CN111321153B

CN111321153B - 一种来源于玉米的黑暗响应gd2基因及其应用

Info

Publication number: CN111321153B
Application number: CN202010340154.0A
Authority: CN
Inventors: 李有志; 樊宪伟; 高珺; 雷玲
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2020-04-26
Filing date: 2020-04-26
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2040-04-26
Also published as: CN111321153A

Abstract

本发明提供一种来源于玉米的黑暗响应GD2基因、其编码的蛋白及用途，所述黑暗响应GD2基因的序列如SEQ ID NO.1所示，将所述的基因转入其他植物中，得到转基因植物，可促进植物的生长、开花。本发明提供的黑暗响应GD2基因是一种新的促进植物开花的基因，可用于植物分子育种，能够解决传统选育的效率低和周期长的难题。

Description

一种来源于玉米的黑暗响应GD2基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种来源于玉米的黑暗响应GD2基因及其应用。

背景技术

植物开花是繁殖的重要环节，因此控制开花就成为植物生产中的核心内容研究内容之一。植物开花基因结构和功能是保守的，基于拟南芥、水稻等模式植物的控制开花的分子遗传机制研究已十分广泛和深入，这些研究均是感光基因为基础和出发点，但是单子叶与双子叶植物感光系统的基因组成有明显差别。

玉米(Zea mays)是重要的粮食作物之一，因起源热带地区并适应在短日照条件下正常开花，因此对日照长度变化具有先天的敏感性。引入到高纬度长日照地区后，如果不经驯化，会表现出营养生长旺盛，茎节数和叶片增多，生殖生长受到抑制，抽雄期和吐丝期推迟，晚熟，不开花或者延迟开花。据研究，玉米的开花途径之一是由感光基因组成的光周期响应基因控制，由上游的conz1，gigz1A，gigz1B,和id1以及下游的FLOWERING LOCUS T(FT)-like基因例如ZCN8组成,其中上游的基因成份在长日照适应性和短日照适应性玉米中都是保守的。与拟南芥和水稻不同，玉米感光系统由6个基因组成，但缺失了与拟南芥的phyD(E)两个同源物(Pham et al.,2018)，说明玉米有独特的控制开花的基因。玉米光周期敏感性的遗传特点及分子机制研究方面已经取得了一些进展，但与拟南芥和水稻相比仍然存在很大的差距，特别对光周期敏感的分子机理研究方面知之甚少，主要原因是玉米上克隆的开花时间基因太少。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于玉米的黑暗响应GD2基因及其应用。

上述来源于玉米的黑暗响应GD2基因，所述黑暗响应GD2基因的序列如SEQ IDNO.1所示，具有1236个碱基，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种表达载体，其含有所述的来源于玉米的黑暗响应GD2基因；所述表达载体如pET-28a、pCAMBIA2301、pSP72、pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。

本发明还提供一种宿主细胞，其含有所述的表达载体转化的原核细胞或真核细胞。

本发明的另一个目的是提供上述黑暗响应GD2基因在促进植物生长、开花中的用途。

本发明还提供了一种培育快速生长、开花植物的方法，将SEQ ID No.1所示的黑暗响应GD2基因构建重组表达载体导入受体植物中，获得表达黑暗响应GD2基因的转基因植物。

其中，所述重组表达载体为载体pCAMBIA1301，重组表达载体pCAMBIA1301的构建方法是将NoclⅠ和PmlⅠ识别位点间的序列替换为SEQ ID No.1所示的DNA序列。

其中，所述重组表达载体可通过使用农杆菌介导、Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞或组织。

其中，所述方法还包括从导入SEQ ID No.1所示的基因的受体植物中筛选所述来源于玉米的黑暗响应GD2基因表达的植物，得到转基因植物的步骤，所述植物优选为大豆、玉米、小麦等粮食经济作物。

其中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明的有益效果

本发明提供了一种来源于玉米的黑暗响应GD2基因、该基因编码的蛋白及其用于促进植物生长和开花的用途，通过将基因导入受体植物中，获得转基因植物，受体植物表现出了提早生长和开花。本发明提供的黑暗响应GD2基因是一种新的促进植物开花的基因，可用于植物分子育种，能够解决传统选育的效率低和周期长的难题。

附图说明

图1为抗性转化拟南芥幼苗筛选照片；

图2为移植栽培20天后转基因拟南芥与非转基因拟南芥的叶片对比照片；

图3为移植栽培30天后转基因拟南芥与非转基因拟南芥的植株高度、开花对比照片。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1黑暗响应GD2基因序列的克隆

提取玉米B73自交系的总RNA，并将总RNA反转录合成为第一链cDNA，以第一链cDNA为模板，利用序列特异性引物ZmGD2-F1和ZmGD2-R1按照常规的PCR方法克隆黑暗响应GD2基因的cDNA片段，ZmGD2-F1的序列如SEQ ID NO.3所示，ZmGD2-R1的序列如SEQ ID NO.4所示，扩增得到的黑暗响应GD2基因的cDNA片段序列如SEQ ID NO.1所示，具有1236个碱基，在核苷酸水平上与高粱的谷氨酸脱氢酶2(NCBI accession no.XM_002446833.2)基因cDNA序列具有93.12％的一致性。根据基因本体论数据库[Gene Ontology(GO)datasets；http://geneontology.org/)]，该基因的注释结果为“黑暗响应”。

所述克隆黑暗响应GD2基因编码的蛋白长411个氨基酸残基，其序列如SEQ IDNO.2所示，与高粱的谷氨酸脱氢酶2(NCBI accession no.XP_002446878.1)的氨基酸残基序列具有95.38％的一致性。

实施例2基因功能鉴定

1、黑暗响应GD2基因转入拟南芥植株

将黑暗响应GD2基因的cDNA的完整放阅读框序列克隆在植物转基因表达载体Pcambia-1301 Vector的NoclⅠ和PmlⅠ酶切位点之间，得到重组表达载体。

将重组表达载体导入农杆菌菌株产生带有重组表达载体的重组农杆菌菌株。

以蘸花转化法将黑暗响应GD2基因转入拟南芥，具体做法是以重组农杆菌菌株培养液浸泡拟南芥的花器并在室内继续培养产生的T0代拟南芥种子，T0代拟南芥种子在含有20mg/mL卡那霉素MS培养基上、16h光照/8h黑暗光周期条件下进行抗性筛选，获得抗性转化拟南芥幼苗(图1)，抗性苗以序列特异性引物GD2-2-F(1301)和GD2-2-R(1301)为基础经过PCR扩增鉴定为转基因后，利用定量PCR方法检测靶标基因是否表达。特异性引物GD2-2-F(1301)的序列如SEQ ID NO.5所示，特异性引物GD2-2-R(1301)的序列如SEQ ID NO.6所示。平行对照组实验为非转基因拟南芥，经过上述检测分析后，获得异源表达玉米GD2基因的拟南芥转基因植株并对转基因拟南芥进行功能研究。

2、功能鉴定和结果

将表达了黑暗响应GD2基因的拟南芥转基因植株的种子分别种植在不含以及含有20mg/mL卡那霉素的两种MS培养基上，同时以种植非转基因拟南芥为对照。把MS培养基上生长的卡那霉素抗性并且经PCR证实的拟南芥转基因植株和非转基因拟南芥植株，移栽到盆土中进行盆栽。

与非转基因的野生型拟南芥相比，移植栽培20天后，表达玉米GD2基因的拟南芥转基因植株叶片增大(图2)，移植栽培30天后，地上植株高度显著增高并且花的数量明显增多(图3)。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一种来源于玉米的黑暗响应GD2基因及其应用

<130> jc

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1236

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 1

atgaacgcgc tcgccgccac cacccgcaac ttccggcggg catcgaagct gctcggcctc 60

gactccaagc tcgagcagag cctgctcatc ccgttccggg agatcaaggt ggaatgcacc 120

atccccaaag acgacggcag cttggcgacg ttcgtggggt tccgcgtgca gcatgataac 180

gcccgcgggc cgatgaaagg cggcatccgc tatcacaatg aggttgatcc agatgaagta 240

aatgcccttg ctcaactcat gacatggaag acagctgttg ctgcagtccc atatggtgga 300

gcaaagggag ggatcgggtg ctctcctggt gaactaagta gaagtgagtt ggagcggttg 360

acacgagtat ttacccagaa aattcatgat cttatcggaa cgcatacaga tgtccctgct 420

cctgacatgg ggaccaatgc acaaaccatg gcatggatgc tggatgagta ctcgaaattt 480

catggtcact ccccagcagt cgtcactggg aagccaatag atcttggcgg atcactgggc 540

agggatgcag caacagggcg aggcgtaatg tatgctaccg aggccctact cgctgaatat 600

ggaaaatgca tttctggatc aacttttgtg atccaaggtt ttggcaatgt tggttcatgg 660

gctgctcgac ttattcacga gaaaggtggt aagattattg caattgggga tgtgacaggt 720

tcaattagaa acacggctgg tatagacata cctgctttgg tgaagcatag gaatgaaggt 780

catgcgatga aagacttcga tggtgcggaa gttttggatt caaccgagtt gttagtgcat 840

gactgtgatg ttcttgtccc ctgcgcctta ggtggagttc ttaacaagga taatgcacca 900

gacgtgaagg ccaaatttgt aatcgaagct gctaaccatc caactgatcc agaggcagac 960

gagattctcg ccaagaaggg ggtagtagta ttacctgata tatatgctaa ttcaggtggc 1020

gtggtcgtta gctactttga atgggtgcag aacattcaag gtttcatgtg ggatgaggag 1080

aaagttaacg atgaactaga aaagtacatg agcagtgctt ttcaacacat gaaagccatg 1140

tgcaaatctc tggattgcga ccttaggatg ggggccttca ccttaggagt taacagggtt 1200

gctcgtgcca cccttttgag aggctgggag gcatga 1236

<210> 2

<211> 411

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 2

Met Asn Ala Leu Ala Ala Thr Thr Arg Asn Phe Arg Arg Ala Ser Lys

1 5 10 15

Leu Leu Gly Leu Asp Ser Lys Leu Glu Gln Ser Leu Leu Ile Pro Phe

20 25 30

Arg Glu Ile Lys Val Glu Cys Thr Ile Pro Lys Asp Asp Gly Ser Leu

35 40 45

Ala Thr Phe Val Gly Phe Arg Val Gln His Asp Asn Ala Arg Gly Pro

50 55 60

Met Lys Gly Gly Ile Arg Tyr His Asn Glu Val Asp Pro Asp Glu Val

65 70 75 80

Asn Ala Leu Ala Gln Leu Met Thr Trp Lys Thr Ala Val Ala Ala Val

85 90 95

Pro Tyr Gly Gly Ala Lys Gly Gly Ile Gly Cys Ser Pro Gly Glu Leu

100 105 110

Ser Arg Ser Glu Leu Glu Arg Leu Thr Arg Val Phe Thr Gln Lys Ile

115 120 125

His Asp Leu Ile Gly Thr His Thr Asp Val Pro Ala Pro Asp Met Gly

130 135 140

Thr Asn Ala Gln Thr Met Ala Trp Met Leu Asp Glu Tyr Ser Lys Phe

145 150 155 160

His Gly His Ser Pro Ala Val Val Thr Gly Lys Pro Ile Asp Leu Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Gly Arg Asp Ala Ala Thr Gly Arg Gly Val Met Tyr Ala

180 185 190

Thr Glu Ala Leu Leu Ala Glu Tyr Gly Lys Cys Ile Ser Gly Ser Thr

195 200 205

Phe Val Ile Gln Gly Phe Gly Asn Val Gly Ser Trp Ala Ala Arg Leu

210 215 220

Ile His Glu Lys Gly Gly Lys Ile Ile Ala Ile Gly Asp Val Thr Gly

225 230 235 240

Ser Ile Arg Asn Thr Ala Gly Ile Asp Ile Pro Ala Leu Val Lys His

245 250 255

Arg Asn Glu Gly His Ala Met Lys Asp Phe Asp Gly Ala Glu Val Leu

260 265 270

Asp Ser Thr Glu Leu Leu Val His Asp Cys Asp Val Leu Val Pro Cys

275 280 285

Ala Leu Gly Gly Val Leu Asn Lys Asp Asn Ala Pro Asp Val Lys Ala

290 295 300

Lys Phe Val Ile Glu Ala Ala Asn His Pro Thr Asp Pro Glu Ala Asp

305 310 315 320

Glu Ile Leu Ala Lys Lys Gly Val Val Val Leu Pro Asp Ile Tyr Ala

325 330 335

Asn Ser Gly Gly Val Val Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Ile

340 345 350

Gln Gly Phe Met Trp Asp Glu Glu Lys Val Asn Asp Glu Leu Glu Lys

355 360 365

Tyr Met Ser Ser Ala Phe Gln His Met Lys Ala Met Cys Lys Ser Leu

370 375 380

Asp Cys Asp Leu Arg Met Gly Ala Phe Thr Leu Gly Val Asn Arg Val

385 390 395 400

Ala Arg Ala Thr Leu Leu Arg Gly Trp Glu Ala

405 410

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cctcgatcct cggacgaaac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

cccttcaacg ggctcattcc 20

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

acgggggact cttgaccatg aacgcgctcg ccgcc 35

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gtcacctgta attcacacgt gtcatgcctc ccagcctctc 40

Claims

1.黑暗响应GD2基因在促进植物生长和提早开花中的用途，所述黑暗响应GD2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种利用黑暗响应GD2基因培育快速生长和提早开花植物的方法，其特征在于：将SEQ ID No.1所示的黑暗响应GD2基因构建重组表达载体导入受体植物中，获得表达黑暗响应GD2基因的转基因植物；

其中，所述重组表达载体为载体pCAMBIA1301，重组表达载体pCAMBIA1301的构建方法是将NcoⅠ和PmlⅠ识别位点间的序列替换为SEQ ID No.1所示的DNA序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体通过使用农杆菌介导、直接DNA转化、微注射或电穿孔导入植物细胞或组织。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括从导入SEQ ID No.1所示基因的受体植物中筛选黑暗响应GD2基因表达的植物，得到转基因植物的步骤。