CN113549602B

CN113549602B - 毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1及其应用

Info

Publication number: CN113549602B
Application number: CN202110796933.6A
Authority: CN
Inventors: 李雪平; 李夷骞; 宋笑龙; 杨旸
Original assignee: International Center for Bamboo and Rattan
Current assignee: International Center for Bamboo and Rattan
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2041-07-14
Also published as: CN113549602A

Abstract

本发明公开了毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1及其应用。PeAPX1基因及其编码蛋白质的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明首次从毛竹中克隆得到PeAPX1基因并通过在拟南芥中过表达该基因验证了其生物学功能。PeAPX1基因具有调控植物抗逆性的功能，能够为毛竹转基因研究提供有力支持，为毛竹分子育种提供有价值的候选基因。

Description

毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1及其应用。

背景技术

毛竹(Phyllostachys edulis)是禾本科(Gramminales)竹亚科(Bambusoideae)刚竹属(Phyllostachys)散生竹种。毛竹具有成材快，可再生等多种优势，更在生物能源开发，防治水土流失等方面具有巨大潜力。在影响毛竹生长的诸多因素中，水分是对其正常生长发育影响最大的因素之一。近年来，受全球气候变暖的影响，毛竹的主要生长地年降水量逐年减少，干旱问题频发，大大影响了竹子的生长状况，也降低了毛竹的经济收益。在南竹北移工作中，最难克服的也是引种地降水少，土地盐碱度高的问题。因此，进行毛竹的竹种改良，培育抗早、抗盐性强的毛竹新品种非常必要。研究逆境条件下毛竹体内相关基因的功能则是进行新品种培育的分子基础工作，对于揭示竹子的抗逆分子机制，进而突破常规育种的局限性，加快竹子育种进程具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

毛竹PeAPX1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明采用如下方法克隆得到PeAPX1基因：

⑴以毛竹叶和根为材料提取总RNA，并将提取得到的总RNA反转录为cDNA。本发明中，可以采用本领域常用的提取细胞总RNA的方法进行毛竹总RNA的提取，例如Trizol法。

⑵将提取得到的毛竹总RNA反转录合成cDNA。本发明中，可以采用本领域常规的cDNA合成方法，例如可采用Promega公司的cDNA合成试剂盒进行cDNA的合成。

⑶在得到cDNA之后，进行PeAPX1基因的PCR扩增，得到目的片段。

⑷PCR扩增得到目的片段后，对目的片段进行测序，得到PeAPX1基因。在PCR扩增后对目的片段进行纯化，对于纯化的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DNA纯化试剂盒进行即可。

⑸纯化完成后，将纯化后的目的片段连接到pGEM-T Easy载体，导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经菌落PCR验证为阳性克隆后进行测序。

第二方面，本发明提供含有毛竹PeAPX1基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌、转基因细胞系或非可再生的植物部分。

第三方面，本发明提供毛竹PeAPX1基因或含有该基因的生物材料在植物抗逆调控(提高植物抗逆性)中的应用。其中，所述抗逆是指抗干旱、耐盐和耐低温。

本发明所述植物包括但不限于拟南芥、毛竹。

第四方面，本发明提供毛竹PeAPX1基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。

第五方面，本发明提供本发明还提供毛竹PeAPX1基因或含有该基因的生物材料在植物育种中的应用。

所述育种目的是为提高植物抗胁迫能力。PeAPX1基因参与毛竹干旱、盐、低温胁迫应答，逆境胁迫可诱导该基因的表达。

第六方面，本发明提供一种提高植物抗旱抗盐能力的方法，包括：利用基因工程手段，在植物中过量表达毛竹PeAPX1基因。

所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

5)通过导入增强子。

本发明中，携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中。

进一步地，可采用农杆菌介导法将毛竹PeAPX1基因转入到拟南芥植株中，获得该基因过表达的转基因植株。

优选地，将毛竹PeAPX1基因构建到植物表达载体pCAMBIA2300上，转化农杆菌，然后浸染拟南芥花序，筛选转基因植株。

在本发明的一个具体实施方式中，植物表达载体pCAMBIA2300-PeAPX1的构建方法如下：

以反转录合成的cDNA为模板，进行PCR反应，在PeAPX1基因的上、下游分别引入EcoRI和BamHI酶切位点；将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定；提取质粒，经EcoRI和BamHI双酶切的PeAPX1基因片段与pCAMBIA2300-CaMV35S连接，转化，提取质粒，进行序列测定，植物表达载体pCAMBIA2300-PeAPX1构建完成。

转基因拟南芥的制备方法如下：

将构建的植物表达载体pCAMBIA2300-PeAPX1转化农杆菌菌株GV3101感受态；选取阳性克隆摇菌，花序浸染及纯合子种子筛选；提取拟南芥阳性苗叶片RNA，反转录成cDNA，用引物PeAPX1-F(5′-CGGAATTCATGGCGAAGAACTACCCGG-3′)和PeAPX1-R(5′-CGGGATCCTTAGGCATCAGCAAACCCCAGT-3′)进行PCR鉴定。

第七方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因植物在植物育种中的应用。

育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

本发明首次揭示了毛竹PeAPX1基因的生物学功能，通过构建PeAPX1基因表达载体，结合农杆菌介导的遗传转化法，异源转化拟南芥，考察PeAPX1对转基因拟南芥抗逆性的影响，并同时检测PeAPX1对毛竹干旱和盐胁迫的响应，为毛竹转基因研究提供有力工具，为毛竹抗性分子育种提供有价值的候选基因。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中PeAPX1基因克隆(A)及表达载体构建电泳检测(B)；其中，A中泳道1-2为PCAMBIA2300-PeAPX1 PCR产物，B中泳道1-3为PCAMBIA2300-PeAPX1酶切产物，M为DNA Marker。

图2为本发明较佳实施例中转PeAPX1基因T3代拟南芥抗旱性测定。其中，A为将7d大小的拟南芥幼苗移栽至含不同浓度甘露醇培养基上；B为A中幼苗生长至苗龄14d。

图3为本发明较佳实施例中转PeAPX1基因T3代拟南芥抗盐性测定。其中，A为将7d大小的拟南芥幼苗移栽至含不同浓度NaCl培养基上；B为A中幼苗生长至苗龄14d。

图4为本发明较佳实施例中干旱胁迫下PeAPX1基因在毛竹根和叶中的表达分析。

图5为本发明较佳实施例中盐胁迫下PeAPX1基因在毛竹根和叶中的表达分析。

图6为本发明较佳实施例中低温胁迫下PeAPX1基因在毛竹根和叶中的表达分析。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1的克隆

以毛竹叶片为材料，按照Trizol RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书方法提取叶片总RNA，取1ng RNA按照反转录试剂盒(Promega，USA)反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物。根据毛竹基因组数据库http://www.forestrylab.org/db/PhePacBio/ExtractSeq/phe/index.php，用Oligo7软件设计引物扩增PeAPX1基因。

上游引物：5′-ATGGCGAAGAACTACCCGG-3′

下游引物：5′-TTAGGCATCAGCAAACCCCAGT-3′

聚合酶链式反应：

20μL反应体系：10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mM dNTP Mix 2μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，cDNA模板2.0μL，LA Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH₂O 11.8μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃10min；4℃保存。

回收产物连接到pGEM-T Easy载体，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌斑PCR检测，阳性克隆进行测序(上海生工生物工程公司)，测序结果准确无误。PeAPX1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2植物表达载体pCAMBIA2300-PeAPX1的构建

设计引物(PeAPX1-F和PeAPX1-R)进行聚合酶链式反应，在目的基因PeAPX1的上下游分别引入EcoRI和BamHI双酶切位点，产物连接到pGEM-T Easy载体(Promega公司)，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，提取质粒，经EcoRI和BamHI双酶切的PeAPX1基因片段与经同样的酶酶切的pCAMBIA2300-CaMV35S载体连接，转化，提取质粒，进行序列测定。

上游引物PeAPX1-F：5′-CGGAATTCATGGCGAAGAACTACCCGG-3′

下游引物PeAPX1-R：5′-CGGGATCCTTAGGCATCAGCAAACCCCAGT-3′

⑴以毛竹叶片cDNA为模板进行PCR反应

20μL反应体系：10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mM dNTP Mix 2μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，cDNA模板2.0μL，LA Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O 11.8μL。

⑵扩增产物回收及连接

回收片段连接到pGEM-T Easy载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。

⑶表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S-PeAPX1的构建

用EcoRI和BamHI双酶切连接有PeAPX1片段的pGEM-T Easy(图1，A)，与EcoRI和BamHI双酶切的表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S(Promega公司，美国)构建重组质粒，酶切体系如下(50μL)：

37℃酶切4h；产物经过琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(Axygen)回收质粒pCAMBIA2300-CaMV35S大片段和PeAPX1小片段。用T4 DNA连接酶连接两个回收产物，连接反应体系如下(20μL)：

4℃过夜连接。将连接产物全部转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑选单克隆，菌落PCR验证后，扩大培养，提取质粒pCAMBIA2300-PeAPX1，进行测序和酶切验证(图1，B)，植物重组表达质粒构建成功。

实施例3植物表达载体pCAMBIA2300-PeAPX1转化拟南芥

⑴冻融法转化农杆菌GV3101菌株

将1ng重组表达载体质粒，加入100μL感受态细胞GV3101中，冰浴10min后，将感受态细胞在液氮中速冻5min，迅速转移至37℃恒温水浴锅中水浴5min，然后置于冰上5min，于离心管中加入600μL的LB液体培养基，在28℃摇床中震荡培养2-3h，复苏菌体。吸取60μL菌液涂布在含有Kan抗性(50mg/mL)和Rif(50mg/mL)抗性的YEP固体培养基中，于28℃恒温摇床中倒置平板培养2-3d左右，至长出白色菌落。挑取单克隆菌落PCR检测后，选取阳性克隆摇菌培养。

⑵拟南芥花序浸染

将上述阳性克隆接种于10mL YEP(含有50μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素)液体培养基中，28℃培养箱震荡培养(160rpm)12h，取2mL培养液转移至200mL YEP(含有50μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素)中，进行大量培养，28℃培养箱震荡培养(160rpm)12h，培养液浓度OD₆₀₀达到1.8-2.2μg/mL，取50mL培养液，4℃5000rpm离心5min，用转化液(含5％蔗糖的MS培养基2.2g，调pH至5.8，加0.2％SilwetL-77混合)剧烈悬浮，将沉淀稀释至1.0μg/mL，得到侵染液。取约200mL侵染液。将刚开花的拟南芥地上部浸泡于侵染液中3min，用保鲜膜包裹植株，暗培养12-16h后，去除保鲜膜，将植株置于培养箱中培养，待采收种子。

⑶纯合子筛选

将T0代拟南芥种子置于离心管中，加1mL 70％酒精消毒5min后，再用2.6％次氯酸钠溶液1mL，消毒10min，然后用无菌水清洗5遍。将种子均匀播种于筛选培养基(1/2MS+100mg/L卡那霉素)上，经4℃低温纯化2d后置于人工气候培养箱中培养至长出4片子叶，将绿色的、正常生长的阳性植株移栽至土壤中栽培，待成熟后分单株收取T1代种子，应用同样的方法筛选T1代幼苗，统计T1代各株系阳性植株与非阳性植株的比例，并将比例约为3:1的株系的阳性植株移栽至土壤中培养，获得T2代种子。应用同样方法筛选T2代幼苗，获得T3代种子。

⑷阳性植株的PCR鉴定

提取阳性拟南芥叶片RNA，反转录成cDNA，用引物PeAPX1-F、PeAPX1-R进行PCR鉴定。发现阳性植株中均含有PeAPX1，表明PeAPX1成功转入拟南芥。

实施例4转PeAPX1基因拟南芥抗逆性分析

在不同程度的干旱和盐胁迫下，观察转基因植株的表型。PeAPX1转基因植株须根的数量明显比野生型多，根的长度明显长于野生型，植株的整体长势明显比野生型好。

抗旱方面，在分别含有50mmol·L^-1、100mmol·L^-1、150mmol·L^-1和200mmol·L^-1甘露醇的培养基上，PeAPX1转基因植株与野生型植株相比，根长长度均明显增加，根的数量也明显增加(图2)。

抗盐方面，在含有50mmol·L^-1和100mmol·L^-1NaCl的培养基上，PeAPX1转基因植株与野生型植株相比，根长长度明显增加，根的数量多于野生型。随胁迫程度的增加，在含有150mmol·L^-1NaCl和200mmol·L^-1NaCl的培养基上，野生型植株、PeAPX1转基因过表达植株的叶片几乎全部失绿，表型无明显差距(图3)。

实施例5干旱、盐、低温胁迫下毛竹PeAPX1基因表达量分析

⑴材料处理

毛竹种子采集于广西壮族自治区，置于恒温光照培养箱中，昼夜温度是25℃/18℃，光周期为光/暗16h/8h，培养至三个月左右，用200mM NaCl、20％PEG 6000、4℃分别模拟高盐、干旱和低温胁迫，取处理后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、120h的幼嫩的主根和须根以及相同部位的叶片，在液氮中迅速冷冻，-80℃冷冻保存。

⑵cDNA模板的合成

利用Trizol Reagent试剂提取毛竹实生苗根、幼茎及叶片中的总RNA，使用无RNA酶的DNase I(TIANDZ)去除基因组DNA，用紫外分光光度计测量A₂₆₀与A₂₈₀的比值及RNA浓度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA扩增条带的亮度和完整性，通过Promega公司的反转录试剂盒合成cDNA第一条链，合成产物置于-20℃冰箱保存。

⑶实时荧光定量PCR

通过实时荧光定量PCR(qRT–PCR)，检测目的基因表达情况。将TIP41基因(GenBank:FP092936.1)作为内参基因，TIP41-F：5'-AAAATCATTGTAGGCCATTGTCG-3'，TIP41-R：5'-ACTAAATTAAGCCAGCGGGAGTG-3'；PeAPX1 5-F:5'-CCTACGCCGATCTCTACCAG 3'，PeAPX15-R:5'-CCGAAGACTTGCCTTAGGTG-3'。

10μL反应体系如下：

反应程序：95℃1min；95℃10s，62℃10s，72℃20s，45个循环。

其他反应参数均为系统默认设置，每个反应设置3个生物学重复，用Roche

480仪分析数据，利用2^-ΔΔCT法分析3次生物学实验数据，用Excel进行作图。

⑷实验结果与分析

干旱、盐、低温胁迫处理毛竹实生苗，分别检测PeAPX1基因在根和叶片中的表达情况，结果如图4～图6所示：干旱胁迫下，PeAPX1基因在叶片和根中的表达都受到抑制；盐和低温胁迫下，PeAPX1基因在叶片中有明显的诱导表达，分别于处理的48h和12h达到峰值，而在根中的表达变化不大。表明PeAPX1基因可能参与毛竹干旱、低温和盐胁迫应答过程。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 国际竹藤中心

<120> 毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1及其应用

<130> KHP211118399.5

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> 毛竹(Phyllostachys edulis)

<400> 1

atggcgaaga actacccggc cgtgagcgca gagtaccagg aggccgtcga taaggccagg 60

cgcaagctcc gcaccctcat cgccgagaag agctgcgccc ctttcatgct ccgactcgcg 120

tggcactccg cggggacgtt cgacgtgtcg tcgaggacgg gcggcccgtt cgggacgatg 180

aagaagccgg cggagcaggc gcacggcgcc aacgcggggc tggacatcgc ggtgcggatg 240

ctcgagccca tcaaggagga gatccccacc atctcctacg ccgatctcta ccagcttgcc 300

ggagttgtgg ccgtcgaggt gtccggtgga cctgagatcc ccttccaccc agggagggag 360

gacaagcctc agcccccacc tgagggccgc cttcctgatg ctaccaaggg ttctgaccac 420

ctaaggcaag tcttcggcaa gcagatgggc ttgagcgata tcgacattgt tgccctctct 480

ggtggtcaca ccctgggaag gtgccacaag gagagatctg gttttgaggg accctggact 540

agaaaccctc tgtcatttga caactcttac ttcaaggagc ttctgagtgg tgacaaggaa 600

ggccttcttc agcttcctag tgacaaagcc ctgctgagtg accctgtctt ccgcccactc 660

gtggagaaat atgctgcgga tgagaaggct ttctttgatg actacaagga ggcccacctc 720

aagctttccg aactggggtt tgctgatgcc taa 753

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> 毛竹(Phyllostachys edulis)

<400> 2

Met Ala Lys Asn Tyr Pro Ala Val Ser Ala Glu Tyr Gln Glu Ala Val

1 5 10 15

Asp Lys Ala Arg Arg Lys Leu Arg Thr Leu Ile Ala Glu Lys Ser Cys

20 25 30

Ala Pro Phe Met Leu Arg Leu Ala Trp His Ser Ala Gly Thr Phe Asp

35 40 45

Val Ser Ser Arg Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Met Lys Lys Pro Ala

50 55 60

Glu Gln Ala His Gly Ala Asn Ala Gly Leu Asp Ile Ala Val Arg Met

65 70 75 80

Leu Glu Pro Ile Lys Glu Glu Ile Pro Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Leu

85 90 95

Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Val Ser Gly Gly Pro Glu

100 105 110

Ile Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys Pro Gln Pro Pro Pro Glu

115 120 125

Gly Arg Leu Pro Asp Ala Thr Lys Gly Ser Asp His Leu Arg Gln Val

130 135 140

Phe Gly Lys Gln Met Gly Leu Ser Asp Ile Asp Ile Val Ala Leu Ser

145 150 155 160

Gly Gly His Thr Leu Gly Arg Cys His Lys Glu Arg Ser Gly Phe Glu

165 170 175

Gly Pro Trp Thr Arg Asn Pro Leu Ser Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Lys

180 185 190

Glu Leu Leu Ser Gly Asp Lys Glu Gly Leu Leu Gln Leu Pro Ser Asp

195 200 205

Lys Ala Leu Leu Ser Asp Pro Val Phe Arg Pro Leu Val Glu Lys Tyr

210 215 220

Ala Ala Asp Glu Lys Ala Phe Phe Asp Asp Tyr Lys Glu Ala His Leu

225 230 235 240

Lys Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Asp Ala

245 250

Claims

1.毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1或含有基因PeAPX1的生物材料在植物抗逆调控中的应用；其中，所述抗逆是指抗干旱、耐盐和耐低温；

所述毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述植物为拟南芥。

2.提高植物抗旱能力的方法，其特征在于，包括：利用基因工程手段，在植物中过表达毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX1；

所述过表达的方式选自以下1）~5），或任选的组合：

1）通过导入具有所述基因的质粒；

2）通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

3）通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

4）通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

5）通过导入增强子；

所述植物为拟南芥。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用农杆菌介导法将毛竹PeAPX1基因转入到拟南芥植株中，获得该基因过表达的转基因植株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将毛竹PeAPX1基因构建到植物表达载体pCAMBIA2300上，转化农杆菌，然后浸染拟南芥花序，筛选转基因植株。

5.根据权利要求2-4任一项所述方法获得的转基因植物在培育抗干旱、耐盐、耐低温的植物中的应用；

所述植物为拟南芥。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。