行PCR扩增。
引物序列为 lncR156-1F：5’-GGCAGCTGTCCGCCGACCAAG-3’；
lncR156-1R：5’-TTGTACAGTATAAGATAATGGT-3’。
反应体系为：模板1.5μL，上下游引物各0.5μL，10×PCR buffer（Mg2+）2μL，dNTP1.5μL，Taq酶 0.1μL，补ddH2O至总体积20μL，PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃30 s；72℃ 90 s，35个循环；72℃ 10 min。产物纯化回收连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性转化子送测序。测序正确的阳性转化子记为pMD18T-lncR156重组克隆载体。
2）lncR156序列分析
将测序后的小麦lncR156序列在NCBI进行同源性比对，并分析其开放阅读框ORF。利用GSDS软件分析lncR156的基因结构。利用lncRNA亚细胞定位预测工具lncLocator（http://www .csbio .sjtu .edu .cn/bioinf/lncLocator/）分析亚细胞定位情况。通过CPC软件分析lncR156的编码能力，利用软件RegRNA2.0 （http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/detection. htmL）分析lncR156核糖体结合位点。
结果如下：
以小麦cDNA为模板克隆得到了小麦lncR156，经过测序后的序列分析，该序列708bp（图1），如SEQ ID NO:1。以小麦DNA为模板，克隆得到lncR156 gDNA序列为817 bp。基因结构分析lncR156有一个内含子（图2）。通过数据库比对及序列分析该lncRNA定位在小麦D5染色体组上。
将lncR156的cDNA序列在NCBI数据库中进行同源比对，仅有一个小麦EST序列（AK332714.1）同源性相对较高，且覆盖片段较短，为478bp，该EST片段功能未知。ORF分析显示，lncR156有一个编码区，编码一个含63个氨基酸的小肽。将该小肽序列在NCBI中进行同源比对，没有同源序列，利用Pfam数据库对这个小肽序列进行检索也未发现有功能结构域。通过CPC软件对lncR156的编码能力进行预测，结果显示lncR156是非编码RNA，不具有编码能力，且lncR156没有核糖体结合位点，说明没有翻译蛋白这个过程。此结果说明小麦lncR156保守性较差且功能未知，不具有编码能力，是一个新的非编码RNA。
2. 小麦lncRNA表达分析
1）材料处理及RNA提取
应用小麦品种“中国春”。将该品种种子材料在在23℃的温室条件下和16小时光照，8小时黑暗光周期下培养2周。用150 mMNaCl或20% PEG6000(w/v)处理幼苗，分别模拟高盐、干旱胁迫条件；另在4℃条件下培养幼苗，以模拟寒冷的压力条件。以正常条件下生长的幼苗为对照。在处理后的6小时采集叶片，提取RNA用作基因表达分析。另外，从开花植物中采集根、茎、叶、穗、粒（授粉后10天），进行器官特异性基因表达分析。使用植物RNA提取试剂盒（天根生物）提取小麦叶片总RNA，利用反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成，作为模板备用。
2）qRT-PCR分析
使用SYBR®PremixExTaq™通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析检测不同器官、不同逆境胁迫反应中基因表达的变化。通过熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳确定引物的高特异性和高效率，引物对的扩增效率为介于0.9和1.1之间。内参基因为TaActin，每个样品包含三个重复，基于2-ΔΔCt方法评估靶基因的相对表达水平。三次重复做标准误，*表示P<0.05, **表示P<0.01。
qRT-PCR引物为：
lncR156-2F：5’-TGTCCGCTTGCTGTTTCC-3’；
lncR156-2R：5’-GAGTAGTACAATCGTACCGTGT-3’。
结果显示：对不同小麦组织器官、不同胁迫处理的样品提取RNA，用荧光定量PCR法检测，采用2-ΔΔCT法分析数据计算基因的相对表达量。组织特异性表达分析中将lncR156在种子中的表达量设定为1，其他器官中表达以相对表达量表示。结果显示，lncR156在小麦不同器官组织中表达存在差异，其中在叶中表达量较高，茎、根中表达量次之，穗和种子中相对表达量较低，如图3所示。
在不同胁迫处理下的表达结果如图4所示，lncR156广泛响应低温（4℃）、PEG和NaCl处理，表达显著上调，其中PEG模拟的干旱处理相比对照组表达量上调15倍以上，说明lncR156可以响应干旱、高盐、低温等多种胁迫。
3. 小麦lncR156基因沉默株系构建及抗旱功能分析
1）基因沉默载体构建
按照小麦lncR156基因的序列设计引物，在上下游分别添加特异性酶切位点EcoRI和Xho I，所述引物为lncR156-3F和lncR156-3R，具体如下：
lncR156-3F：5’-CGGAATTCGGCAGCTGTCCGCCGACCAAG-3’；
lncR156-3R：5’-CCGCTCGAGGTACAGTATAAGATAATGGT-3’。
以pMD18T-lncR156克隆载体为模板，反应体系及反应条件参照1.1部分。反应产物通过酶切连接表达载体pTRV2，转化大肠杆菌感受态细胞，并用卡那霉素抗性筛选，菌落PCR检验，阳性转化子送测序鉴定，见图5。阳性转化子记为pTRV2-lncR156大肠杆菌转化子。
2）农杆菌转化
取 2μL测序成功的重组表达载体 pTRV2-lncR156质粒加入到 100 μL农杆菌GV3101感受态细胞中，移液枪轻轻吸打混匀，混匀后置于冰上静置10 min，立即投入液氮中速冻5 min，随后 28 ℃水浴锅加热5 min。立即取出加入1 mL不含抗生素的LB液体培养基，放入28 ℃，200 rpm摇床振荡培养5 h。培养完成后放入离心机5500 rpm，离心 2 min，弃取上清，余约100 μL沉淀，用枪头轻轻吸打混匀。涂布卡那霉素和利福平双抗性平板，28 ℃培养2天，至有抗性菌落长出，菌落PCR验证阳性转化子。阳性转化子记为pTRV2-lncR156农杆菌转化子。
3）侵染小麦
取新鲜培养的pTRV1、pTRV2（空载体）、pTRV2-PDS（阳性对照）和pTRV2-lncR156转化农杆菌的单菌落，分别接种到3mL LB培养基（卡那：100μg/mL；利福平：50μg/mL），28℃、170rpm摇床培养16h。16h后以分别以1%的接入量加到50mL的LB培养基（卡那：100μg/mL；利福平：50μg/mL）扩大培养12h左右，当菌液OD600的值为0.5～2左右时，4000rpm离心10分钟收集菌体细胞。以重悬液（10 mM MgCl2,10mM MES 以及200 μMacetosyringone乙酰丁香酮）重悬菌体至终浓度OD600为2.0，28℃下避光静置3h。3h后将pTRV1分别与pTRV2空载体，pTRV2-PDS（阳性对照），pTRV2-lncR156转化子按1:1(v/v)比例混匀后得到样品用于接种。
戴上乳胶手套，将10μL样品加于食指指腹上，并将拇指与食指轻轻摩擦，使样品均匀分布于拇指与食指指腹，压住叶片，沿着植株第二叶叶片伸展的方向，从叶底部连续摩擦到叶尖（约10～15次），每个样品各接种一盆（7～10棵）。接种完成后，将小麦幼苗移入盒子中，并向幼苗喷施DEPC水，塑料保鲜膜覆盖，保湿48h，移去塑料膜，24℃/16h光照，20℃/8h黑暗培养。转空载体植株为负对照，转PDS基因为阳性对照，确保沉默效果及沉默时间。当VIGS：PDS株系（转pTRV2-PDS株系）叶片变白，控水2周模拟干旱处理。并提取各株系叶片RNA，反转录为cDNA，qRT-PCR测定lncR156的表达量，验证基因沉默效果，具体方法见2.2。
干旱处理2周后观察表型，统计存活率，分别测定各株系的相对含水量，叶绿素含量，可溶性糖含量，以检测基因沉默株系在干旱胁迫响应下的生理表现。
结果如下：
1）如图5所示，通过限制性酶切与连接反应将lncR156全长序列连接到pTRV2载体上，对大肠杆菌转化子进行菌液PCR检测并测序验证，结果表明成功构建了pTRV2-lncR156重组表达载体。经过测序验证正确的转化子转入农杆菌，经过PCR检测正确的农杆菌菌液用于后续的基因沉默实验。
2）检测野生型、空载体对照和沉默株系中lncRNA的表达量，基因沉默株系中lncR156相对表达量明显降低，说明通过VIGS技术成功获得了小麦lncR156基因沉默株系，如图6所示。将野生型、空载体对照和沉默株系干旱控水2周后分析表型及存活率，结果显示lncR156沉默株系对干旱胁迫耐受性降低，如图7所示。检测干旱胁迫2周后的各株系的生理指标，如图8所示，相比野生型、空载体对照，小麦lncR156基因沉默株系中相对含水量、叶绿素含量、可溶性糖含量降低，结果表明lncR156有干旱胁迫应答功能。
4. 小麦lncR156过表达株系构建及抗旱功能分析
4.1 lncR156过表达载体构建
按照小麦lncR156基因的序列设计引物，在上下游分别添加特异性酶切位点BglII和Spe I。所述引物为lncR156-4F和lncR156-4R，具体如下：
lncR156-4F：5’-GAAGATCTGGGCAGCTGTCCGCCGACCAAG-3’；
lncR156-4R：5’-GGACTAGTGTACAGTATAAGATAATGGT-3’。
以pMD18T-lncR156克隆载体为模板，反应体系及反应条件参照1.1部分。反应产物通过酶切连接表达载体pCAMBIA1304载体，转化大肠杆菌感受态细胞，并用卡那霉素抗性筛选，菌落PCR检验，阳性转化子送测序鉴定。阳性转化子记为pCAMBIA1304-lncR156大肠杆菌转化子。
4.2农杆菌转化
取2μL测序成功的重组表达载体 pCAMBIA1304-lncR156质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中，转化及鉴定方法同3.2。
4.3叶盘法转化烟草
选取生长状况较好的烟草叶片，清洗干净后用75%乙醇浸泡10 s，0.1% 的HgCl2消毒处理10 min，后用无菌水清洗5次；用刀片切割烟草叶片为约1×1 cm2的小块，放入含重组质粒的农杆菌菌液中进行侵染10 min，期间要不断晃动使叶片充分接触农杆菌菌液，侵染结束后将叶片取出放在灭菌滤纸上吸干叶片附着菌液；后将叶片平铺于垫有无菌滤纸的共培养培养基平板上，28℃下暗培养3 d；后将烟草叶片转移到分化培养基上，28℃光照培养，至分化出芽。当再生芽长到2-3 cm时，切下芽体插于生根培养基中，28℃光照培养至生根；待根系生长较发达时移栽沙土盆中进行温室培养。剪取转基因烟草叶片分别提取基因组DNA及总RNA，在DNA水平PCR扩增lncR156筛选阳性植株。以烟草NtActin为内参基因，用半定量RT-PCR在RNA水平检测阳性株系的基因转录水平。阳性株系收获种子，并筛选繁育到T2代纯系。
4.4干旱处理及表型分析
经过鉴定的转基因阳性株系种子和野生型烟草种子在MS培养基中萌发一周，后转移至含150 mM甘露醇的MS培养基上垂直培养一周，统计根长。将筛选后的阳性烟草种子在选择性培养基中萌发，两周后移栽至沙土培养基质中。在正常条件下培养三周后控水处理20天，观察各株系表型，并统计存活率。
结果如下：
1）转基因烟草的鉴定
因小麦遗传转化成功率较低且时间较长，在烟草中过表达lncR156进行初步功能验证。通过限制性酶切位点的酶切与连接反应，成功构建了过表达载体pCAMBIA1304-lncR156。利用农杆菌介导法将过表达载体pCAMBIA1304-lncR156转入烟草中。通过愈伤组织进行芽诱导和根诱导，最终得到了转基因株系。提取转基因株系的DNA和RNA，分别在基因组水平和转录水平鉴定转基因株系。结果如图9所示，鉴定株系中有6个株系lncR156插入了烟草基因组中。通过转录分析，筛选转录水平表达量高的株系进行后续干旱胁迫功能分析。
2）转基因株系干旱胁迫下功能分析
用含有150 mM甘露醇的MS培养基模拟渗透胁迫，根长分析显示，相比野生型和转空载体对照组，过表达lncR156株系根长显著增加，如图10所示。在正常条件下培养三周后控水处理20 d，相比野生型和空载体对照，过表达株系有更高的存活率。结果表明过表达lncR156的转基因株系在干旱胁迫处理下发挥功能，有更强的抗旱性能，如图11所示。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南城建学院
<120> 小麦长链非编码RNAlncR156及其在调控小麦响应干旱胁迫中的应用
<130> 无
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 708
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 1
ggcagctgtc cgccgaccaa gccagctcac atccttctgg tagcttcggc gaccgtacta 60
cataagcacc cctgccccag acgctgaaac caccatcagc ttccatactt cctcttgagc 120
agctatccac tctccatcca tctttcctct gcgagatcag cgacatgtcg acgactgaca 180
ccagctcacc caaggacgca cccctgccgg agaacagcgc cccggcggtg gcggcaggca 240
gcgagccgac ggtgacaaag acggtgcaga cggtggaggt gaggcagtcg gcggggcagg 300
aggaggggga ggggacgatc aagccgatcg aggtggtgca cgagatcccg gccaaggagc 360
ctgctactaa gcaagagtag cagagcacaa cgaatcgaga aaagcagtgt gattggtaaa 420
atggtggtgt ccgcttgctg tttcccggtt gagtaaatcg ccggttgaaa cccctgtttt 480
tactttggag aactgaagtg attggaatat ctttgttttc ggtaaataat aatgagcatt 540
tttagcgcca ctaagattga acttacgagc atgcagtact accggaattg tgctattgtc 600
tgtccatttt cgcgaccaaa aggaaagacg tggtactgtt actcttttta cacggtacga 660
ttgtactact ccctccattc tcttatacca ttatcttata ctgtacaa 708
<210> 2
<211> 817
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 2
ggcagctgtc cgccgaccaa gccagctcac atccttctgg tagcttcggc gaccgtacta 60
cataagcacc cctgccccag acgctgaaac caccatcagc ttccacactt cctcttgagc 120
agctatccac tctccatcca tctttcctct gcgagatcag cgacatgtcg acgactgaca 180
ccagctcacc caaggtacgc aggccctatg catatatacg atgctgttta attgatgttg 240
attggccgaa aatccccatt ttgttttgag actaacatat gtacgatctg atgaacatta 300
aaggacgcac ccctgccgga gaacagcgcc ccggcggtgg cggcaggcag cgagccgacg 360
gtgacaaaga cggtgcagac ggtggaggtg aggcagtcgg cggggcagga ggagggggag 420
gggacgatca agccgatcga ggtggtgcac gagatcccgg ccaaggagcc tgctactaag 480
caagagtagc agagcacaac gaatcgagaa aagcagtgtg attggtaaaa tggtggtgtc 540
cgcttgctgt ttcccggttg agtaaatcgc cggttgaaac ccctgttttt actttggaga 600
actgaagtga ttggaatatc tttgttttcg gtaaataata atgagcattt ttagcgccac 660
taagattgaa cttacgagca tgcagtacta ccggaattgt gctattgtct gtccattttc 720
gcgaccaaaa ggaaagacgt ggtactgtta ctctttttac acggtacgat tgtactactc 780
cctccattct cttataccat tatcttatac tgtacaa 817

Claims (6)

1.一种小麦干旱响应基因，其特征在于，所述干旱响应基因为长链非编码RNAlncR156，所述lncR156的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的麦长链非编码RNAlncR156在植物响应干旱胁迫中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，过表达lncR156的转基因植物抗旱性能提高。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物通过根长增加来提高抗旱性能。
5.权利要求1所述的小麦长链非编码RNAlncR156在小麦抗旱品种选育中的应用。
6.用于扩增权利要求1所述小麦长链非编码RNAlncR156的引物对，其特征在于，引物序列为 lncR156-1F：5’-GGCAGCTGTCCGCCGACCAAG-3’；
lncR156-1R：5’-TTGTACAGTATAAGATAATGGT-3’。
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