CN112322598B

CN112322598B - 提高水稻干旱和碱胁迫耐受性的亮白曲霉AcGDH蛋白、基因及应用

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Publication number: CN112322598B
Application number: CN202010726548.XA
Authority: CN
Inventors: 刘选明; 林建中; 燕璐; 唐冬英; 朱咏华
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2020-07-25
Filing date: 2020-07-25
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2040-07-25
Also published as: CN112322598A

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公布了一个能提高水稻干旱和碱胁迫耐受性的真菌亮白曲霉（Aspergillus candidus）NADP(H)依赖型谷氨酸脱氢酶基因AcGDH的克隆及应用。研究发现，AcGDH蛋白体外的正反应酶活性大于逆反应酶活性，即AcGDH倾向于利用NH₄ ⁺将α‑酮戊二酸转化为谷氨酸。同时发现，AcGDH对NH₄ ⁺的亲和力大于水稻内源OsGDH4。通过基因工程技术将AcGDH基因异源过表达于水稻中，提高了转基因水稻在干旱和碱胁迫条件下的耐受性。因此AcGDH基因可以用来培育耐干旱和碱胁迫水稻新品种。

Description

提高水稻干旱和碱胁迫耐受性的亮白曲霉AcGDH蛋白、基因及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及在水稻(Oryza sativa L.)中异源表达真菌亮白曲霉(Aspergillus candidus)的NADP(H)依赖型谷氨酸脱氢酶基因AcGDH，可以提高水稻干旱和碱胁迫耐受性，以及水稻的氮素利用效率及产量。

背景技术

水稻是全世界最主要的粮食作物，超世界一半人口以水稻为主粮，且在中国水稻是种植面积最大，产量最高的粮食作物。植物的生长过程中不可避免的会遭受到各种不良环境的胁迫，影响最广泛的是干旱、低温、盐碱胁迫等非生物胁迫因素(刘聪，董腊嫒，林建中，刘选明.逆境胁迫下植物体内活性氧代谢及调控机理研究进展[J].生命科学研究,2019,23(03):253-258)。为了应对多种不利环境因素，植物进化出了一系列生理生化机制来响应各种环境胁迫。植物体内存在许多能够感受外界环境变化的因子，当感受到外界环境变化后，参与各种逆境胁迫响应机制，并形成一个复杂的响应和调控网络，启动一系列生理进程，以应对逆境胁迫环境。

干旱和碱胁迫是最常见的水稻逆境胁迫，严重影响了水稻的种植，制约着水稻产量。在干旱胁迫条件下，植物的蒸腾作用消耗的水分大于吸收时，植物体内则就会出现水分的亏缺，即发生干旱胁迫现象。在碱胁迫条件下，由于土壤或水体中积累过量NaHCO₃和Na₂CO₃，导致pH值升高，同时植物体内Na⁺积累，使得植物出现渗透胁迫和营养亏缺，并导致生理功能紊乱。当植物处于干旱和碱胁迫时，体内的生理发生紊乱，蛋白质水解活性增加，使得细胞内氨的含量升高。如果不能有效去除积累的氨，会对细胞产生毒害作用。铵离子(NH₄ ⁺)通过谷氨酰胺合成酶(GS；EC 6.3.1.2)和谷氨酸合成酶(GOGAT；EC 1.4.7.1)生成谷氨酰胺和谷氨酸。另外，植物组织中广泛存在的现象是，谷氨酸脱氢酶(NADPH-dependentglutamate dehydrogenase，GDH；EC 1.4.2)能催化α-酮戊二酸(2-OG)的还原胺化，也能将谷氨酸氧化脱氨。在植物碳代谢和氮代谢循环中，GDH起到维持碳氮平衡的作用。细胞内氨的积累受外界氨含量影响，也可能源于衰老诱导的蛋白质水解或者非生物胁迫引起。当植物在干旱和碱等逆境胁迫条件下而引起细胞内氨的积累时，植物将会提高胞内GDH的氨化活性，从而解除细胞内的氨毒害，有利于提高其干旱等逆境胁迫的耐受性。因此，提高植物GDH酶活性有助于在胁迫条件下，促进氨的同化而降低过量氨对细胞带来的伤害。

植物中主要的氮同化途径是GS/GOGAT途径，而GDH途径仅起着辅助作用。因为在植物中虽然存在GDH基因，但由于GDH对铵(NH₄ ⁺)的亲和力低，使这一氮同化途径不能有效进行，导致其对氮素的利用效率偏低。与高等植物不同的是，在细菌和真菌等低等生物中，其谷氨酸脱氢酶(GDH)对NH₄ ⁺的亲和力很高，氮素的利用效率也较高。然而，由于物种之间的生殖隔离障碍，采用常规育种方法来大幅提高水稻氮素利用效率变得根本不可行。上世纪80年代产生的转基因技术，由于可直接在基因水平上改造植物的遗传物质，定向改造植物的遗传性状，从而打破了物种之间的生殖隔离障碍，丰富了基因资源，弥补了常规育种方法的不足。许多学者在水稻的转基因研究上做了大量工作并取得了很大进展，为水稻的遗传改良奠定了基础。因此，从我国可持续农业的角度出发，利用转基因技术将来自真菌等外源谷氨酸脱氢酶基因(GDH)转入水稻，以培育具有逆境胁迫耐受性的转基因新品种具有良好的应用潜力。

真菌NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶是用于提高植物逆境耐受性的最有前景的外源基因之一，也是当前研究的热点王芳田波.中间脉孢霉谷氨酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌和烟草中的表达[J].科学通报,2001(02):137-140)。王芳和田波(2001)克隆了真菌中间脉孢霉(Neurospora intermedia)NiGDH基因。酶促动力学分析发现，NiGDH对NH₄ ⁺具有较低的Km值(0.3～0.45mmol/L)，将其异源表达于烟草，发现能显著改善转基因烟草在低氮条件下的生长状态(王芳，田波.中间脉孢霉谷氨酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌和烟草中的表达[J].科学通报,2001(02):137-140)。Abiko等(2010)将真菌黑曲霉(Aspergillusniger)的GDH基因gdhA转入水稻，能显著增加转基因水稻的氮素利用效率、生物量和谷物产量(Abiko T,Wakayama M,Kawakami A,Obara M,Kisaka H,Miwa T,Aoki N,OhsugiR.Changes in nitrogen assimilation,metabolism,and growth in transgenic riceplants expressing a fungal NADP(H)-dependent glutamate dehydrogenase(gdhA)[J].Planta,2010,232:299-311)。Zhou等(2014)将鲍鱼菇(Pleurotus cystidiosus)的PcGDH基因转入水稻，获得了氮同化效率和谷蛋白含量显著提高的转基因株系(Zhou Y,LiuH,Deng X,Zhou X,Yan Y,Du C,Li Y,Liu D,Zhang C,Tang D,Zhao X,Zhu Y,Lin J,LiuX.Over-expressing a fungal NADP(H)-dependent glutamate dehydrogenase PcGDHimproves nitrogen assimilation and growth quality in rice[J].MolecularBreeding,2014,34:335–349)。这些结果说明，真菌GDH基因在水稻等作物的遗传改良方面具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种真菌亮白曲霉(Aspergillus candidus)的谷氨酸脱氢酶基因及其编码蛋白，该基因命名为AcGDH，所编码的相应蛋白命名为AcGDH。AcGDH序列全长为1377bp，编码458个氨基酸。

本发明所提供的谷氨酸脱氢酶蛋白，名称为AcGDH，来源于真菌亮白曲霉(Aspergillus candidus)，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID No:2；

2)将序列表中SEQ ID No:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与提高水稻氮素利用效率和产量的蛋白质。

序列表中的序列2由458个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。如将SEQ ID No:2所示序列自氨基端第133位半光氨酸残基取代为异亮氨酸残基并异源表达在水稻中且与提高水稻氮素利用效率和产量相关的蛋白质；将SEQ ID No:2所示序列自氨基端第133位半光氨酸残基取代为异亮氨酸残基且将序列2缺失自氨基端第130位-132位氨基酸残基而得到的由455个氨基酸残基组成的并异源表达在水稻中且与提高水稻干旱和/或碱胁迫耐受性的蛋白质。

AcGDH的编码基因也属于本发明的保护范围。

AcGDH的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)SEQ ID No:1所示的DNA序列；

2)编码SEQ ID No:2所示氨基酸序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与SEQ ID No:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的SEQ ID No:1所示序列由1377个碱基组成。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SS)，0.1×SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。含有AcGDH基因的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

真菌亮白曲霉(Aspergillus candidus)的谷氨酸脱氢酶基因(AcGDH)及其编码蛋白属于本发明的保护范围，且扩增AcGDH基因中任意片段的引物也在本发明的保护范围之内。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的提高水稻干旱胁迫及碱胁迫耐受性的来自真菌亮白曲霉(Aspergillus candidus)的AcGDH基因导入植物细胞，可获得改善水稻干旱胁迫及碱胁迫耐受性的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP、YFP、As-Red和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(抗潮霉素、庆大霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、博莱霉素等基因)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。含有本发明的AcGDH的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，如水稻、小麦和玉米等，也可以是双子叶植物，如黄瓜、番茄、杨树、草坪草和苜蓿等。

本发明的AcGDH蛋白异源表达在水稻中通过提高水稻的总NADP(H)-GDH酶活从而促进水稻对氮素的吸收和同化，可降低细胞内的氨毒害，进而提高干旱和碱胁迫下水稻的有效穗、千粒重和单株产量。因此，通过基因工程的方法异源表达亮白曲霉(Aspergilluscandidus)的AcGDH在水稻中，可提高水稻在干旱和碱胁迫条件下的耐受性，从而使水稻在干旱和碱等逆境胁迫条件下能正常生长，以减少产量损失。本发明中的AcGDH蛋白对于提高水稻干旱和碱胁迫耐受性，进一步提高水稻的产量具有重要的作用。

附图说明

图1原始和密码子修饰优化后的AcGDH基因的序列比对；

图2 pCAMBIA1301GW图谱(改造后的pCAMBIA1301载体)；

图3a AcGDH与不同物种GDH基因的同源性比对分析；

图3b AcGDH与不同物种GDH基因；

图4a AcGDH基因亚细胞定位；

图4b原核表达并纯化AcGDH蛋白后的SDA-PAGE；

图4c原核表达并纯化后EcGDH蛋白的NADP(H)-GDH酶活性分析；

图4d不同底物酶促动力学分析；

图5a构建AcGDH基因的植物表达载体图谱；

图5b AcGDH转基因水稻的Western blot检测；

图6a干旱条件下AcGDH转基因株系表型分析；

图6b干旱条件下AcGDH转基因株系存活率；

图6c干旱条件下AcGDH转基因株系的失水率；

图6d干旱条件下AcGDH转基因株系不同开闭状态气孔的百分比；

图6e不同开闭状态的气孔；

图6f干旱条件下不同开闭状态气孔的扫描电镜检测结果；

图7a干旱处理条件下AcGDH转基因株系谷氨酸含量测定；

图7b干旱处理条件下AcGDH转基因株系NH₄ ⁺含量测定；

图7c干旱处理条件下AcGDH转基因株系脯氨酸含量测定；

图7d干旱处理条件下AcGDH转基因株系可溶性糖含量测定；

图8a干旱处理条件下AcGDH转基因株系成熟期表型；

图8b干旱处理条件下AcGDH转基因株系及农艺性状；

图8c干旱处理条件下AcGDH转基因株系单株产量；

图9a碱胁迫处理条件下AcGDH转基因株系表型；

图9b碱胁迫处理后再恢复15天的AcGDH转基因株系存活率；

图9c碱胁迫处理条件下AcGDH转基因株系NH₄ ⁺含量测定；

图9d碱胁迫处理条件下AcGDH转基因株系谷氨酸含量测定；

图9e碱胁迫处理条件下AcGDH转基因株系脯氨酸含量测定；

图9f碱胁迫处理条件下AcGDH转基因株系丙二醛(MDA)含量测定；

图9g碱胁迫处理条件下AcGDH转基因株系Na⁺含量测定；

图9h碱胁迫处理条件下AcGDH转基因株系K⁺含量测定；

图9i碱胁迫处理条件下AcGDH转基因株系Na⁺/K⁺比值分析。

具体实施方式

下述实施例中提到的实验方法如无特别说明均为常规方法。

1.AcGDH基因的克隆

通过对已经测序的真菌GDH基因的序列找到GDH基因的保守区，利用primer5设计简并引物。简并引物的正向引物从开放阅读框的起始密码子开始，序列为5'-ATGTCCCACCTGCCTTTCGARCCNGARTT-3'；简并引物的反向引物位于开放阅读框3’端的后面，序列为5'-CCCCACCAGTCACCCTGGTCRTGCATNGC-3'。然后以真菌亮白曲霉(Aspergilluscandidus)的cDNA为模板，利用RT-PCR的方法克隆出AcGDH基因。根据Chen等(2006)的方法将AcGDH基因克隆到GATEWAY入门载体pGWC中然后测序(Chen QJ,Zhou HM,Chen J,WangXC.Using a modified TA cloning method to create entry clones[J].Anal Biochem,2006,358:120–125)。这个基因在NCBI数据库里没有收录，它有完整的开放阅读框(ORF)，氨基酸能够通读，是一个本发明人首次发现的新基因，并将其命名为AcGDH。由于真菌和水稻对密码子的偏爱性不一样，所以为了使AcGDH更好地在水稻植株内表达，根据网站http://www.kazusa.or.jp/codon/中的方法找出需要改变的密码子，通过设计点突变引物并运用重叠PCR技术将AcGDH功能域中的原真菌密码子变成水稻偏爱的密码子。密码子优化AcGDH的点突变位点见图1。

其点突变引物如下：

AcGDH-1F：5’-GCCACCATGTCCCACCTGCCTTTCGAG-3’(下划线序列为kozark序列)，AcGDH-1R：5’-AGAAGCGGCGGATCTCGTTGTCGGAC’；

AcGDH-2F:GTCCGACAACGAGATCCGCCGCTTCT,AcGDH-2R:

5’-CCACCAGTCACCCTGGTCATGCATGG-3’；

AcGDH-3F：5’-TACCCAGAACGAGGTTTCCGGCG-3’，AcGDH-3R:

5’-CGCCGGAAACCTCGTTCTGGGTA-3’。

同时，为了增强真菌AcGDH基因在转基因水稻植株内的翻译水平，在起始密码子ATG前面添加了kozark序列(GCCACC)。将添加了kozark序列并进行了水稻偏爱密码子优化后的AcGDH序列再克隆到pGWC载体中，并将其通过Gateway重组技术的LR反应重组到改造后的pCAMBIA1301GW载体中。改造后的pCAMBIA1301GW载体含有潮霉素抗性筛选基因HPT和红色荧光蛋白筛选标记基因AsRed，并且将Gateway cassette序列克隆到pCAMBIA1301载体多克隆位点SacI和SacII之间，然后在Gateway cassette序列的3’末端加上2个FLAG标签序列，目标基因由来自玉米的泛素启动子(Ubi)组成型驱动表达(图2)。将构建好的pCAMBIA1301GW-AcGDH载体质粒电击转入农杆菌EHA105，并转化粳稻品种Kitaake(Oryzasativa cv.Kitaake)。

2.AcGDH基因的功能验证

(1)AcGDH基因的进化树分析

为了分析AcGDH基因与其他真菌及物种GDH基因的同源性关系，本发明人收集了真菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、藻类、水稻和拟南芥GDH蛋白的氨基酸序列，并运用CLUSTAL X和MEGA 5软件构建进化树。结果表明，AcGDH与已有文献报道的对NH₄ ⁺有很高亲和力的gdhA(Aspergillus niger)和gdhA(Aspergillus awamoyi)的同源性很高(图3a)。将AcGDH与来自黑曲霉(Aspergillus niger)、大肠杆菌(Escherichia coli)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)的GDH氨基酸序列进行相似度分析，发现它们都有保守的NAD(P)H和Glu/α-KG结合结构域(图3b)。

(2)AcGDH的原核表达及酶促动力学分析

水稻原生质体亚细胞定位实验发现，AcGDH定位于细胞质(图4a)。为了分析AcGDH的NADP(H)-GDH酶活性，本发明人构建了原核表达载体pCold-TF-AcGDH并转化大肠杆菌BL21。经体外诱导表达和纯化，并通过SDA-PAGE检测，成功获得了可以用于酶促动力学分析的纯化度较高的AcGDH蛋白(图4b)。将纯化后的AcGDH用于测定NADP(H)-GDH酶活和K_m值(图4c，d)。结果表明，AcGDH在体外正反应的酶活性大于逆反应的酶活性，说明AcGDH倾向于利用NH₄ ⁺将α-酮戊二酸转化为谷氨酸。并且由K_m值可知，AcGDH对NH₄ ⁺的亲和力大于对谷氨酸的亲和力。

(3)AcGDH基因的水稻转化

为了研究AcGDH基因对水稻氮素同化效率的影响，将构建好的pCAMBIA1301GW-AcGDH(图5a)电击转入农杆菌(Agrobacterium)EHA105。然后用含有重组质粒pCAMBIA1301GW-AcGDH的农杆菌侵染水稻愈伤组织，在黑暗处28℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗1个月然后移栽到水田中培养。

(4)AcGDH转基因植株的筛选和分子鉴定

收获T₀代转基因水稻的种子(T₁代)，将种子在水中浸种2天后，移入37℃培养箱催芽3天，然后将露白的种子进行潮霉素抗性筛选。另外，采用荧光定量PCR(Q-PCR)和Westernblot方法分别从转录和蛋白水平对AcGDH进行分子检测，发现外源的AcGDH确实能在水稻中正常稳定转录和翻译为功能蛋白(图5b)。随后，选取单拷贝T-DNA插入的阳性转基因株系Ubi::AcGDH-10和Ubi::AcGDH-13用于后续的实验研究。为了确定AcGDH蛋白在转基因植株体内是否具有NADP(H)-GDH酶活性，我们提取了转基因植株的总蛋白检测NADP(H)-GDH酶活性(图6d)。实验结果表明，转基因植株的NADP(H)-GDH酶活性大于野生型，并且在转基因水稻株系和野生型中都是正反应的酶活性大于逆反应的酶活性。该结果说明，AcGDH蛋白在转基因植株体内能正常发挥氨同化的生理功能。

(5)AcGDH转基因植株的表型分析

将AcGDH转基因水稻和野生型植株置于20％PEG模拟干旱条件下处理6天，再恢复到正常生长条件后，发现AcGDH转基因株系大部分能恢复正常生长，其存活率显著高于野生型(图6a,b)。由体外叶片的失水率和不同开闭状态气孔所占比例结果可知，AcGDH转基因株系的失水率低于野生型，全开状态气孔百分比也低于野生型(图6c,d,e,f)。这些研究结果均证明，在干旱胁迫条件下，AcGDH转基因株系降低了气孔开度，减少了蒸腾作用，显著提高了干旱胁迫耐受性。

(6)AcGDH转基因植株的生理指标测定

在干旱胁迫条件下，与野生型相比，AcGDH转基因株系谷氨酸含量高于野生型(图7a)，而NH₄ ⁺的含量低于野生型(图7b)，说明由于GDH酶活性的提高，AcGDH转基因株系中的NH₄ ⁺被有效同化为谷氨酸，且AcGDH增强了水稻的氨同化效率。脯氨酸与可溶性糖是植物在胁迫条件下产生的小分子物质，能够在逆境胁迫下通过提高渗透保护维持植物生长。脯氨酸与可溶性糖的含量检测发现，与野生型相比，AcGDH转基因株系的脯氨酸与可溶性糖含量均显著高于野生型(图7c,d)。综上所述，AcGDH提高了水稻对NH₄ ⁺的同化效率，从而降低了细胞内过量NH₄ ⁺积累而引起的氨毒害，提高了AcGDH转基因株系在干旱胁迫下的耐受性。

(7)AcGDH转基因植株成熟期表型及农艺性状分析

将处于孕穗期的AcGDH转基因植株和野生型经干旱条件处理15天，发现AcGDH转基因植株生长状况优于野生型；恢复正常生长状况20d后，AcGDH转基因植株基本恢复正常生长状态，而野生型只有少部分恢复(图8a)。将这些干旱处理后的植株置于正常生长状况下直到成熟，然后考察其农艺性状。与野生型相比，经干旱处理后AcGDH转基因株系分蘖数、有效穗、结实率和单株产量均高于野生型，尤其是其单株产量比野生型对照增产50％左右(图8b，c；表1)。而在未处理组中，与野生型相比，AcGDH转基因植株除了株高稍矮外，而其余农艺性状均无差异(表1)。由此可知，AcGDH转基因植株成熟期也具有很强干旱胁迫耐受性。由农艺性状结果可知，AcGDH转基因植株是由于提高了穗的育性或结实率，从而提高了在干旱胁迫下的产量。

表1野生型和AcGDH转基因水稻的田间农艺性状的统计分析

表中的数值代表的是平均值±标准方差(n＝3，*P≤0.05；**P≤0.01，t检验)

(8)AcGDH转基因植株对碱胁迫也具有较高的耐受性

本发明人还检测了AcGDH转基因植株对碱胁迫的响应。在碱胁迫条件下[NaHCO₃/Na₂CO₃溶液(60mmol/L；pH 9.03)处理4天，然后再正常水培15天]，与野生型相比，AcGDH转基因株系具有较高的存活率，表现出明显的碱胁迫耐受性(图9a,b)。与干旱胁迫响应一致的是，碱胁迫条件下AcGDH转基因株系NH₄ ⁺含量比野生型显著降低，而谷氨酸含量则显著升高(图9c,d)。该结果也进一步证实，AcGDH能将因逆境胁迫引起的过量NH₄ ⁺同化为谷氨酸，从而有效消除细胞内的氨毒害，提高碱胁迫的耐受性。同时，AcGDH转基因株系在碱胁迫下的脯氨酸含量也显著高于野生型(图9e)。植物在盐碱胁迫下能避免细胞内Na⁺的积累，并维持较低的Na⁺/K⁺比值，从而有助于增强对盐碱胁迫的耐受性。于是，本发明人检测了碱胁迫下[NaHCO₃/Na₂CO₃溶液(40mM；pH 9.03)]水稻幼苗中丙二醛(MDA)、Na⁺和K⁺的含量，发现除了K⁺含量没有明显变化外，AcGDH转基因株系在碱胁迫下的MDA和Na⁺含量，以及Na⁺/K⁺比值均显著低于野生型对照(图9f-i)。该结果进一步说明，AcGDH显著提高了水稻对碱胁迫的耐受性。

3.AcGDH基因的应用

基于经济效益和增加产量，提高耕地利用率及环境保护的考虑，近年来提高干旱和碱胁迫耐受性水稻新品种的选育引起了大家的重视。当前，提高水稻抗干旱和碱胁迫的新品种选育中，发现了一些候选基因，但在利用基因工程方法，异源表达外源基因以提高干旱和碱胁迫条件下的耐受性的研究并不多见。上世纪80年代产生的转基因技术由于直接在基因水平上改造植物的遗传物质，可定向改造植物的遗传性状，其外源基因的转入打破了物种之间的生殖隔离障碍，极大丰富了可用于作物遗传改良的基因资源，弥补了常规育种方法的不足。由于水稻本身或内源谷氨酸脱氢酶(GDH)对NH₄ ⁺的亲和力低的特性，决定了水稻氮素利用效率不高。目前，国内外的研究工作证实，通过异源表达外源GDH基因于植物中，能显著提高转基因植物的氮素利用率。也有研究证明，通过提高GDH对于氨的同化效率，可减少由于干旱胁迫引起的细胞内氨毒害。但是到目前为止，仅见Zhou等(2015)利用稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶基因MgGDH提高水稻苗期对干旱境胁迫耐受性的报道(Zhou Y,Zhang C,Lin J,Yang Y,Peng Y,Tang D,Zhao X,Zhu Y,LiuX.Over-expression of a glutamate dehydrogenase gene,MgGDH,from Magnaporthegrisea confers tolerance to dehydration stress in transgenic rice[J].Planta,2015,241:727–740)，而利用真菌GDH基因用于提高作物耐碱性还未见报道。因此，在水稻中异源表达真菌的GDH基因，提高NH₄ ⁺同化效率以降低由于干旱等逆境胁迫引起的氨毒害，对提高水稻的氮素高效利用和抗逆性的前景很大。在本发明中，本发明人通过农杆菌介导的遗传转化方法，将亮白曲霉(Aspergillus candidus)的GDH基因(AcGDH)转入水稻，发现异源表达的AcGDH不仅提高了水稻的氮同化效率，而且显著增强了水稻对干旱和碱胁迫的耐受性。尤其是在干旱胁迫条件下，AcGDH转基因株系的单株产量比野生型对照增产50％左右，显著降低了逆境胁迫对水稻产量的不良影响，从而达到增产或稳产的目的。尽管本发明所例举的作物遗传改良为水稻，但是AcGDH基因还可以广泛应用于其他作物的干旱和碱胁迫耐受性的遗传改良，对于有效利用可耕地和保障国家粮食安全具有重要的应用前景。

<110>湖南大学

<120>提高水稻干旱和碱胁迫耐受性的亮白曲霉AcGDH蛋白、基因及应用

<160> 2

<210> 1

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<213> 散囊菌目发菌科麹菌属亮白曲霉（Aspergillus candidus）

<400> 1

ATGTCCCACCTGCCTTTCGAGCCGGAGTTCGAGCAGGCCTACAAGGAGCTCGCCTCTACCCTCGAGAACTCCACTCTCTTCCAGAAGAACCCTGAGTACCGCAAGGCTCTCGCCGTTGTCTCCGTCCCCGAGCGTGTCATCCAGTTCCGTGTCGTCTGGGAGGATGACAACCACCAGGTTCAGGTGAACCGTGGTTTCCGTGTTCAGTTCAACTCCGCTCTCGGTCCCTACAAGGGTGGTCTTCGTTTCCACCCCTCCGTCAACCTTTCTATCCTCAAGTTCTTGGGTTTCGAGCAGATCTTCAAGAATGCTCTCACCGGTCTGAACATGGGTGGTGGTAAGGGTGGTTCTGACTTCGACCCCAAGGGCAAGTCCGACAACGAAATCCGCCGCTTCTGTGTTGCTTTCATGACCGAGCTCTGCAAGCATATCGGTGCCGACACTGACGTTCCCGCTGGTGATATCGGTGTCACCGGCCGTGAGGTCGGTTTCCTTTTCGGCCAGTACCGCAAGATCCGCAACCAGTGGGAGGGTGTCCTCACCGGTAAGGGTGGCAGCTGGGGTGGTTCTCTGATCCGTCCCGAGGCCACTGGCTACGGTGTTGTCTACTACGTTGAGCACATGATCAAGCACGCTACCGACGGCAAGGAGTCCTTCGCCGGCAAGCGCGTCGCCATCTCTGGCTCCGGTAACGTCGCCCAGTACGCCGCTCTCAAGGTCATCGAGCTTGGCGGTTCCGTCGTCTCCCTCTCCGACAGCAAGGGCGCCCTGGTCGTCAACGGTGAGGGCAGCTTCACCCCCGAGGAGATCAACACCATCGCCCAGATCAAGGTCGACCGCAAGCAGATCTCCGAGATTGCCAGCACTGAGGCTTTCGCTTCCAAGTTCAAGTACATCCCCGGTGCCCGTCCCTGGACCCACGTCGGCAAGGTTGACATCGCTCTCCCCTCTGCTACCCAGAACGAAGTTTCCGGCGAGGAAGCCCAGGCCCTCATCGACGCTGGCTGCAAGTTCATCGCCGAAGGTTCCAACATGGGTTCCACCCAGGACGCCATCGACATCTTCGAGGCCCACCGTGAGGCCAACAAGGGTGCTGCCGCTATCTGGTACGCTCCCGGTAAGGCCGCCAACGCCGGTGGTGTCGCCGTCTCCGGTCTCGAGATGGCCCAGAACTCTGCTCGCATCAACTGGACCTCCGAGGAGGTCGATGCTCGCCTCAAGGGTATCATGGAAGACTGCTTCAAGAACGGTCTCGAGACTGCTATCGAGTACGCTACTCCTTCTGAGGGCGTCCTTCCTTCCCTCGTCACCGGTAGCAACATTGCGGGTTTCACCAAGGTTGCTGCTGCCATGCATGACCAGGGTGACTGGTGGTGA

<210> 2

<211> 458

<212> 氨基酸

<400> 2

Met Ser His Leu Pro Phe Glu Pro Glu Phe Glu Gln Ala Tyr Lys Glu LeuAla Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Leu Phe Gln Lys Asn Pro Glu Tyr Arg Lys AlaLeu Ala Val Val Ser Val Pro Glu Arg Val Ile Gln Phe Arg Val Val Trp Glu AspAsp Asn His Gln Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala LeuGly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Leu LysPhe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ala Leu Thr Gly Leu Asn MET Gly GlyGly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Asn Glu Ile Arg ArgPhe Cys Val Ala Phe MET Thr Glu Leu Cys Lys His Ile Gly Ala Asp Thr Asp ValPro Ala Gly Asp Ile Gly Val Thr Gly Arg Glu Val Gly Phe Leu Phe Gly Gln TyrArg Lys Ile Arg Asn Gln Trp Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Gly Ser Trp GlyGly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Val Val Tyr Tyr Val Glu HisMET Ile Lys His Ala Thr Asp Gly Lys Glu Ser Phe Ala Gly Lys Arg Val Ala IleSer Gly Ser Gly Asn Val Ala Gln Tyr Ala Ala Leu Lys Val Ile Glu Leu Gly GlySer Val Val Ser Leu Ser Asp Ser Lys Gly Ala Leu Val Val Asn Gly Glu Gly SerPhe Thr Pro Glu Glu Ile Asn Thr Ile Ala Gln Ile Lys Val Asp Arg Lys Gln IleSer Glu Ile Ala Ser Thr Glu Ala Phe Ala Ser Lys Phe Lys Tyr Ile Pro Gly AlaArg Pro Trp Thr His Val Gly Lys Val Asp Ile Ala Leu Pro Ser Ala Thr Gln AsnGlu Val Ser Gly Glu Glu Ala Gln Ala Leu Ile Asp Ala Gly Cys Lys Phe Ile AlaGlu Gly Ser Asn MET Gly Ser Thr Gln Asp Ala Ile Asp Ile Phe Glu Ala His ArgGlu Ala Asn Lys Gly Ala Ala Ala Ile Trp Tyr Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn AlaGly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu MET Ala Gln Asn Ser Ala Arg Ile Asn TrpThr Ser Glu Glu Val Asp Ala Arg Leu Lys Gly Ile MET Glu Asp Cys Phe Lys AsnGly Leu Glu Thr Ala Ile Glu Tyr Ala Thr Pro Ser Glu Gly Val Leu Pro Ser LeuVal Thr Gly Ser Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala Ala Ala MET His Asp GlnGly Asp Trp Trp

Claims

1.水稻提高干旱和/或碱胁迫耐受性的相关蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

2.权利要求1所述的水稻提高干旱胁迫耐受性和/或碱胁迫耐受性相关蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述水稻提高干旱胁迫耐受性和/或碱胁迫耐受性相蛋白质的cDNA基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

4.含有权利要求2 或3所述水稻提高干旱胁迫耐受性和/或碱胁迫耐受性蛋白编码基因的表达载体或宿主菌。

5. 扩增权利要求2 或3所述水稻提高干旱胁迫耐受性和/或碱胁迫耐受性蛋白编码基因的引物，正向引物序列为：5'-ATGTCCCACCTGCCTTTCG-3'；反向引物序列为：5'-CCACCAGTCACCCTGGTCA-3'。

6.权利要求2 或3所述水稻提高干旱胁迫耐受性和/或碱胁迫耐受性蛋白编码基因在培育水稻品种中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：将如权利要求4所述的表达载体导入植物中，筛选获得在干旱胁迫及碱胁迫条件下耐受性提高的植株，所述植物是水稻。