CN103820408B - 提高氮素高效利用的真菌PcGDH蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域,公开了一个能提高水稻氮素高效利用的真菌（Pleurotus cystidiosus）谷氨酸脱氢酶基因PcGDH的克隆及应用。本发明的PcGDH体外的正反应NADP（H）酶活性大于逆反应，即PcGDH蛋白倾向于利用NH4 +将α‑酮戊二酸转化为谷氨酸。并且，PcGDH对NH4 +的亲和力大于谷氨酸。通过基因工程技术将PcGDH基因异源过表达在水稻中，提高了转基因水稻对氮素的利用，改善了转基因水稻的生长并且增加了转基因水稻的有效穗和千粒重。因此，提高水稻氮素利用PcGDH基因可以用来培育具有良好农艺性状的水稻新品种。

Description

提高氮素高效利用的真菌PcGDH蛋白及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及在水稻(Oryza sativa L.)中异源表达真菌Pleurotus cystidiosus的谷氨酸脱氢酶基因PcGDH，可以提高水稻的氮素高效利用和改善水稻的生长。
背景技术
水稻是我国种植面积最大、产量最高、氮肥用量最多的粮食作物之一。氮素（N）对水稻生产的影响仅次于水，是构成水稻生产成本的主要部分。据世界粮农组织(FAO 2001)统计，中国1995-1997年水稻种植面积年均31.7×106hm2，占世界水稻种植面积的20%，而水稻氮肥用量占全球水稻氮肥总用量的37%，成为世界上施用无机氮肥最多的国家。中国单季稻田氮肥用量平均为180kg/hm2，比世界稻田氮肥平均用量约高75% (彭少兵等 2002)。有些稻区的部分高产田块，施氮量甚至高达300-750kg/hm2（江立庚和曹卫星 2002）。在中国氮肥成本占水稻生产外部投入总成本（只包括肥料、农药、种子和灌溉成本）的份额高达35%。中国氮肥的农学利用率也很低，不及菲律宾和印度的50%（Berge et al. 1997；黄农荣等 2006）。水稻平均氮素利用率仅在28%-37%之间，比世界一般水平低15%-20%；在一些氮肥用量高的省份，氮素吸收利用率更在20%以下（李世娟和李建民 2001；Wang et al. 2004）。水稻氮肥施用量居高不下及氮素利用率持续降低，带来了诸多不良后果:一方面直接导致稻谷生产成本增加；并常伴随病虫害加重，从而导致农药施用量增加，农作物品质下降(Peng et al. 2002)，成为增产不增收的重要原因之一。另一方面，大量的氮素流失带来严重的环境污染:一部分直接导致地下水污染和江河湖泊的富营养化作用；另一部分则以一氧化二氮(N2O)、一氧化氮(NO)和二氧化氮(NO2)等氮素化合物污染大气，形成酸雨，破坏臭氧层，或者以一氧化二氮(N2O)形式造成温室效应，对人类的生存环境和农业可持续发展构成严重威胁（闫德智等 2005）。因此，提高氮素利用率，减少氮肥用量，解决氮肥流失造成江河湖泊和大气污染的问题已到了刻不容缓的地步。可见，研究并解决水稻氮肥施用量居高不下及氮素利用率持续降低已经成为当前水稻科学研究与生产的关键问题之一。
培育氮素利用效率高和耐低氮条件的水稻新品种是降低氮肥用量、有效利用肥料资源、减少环境污染、降低生产成本和提高稻米品质的最有效途径之一。在水稻氮效率育种方面，我国仅对水稻氮营养高效种质资源的收集、筛选和鉴定工作、氮效率的生理生化基础研究和氮高效的遗传等方面有一些报道，但工作做得较少、研究进展不大（樊剑波等2008）。这主要是因为采用常规育种方法使得水稻氮高效品种的选育需要耗费大量的时间与精力。更重要或根本的原因是在植物的氮素利用中起关键作用的是谷氨酰胺合成酶途径，而该途径的氮素利用效率较低。而另一种谷氨酸脱氢酶（NADPH-dependent glutamatedehydrogenase，GDH）途径的氮素利用效率高，但在植物中虽然存在GDH基因，但由于其对铵（NH4 +）的亲和力低，使这一氮素利用途径不能有效进行，从而导致整个高等植物的氮素利用效率偏低。但是在细菌和真菌中，其谷氨酸脱氢酶（GDH）对NH4 +的亲和力很高，氮素的利用效率也较高。然而，由于物种之间的生殖隔离障碍，采用常规育种方法来显著提高水稻氮素利用效率变得根本不可行。上世纪80年代产生的转基因技术由于直接在基因水平上改造植物的遗传物质、可定向改造植物的遗传性状，外源基因的转入打破了物种之间的生殖隔离障碍、丰富了基因资源等优点而弥补了常规育种方法的不足，得到了前所未有的发展。许多学者在水稻的转基因研究上做了大量工作并取得了很大的进展，为水稻的遗传改良奠定了基础。因此，从我国可持续农业的角度出发，利用转基因技术将来自真菌等外源的谷氨酸脱氢酶基因（GDH）转入水稻培育氮素高效利用的转基因新品种已成为当务之急。
真菌NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶是用于提高植物氮肥利用率的最有前景的外源基因，也是目前研究的热点。王芳和田波（2001）通过RT-PCR方法克隆了真菌中间脉孢霉（Neurospora intermedia，简称Ni）、好食脉孢霉（Neurospora sitophila，简称Ns）和粗糙脉孢霉（Neurospora crassa，简称Nc）的基因，进行序列测定。前两种GDH基因的序列为首次报道。分别将上述GDH基因克隆入pET30a质粒在大肠杆菌中表达，纯化后进行酶活性及米氏常数（Km）测定，结果发现大肠杆菌表达的Ni-GDH具有更高的酶活性，其Km值在0.3-0.45mmol/L比左右。选择Ni-GDH基因转化烟草，发现它能促进烟草在低氮水平下的生长。许宏涛等（2004）报道，中国科学院微生物研究所发现一类真菌的GDH，其Km很低，仅为0.3～0.5mmol/L。该基因核苷酸序列测定结果证明是一类新的GDH基因，已被国际GenBank收录。将该基因转入植物，可提高氮素利用率30%以上，使植物增加了一条氮素同化的新途径。将该GDH基因转入棉花后，培育了抗营养贫瘠类的新一代转基因品种，它不仅可以节约氮肥30%～40%，降低生产成本，还有利于环境保护。Aoki等(2008)将在CaMV-35S启动子驱动下的真菌GDH基因转入土豆和水稻，获得了过表达的转基因植株。研究发现，与未转化的对照植株相比，转基因土豆在标准氮和低氮条件下叶面积都增加，光合效率升高明显，但是暗呼吸效率大幅度降低。同时还发现匍匐茎和块茎数量增加，相应的土豆产量也大幅增加。该结果说明，真菌GDH基因的过表达不仅增强了代谢源的功能，而且也增强了代谢库的功能，从而增加了土豆在低氮条件下的氮素利用效率。Abiko等(2010)在转基因水稻中发现分蘖数和每穗的小穗数明显增加，生物量和谷物产量也大幅增加，特别是在低氮条件下更为明显。该结果也说明了真菌GDH基因的过表达增加了水稻的氮素利用效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种真菌Pleurotus cystidiosus的谷氨酸脱氢酶基因及其编码蛋白，该基因命名为PcGDH，所编码的相应蛋白命名为PcGDH蛋白。PcGDH序列全长为1392bp，编码463个氨基酸。
本发明所提供的谷氨酸脱氢酶蛋白，名称为PcGDH，来源于真菌Pleurotuscystidiosus，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1）序列表中的SEQ ID No:3；
2）将序列表中SEQ ID No:3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与水稻氮素高效利用相关的蛋白质。
序列表中的SEQ ID No:3由463个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加。如将SEQ ID No:3自氨基端第133位半光氨酸残基取代为异亮氨酸残基并异源表达在水稻中且与水稻氮素高效利用相关的蛋白质；将SEQ ID No:3自氨基端第133位半光氨酸残基取代为异亮氨酸残基且将SEQ ID No:3缺失自氨基端第130位-133位氨基酸残基而得到的由463个氨基酸残基组成的并异源表达在水稻中且与水稻氮素高效利用相关的蛋白质。
PcGDH的编码基因也属于本发明的保护范围。PcGDH的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQ ID No:1或者SEQ ID No:2的DNA序列；
2）编码序列表中SEQ ID No:3蛋白质序列的多核苷酸；
3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No:1或者SEQ ID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4）与序列表中 SEQ ID No:1或者SEQ ID No:2限定的 DNA序列具有 70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中SEQ ID No:1或者SEQ ID No:2的序列由1392个碱基组成。
所述高严谨条件为在 0.1×SSPE(或0.1×SS)，0.1×SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜含有PcGDH基因的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
真菌Pleurotus cystidiosus的谷氨酸脱氢酶基因(PcGDH)及其编码蛋白属于本发明的保护范围，且扩增PcGDH基因中任意片段的引物也在本发明的保护范围之内。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的提高水稻氮素高效利用的基因PcGDH导入植物细胞，可获得改善水稻氮素高效利用及生长的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记（GUS基因、GFP、YFP、As-Red和荧光素酶基因等）或具有抗性的抗生素标记基因（潮霉素、庆大霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、博莱霉素等）。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。含有本发明的PcGDH的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。
本发明的PcGDH蛋白异源表达在水稻中通过提高水稻的总NADP(H)-GDH酶活从而促进水稻对氮素的吸收进而改善水稻幼苗的生长及成熟期水稻的有效穗和千粒重。因此，通过基因工程的方法异源表达真菌Pleurotus cystidiosus的谷氨酸脱氢酶在水稻中，可提高水稻在低氮条件下氮素的高效利用，从而使水稻在低氮的条件下能正常生长，提高氮肥的利用率，减少环境污染。本发明中的PcGDH蛋白对于提高水稻的氮素高效利用，进一步提高水稻的产量具有重要的作用。
附图说明
图1原始(SEQ ID NO:1)和优化后(SEQ ID NO:2)PcGDH基因的序列比对。
图2 pCAMBIA1301GW载体图谱（改造后的pCAMBIA1301载体）。
图3a PcGDH与不同物种GDH基因的同源性比对分析。
图3b PcGDH与不同物种GDH基因的氨基酸序列比对分析。
图4a 原核表达并纯化PcGDH蛋白以及SDA-PAGE及western blot 检测。
图4b 纯化的PcGDH蛋白的NADP(H)酶活性分析。
图5 PcGDH转基因植株的分子鉴定，其中：a为 PcGDH基因植物表达载体的构建，b为 PcGDH蛋白的亚细胞定位，c为 PcGDH转基因水稻的western blot 检测，d为 PcGDH转基因水稻地上部分和地下部分的NADP(H)酶活性分析。
图6野生型和PcGDH转基因水稻在不同氮素条件下的表型鉴定及生理数据分析，其中：a为野生型和PcGDH转基因水稻在不同氮素条件下的表型鉴定，b-i 为野生型和PcGDH转基因水稻在不同氮素条件下生理数据的统计分析。
图7 转基因T1代种子潮霉素抗性筛选及红色荧光的观察。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。下述实施例中提到的实验方法如无特别说明均为常规方法。
PcGDH基因的克隆
通过对目前已经完成基因组测序的真菌菌株的GDH基因的序列找出不同真菌来源的GDH 基因的保守区，利用primer5设计简并引物扩增真菌Pleurotus cystidiosus的GDH基因。正向简并引物从开放阅读框的起始密码子开始，序列为5'-ATGTCCCACCTGCCTTTCGARCCNGARTT-3'，反向简并引物位于开放阅读框3’端的后面，序列为5'-CCCCACCAGTCACCCTGGTCRTGCATNGC-3'；然后以真菌Pleurotus cystidiosus的cDNA为模板，利用RT-PCR方法克隆PcGDH基因。根据Chen et al (2006)的方法将PcGDH基因克隆到GATEWAY入门载体PGWC中然后测序。这个基因在NCBI数据库里没有收录，但测序结果表明它有完整的开放阅读框（ORF），且氨基酸能够通读，是一个首次在Pleurotus cystidiosus中发现的谷氨酸脱氢酶基因，命名为PcGDH，其克隆的完整碱基序列见基因序列表SEQ ID No:1，氨基酸序列见基因序列表SEQ ID No:3。由于真菌和水稻它们对密码子的偏爱性不一样，所以为了使PcGDH蛋白在水稻植株内高水平的表达，根据网站http://www.kazusa.or.jp/codon/中的方法找出需要修改的密码子，然后分析序列的结构域，在不改变氨基酸序列的前提下，将在功能域中的原真菌密码子变成水稻偏爱的密码子，设计点突变引物并运用重叠PCR技术将PcGDH序列中的原真菌密码子变成水稻偏爱的密码子，优化后的PcGDH碱基序列见基因序列表SEQ ID No:2。同时，为了增强真菌PcGDH基因在转基因水稻植株内的翻译水平，在起始密码子ATG前面添加了kozak序列（GCCACC），其点突变引物如下：PcGDH-1F：GCCACCATGTCCCACCTGCCTTTCG，PcGDH-1R：CGCATTCTTGAAGATCTGCTCA；PcGDH-2F：TGAGCAGATCTTCAAGAATGCG，PcGDH-2R：CTTTGCCTCCTCGCCAGAA；PcGDH-3F：TTCTGGCGAGGAGGCAAAG，PcGDH-3R： CCCCACCAATCTCCGTGGTCG；点突变位点见图1。将添加了kozak序列并进行了水稻偏爱密码子修饰后的PcGDH序列再克隆到pGWC载体中，并将其通过LR反应重组到改造后的pCAMBIA1301GW载体中。改造后的pCAMBIA1301GW载体含有潮霉素抗性筛选基因HPT和红色荧光蛋白筛选标记基因AsRed，并且将gateway cassette sequence克隆到pCAMBIA1301载体的多克隆位点SacI和SacII之间，然后在gateway cassettesequence的3’末端加上2个FLAG标签序列（图2）。将构建好的pCAMBIA1301GW-PcGDH电击转入EHA105农杆菌并转化水稻（Oryza sativa cv. Kitaake）。
PcGDH基因的功能验证
(1) PcGDH基因的进化树分析
为了研究PcGDH基因与其他真菌及物种GDH基因的同源性关系，本发明人收集了真菌、E.coli、藻类、水稻和拟南芥GDH蛋白的氨基酸序列并运用CLUSTAL X 和 MEGA 5软件构建进化树。结果表明，PcGDH与已有文献报道对NH4 +有很高亲和力的gdhA(Aspergillusniger), gdhA(Aspergillus nidulans)和NiGDH(Neurospora intermedia)的同源性很高（图3a）。并且将PcGDH和gdhA(Aspergillus niger), gdhA(Aspergillus nidulans),NiGDH(Neurospora intermedia)、EcGDH(E.coli)、OsGDH(rice)和AtGDH(arabidopsis)的氨基酸序列进行相似度分析，发现它们都有保守的NAD(P) 和 Glu/α-KG 结构域(图3b)。
（2）PcGDH的原核表达及酶促动力学分析
为了研究PcGDH的NADP(H)酶活，本发明人构建了原核表达载体pET32a-PcGDH并转化E. coli (BL21)，在大肠杆菌中诱导表达PcGDH蛋白。PcGDH粗蛋白用Ni柱纯化，再通过SDA-PAGE检测PcGDH蛋白纯化的效果，并用anti-His抗体通过Western blot检测是否为目的蛋白。由图4a可知纯化的PcGDH蛋白很单一，并且Western blot检测在预测PcGDH蛋白大小的位置有信号。将纯化后的PcGDH蛋白用于测定NADP(H)酶活和Km值(图4b，表1)。实验结果表明，PcGDH在体外正反应的酶活性大于逆反应的酶活性，说明PcGDH倾向于利用NH4 + 将α-酮戊二酸转化为谷氨酸。并且由Km值可知PcGDH对NH4 + 的亲和力大于对谷氨酸的亲和力。
(3) PcGDH基因的水稻转化
为了研究PcGDH基因对水稻氮素利用的影响，将构建好的pCAMBIA1301GW-PcGDH（图5a）电击转入农杆菌（Agrobacterium）株系EHA105。然后用含有重组质粒pCAMBIA1301GW-PcGDH的农杆菌侵染水稻愈伤组织，在黑暗处28 ℃培养3天后，在含有 50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗1周，然后移栽至大田中。
(4) 转基因植株的筛选和分子鉴定
收获T0代转基因水稻的种子（T1代），将种子在水中浸种2天后，移入37 ℃培养箱催芽3天，然后将露白的种子进行潮霉素抗性筛选和红色荧光观察（图7），实验结果表明Ubi::PcGDH-5和Ubi::PcGDH-12这2个株系符合孟德尔3:1的遗传定律，属于单拷贝，因此选这2个株系做下一步的实验研究。为了研究PcGDH蛋白在细胞内发挥功能的部位，我们分析了PcGDH蛋白的亚细胞定位（图5b），实验结果表明，PcGDH蛋白定位在细胞质中，说明它在细胞质中发挥功能。为了确定PcGDH蛋白是否在转基因植株内表达，我们提取了野生型（control）、Ubi::PcGDH-5和Ubi::PcGDH-12株系的蛋白进行Western blot 分析(图5c)，结果表明，PcGDH蛋白在转基因植株体内超强表达。为了确定PcGDH蛋白在转基因植株体内是否具有NADP(H)酶活性，我们提取了转基因植株的总蛋白检测NADP(H)-GDH酶活性（图5d）。实验结果表明，转基因植株的NADP(H)-GDH酶活力大于野生型，并且在转基因株系和野生型中都是正反应的酶活大于逆反应的酶活。说明PcGDH蛋白在转基因植株体内发挥了功能。
（5）转基因植株的表型分析
将上一步得到的纯合子转基因水稻植株和野生型分别在不同氮素条件下进行水培实验和大田实验观察表型。在水培实验中，转基因植株的苗长和根长比野生型要长，转基因植株的湿重比野生型的要重，并且转基因植株的叶绿素、氮素以及氨基酸含量（谷氨酸、谷氨酰胺和总氨基酸）都比野生型要高（图6）；田间实验结果为转基因植株的有效穗和千粒重比野生型的要高(表2)。
PcGDH基因的应用
基于经济效益和环境保护的考虑，近年来水稻的氮素利用效率引起了大家的重视。目前水稻氮素利用研究主要集中在肥料施用方法和时期的探索、缓释复合肥的研发和施用、以及水稻联合工程固氮菌的培育和使用等方面，而且也取得了一定进展。上世纪80年代产生的转基因技术由于直接在基因水平上改造植物的遗传物质、可定向改造植物的遗传性状，外源基因的转入打破了物种之间的生殖隔离障碍、丰富了基因资源等优点而弥补了常规育种方法的不足，得到了前所未有的发展。由于水稻本身的谷氨酸脱氢酶(GDH)对NH4 +的亲和力低的特性，决定了水稻氮素利用效率不高。目前国内外的研究工作证实通过外源GDH基因在转化植物中高效表达能够提高氮素利用率，但是到目前为止，仅见Abiko等(2010)利用用真菌NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶提高水稻氮肥利用率的报道。因此，在水稻中异源表达真菌的GDH基因，对提高水稻的氮素高效利用的前景很大。我们通过农杆菌介导的遗传转化方法将真菌Pleurotus cystidiosus的GDH基因（PcGDH）转入水稻，在提高水稻氮素利用和改善水稻生长及农艺性状方面取得了良好的效果。
表1 PcGDH蛋白Km值的测定
底物 Km(mM)
NH4 + 3.73±0.23
α-酮戊二酸 13.27±0.53
NADPH 1.10±0.06
谷氨酸 15.97±0.31
NADP+ 0.12±0.005
表2 野生型和PcGDH转基因水稻田间农艺性状的统计分析
田间氮肥梯度(千克 氮/亩) 株系 株高 (厘米) 千粒重 (克) 有效穗/单株
0 Control 58.2±4.4 27.6±1.1 9.4±1.7
0 Ubi::PcGDH-5 57.0±6.7 27.4±0.6 9.9±1.6
0 Ubi::PcGDH-12 57.2±3.6 29.3±0.4* 11.0±0.94
37.5 Control 59.8±5.9 27.4±0.5 16.7±1.1
37.5 Ubi::PcGDH-5 61.0±4.1 29.0±2.3 17.5±1.8
37.5 Ubi::PcGDH-12 61.6±4.9 30.1±0.9** 18.3±0.95**
112.5 Control 61.6±4.2 27.9±0.7 17.8±1.0
112.5 Ubi::PcGDH-5 61.4±3.1 30.2±0.5** 19.3±0.87**
112.5 Ubi::PcGDH-12 62.9±3.8 30.6±1.0** 19.8±1.29**

Claims (6)

1.水稻氮素高效利用蛋白，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No:3所示。
2.权利要求1所述的水稻氮素高效利用蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述水稻氮素高效利用蛋白的cDNA基因，其核苷酸序列为：序列表中SEQ ID No:1或者SEQ ID No:2所示的DNA序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体，细胞系或宿主菌。
5.权利要求2或3所述基因在培育作物品种中的应用，其提高作物在低氮条件下氮素的利用。
6.权利要求5所述的应用，其中作物是水稻。
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