CN1333349A - 一种提高植物氮素同化效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高植物氮素同化效率的方法,包括:(a)将真菌谷氨酸脱氢酶(GDH)基因与一种可在植物中引导外源基因表达的启动子相连,构建嵌合基因:(b)将构建的嵌合基因导入植物细胞中,筛选并培养出被转化的植株。

Description

一种提高植物氮素同化效率的方法
本发明涉及一种提高植物氮素同化效率的方法。
氮素是植物生长所需的第一大营养元素。目前农业上所施用的氮肥仅有30％-40％被植物吸收利用，大部分都浪费。有一部分转化为硝酸盐流失到土壤中，造成环境污染。转GDH的作物能有效增加植物氮素的吸收，提高氮肥利用率，从而可以节约氮肥的施用量，起经济效益是巨大的。同时，GDH广泛存在于动植物和微生物中，因此转GDH的植物对人和动植物不会产生危害。
现在主要有美国、澳大利亚等国家进行谷氨酸脱氢酶转基因植物的研究(美国专利NO.5955651；5985634；5998700)。它们的谷氨酸脱氢酶基因主要来源于小球藻和大肠杆菌，模式植物为烟草、玉米等经济作物。经研究发现，转谷氨酸脱氢酶基因的植物其氮素利用率有所提高，表现在植物叶片较大且数量较多。转大肠杆菌GDH的植物不同组织的含氮量经测定比对照组多16％左右，同时不同组织中氨基酸含量有所变化。较为显著的是，谷氨酸含量明显较低，而丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸等含量增加较大。转GDH基因土豆的淀粉行量较对照组明显增多。但目前为止所使用的谷氨酸脱氢酶的活性多较低。
本发明的目的是提供一种提高植物氮素同化效率的方法。
本发明提供了一种提高植物氮素同化效率的方法，包括：(a)将真菌谷氨酸脱氢酶(GDH)基因与一种可在植物中引导外源基因表达的启动子相连，构建嵌合基因：(b)将构建的嵌合基因导入植物细胞中，筛选并培养出被转化的植株。
在本发明的方法中，所述的谷氨酸脱氢酶基因可以是辅基NADP谷氨酸脱氢酶基因或辅基NAD谷氨酸脱氢酶基因。
在本发明的方法中，所述的真菌谷氨酸脱氢酶基因可以来自丝状真菌的脉孢霉属真菌，包括中间脉孢霉、好食脉孢霉、粗糙脉孢霉。所述的谷氨酸脱氢酶基因也可以来自酵母真菌，例如啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。所述的谷氨酸脱氢酶基因还可以来自担子菌，例如双孢菇(Agaricus bisporus)。
在本发明的方法中，所述的植物可以是烟草、玉米、棉花或水稻。
在本发明的方法中，所述的谷氨酸脱氢酶可以来自中间脉孢霉Neurospora intermedia(简称Ni)的谷氨酸脱氢酶，它具有如下所示的氨基酸序列：MSNLPSEPEFEOAYKELAYTLENSSLFOKHPEYRTALTVASIPERVIOFRVVWEDDNGNVOVNRGYRVOFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEOIFKNALTGLSMGGGKGGADFDPKGKSDAEIRRFCCAFMAELHKHIGADTDVPAGDIGVGGREIGYMFGAYRKAANRFEGVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVGHMLEYSGAGSYAGKRVALSGSGNVAOYAALKLIELGATWSLSDSKGALVATGESGITVEDINAVMAIKEAROSLTSFOHAGHLKWIEGARPWLHVGKVDIALPCATONEVSKEEAEGLLAAGCKFVAEGSNMGCTLEAIEVFENHRKEKKGEAVWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAONSORLNWTOAEVDEKLKDIMKNAFFNGLNTAKIYVEAAEGELPSLVAGSNIAGFVKVAOAMHDOGDWWSKN
编码上述的谷氨酸脱氢酶的基因可以具有如下所示的核苷酸序列：ATGTCTAACCTTCCCTCTGAGCCCGAGTTTGAGCAGGCCTACAAGGAGTTGGCCTACACTCTCGAGAACTCCTCCCTCTTCCAGAAGCACCCCGAGTACCGCACTGCCCTCACCGTTGCCTCCATCCCCGAGCGTGTCATTCAGTTCCGTGTTGTCTGGGAGGACGACAACGGCAACGTCCAGGTCAATCGCGGTTACCGTGTCCAGTTCAACTCCGCCCTCGGTCCCTACAAGGGTGGTCTCCGTCTCCACCCCTCCGTCAACCTTTCCATTCTCAAGTTCCTCGGTTTCGAGCAGATCTTCAAGAATGCCCTCACTGGCTTGAGCATGGGTGGTGGCAAGGGTGGTGCCGACTTCGACCCCAAGGGCAAGAGCGACGCTGAGATCCGTCGCTTCTGCTGCGCTTTCATGGCTGAGCTTCACAAGCACATTGGTGCCGATACCGATGTTCCCGCTGGTGACATCGGTGTTGGTGGCCGTGAGATCGGCTACATGTTCGGTGCCTACCGCAAGGCCGCGAACCGTTTCGAGGGTGTCCTTACTGGCAAGGGCCTCTCCTGGGGTGGTTCGCTCATTCGCCCTGAGGCCACTGGTTACGGCCTCGTCTACTACGTCGGCCACATGCTCGAGTACTCTGGCGCCGGATCCTACGCTGGCAAGCGCGTTGCCCTCTCCGGTTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCCGCCCTCAAGCTCATTGAGCTAGGCGCCACCGTTGTCTCCCTCTCCGACTCCAAGGGTGCTCTTGTCGCCACTGGCGAGTCCGGCATCACCGTTGAGGACATCAACGCCGTTATGGCCATCAAGGAGGCCCGTCAGTCCCTTACCAGCTTCCAGCACGCTGGTCACCTGAAGTGGATCGAGGGCGCCCGCCCCTGGCTTCACGTTGGCAAGGTTGACATCGCTCTTCCTTGCGCTACCCAGAACGAGGTCTCCAAGGAGGAGGCTGAGGGTCTCCTTGCCGCCGGCTGCAAGTTCGTCGCTGAGGGTTCCAACATGGGCTGCACTCTCGAGGCCATTGAGGTCTTTGAGAACCACCGCAAGGAGAAGAAGGGCGAGGCCGTCTGGTACGCCCCCGGCAAGGCCGCCAACTGTGGTGGTGTTGCCGTTTCCGGTCTCGAGATGGCTCAGAACAGCCAGCGCCTCAACTGGACTCAGGCTGAGGTTGACGAGAAGCTCAAGGACATCATGAAGAACGCCTTCTTCAACGGTCTCAACACTGCCAAGATCTACGTCGAGGCTGCTGAGGGCGAGCTTCCTTCCCTCGTTGCTGGCTCCAACATTGCTGGTTTCGTCAAGGTTGCCCAGGCCATGCACGACCAGGGTGACTGGTGGTCCAAGAACTAA
本发明的方法中，所述的谷氨酸脱氢酶可以来自好食脉孢霉Neurospora sitophila(简称Ns)，它具有如下所示的氨基酸序列：MSNLPSEPEFEOAYKELAYTLENSSLFOKHPEYRTALAVASIPERVIOFRVVWEDDNGNVOVNRGYRVOFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEOIFKNALTGLSMGGGKGGADFDPKGKSDAEIRRFCCAFMAELHKHIGADTDVPAGDIGVGGREIGYMFGAYRKAANRFEGVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVGHMLEYSGAGSYAGKRVALSGSGNVAOYAALKLIELGATWSLSDSKGALVATGESGITVEDINAIMAIKEAROSLTTFOHAGHVKWIEGARPWLHVGKVDIALPCATONEVSKEEAEGLLAAGCKFVAEGSNMGCTLEAIEVFENNRKEKKGEAVWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAONSORLNWTOAEVDEKLKDIMKNAFFNGLNTAKTYAEAAEGELPSLVAGSNIAGFVKVPOAMHDOGDWWSKN
编码上述的谷氨酸脱氢酶基因可以具有以下的核苷酸序列：ATGTCTAACCTTCCCTCTGAGCCCGAGTTCGAGCAGGCCTACAAGGAGTTGGCCTACACTCTCGAGAACTCCTCCCTCTTCCAGAAGCACCCCGAGTACCGCACCGCCCTCGCCGTTGCCTCCATCCCCGAGCGTGTCATTCAGTTCCGTGTTGTCTGGGAGGACGACAACGGCAACGTCCAGGTCAACCGCGGTTACCGTGTCCAGTTCAACTCCGCCCTCGGTCCCTACAAGGGTGGTCTCCGTCTCCATCCCTCCGTCAACCTTTCCATTCTCAAGTTCCTCGGTTTCGAGCAGATCTTCAAGAATGCCCTTACTGGCCTGAGCATGGGTGGTGGCAAGGGTGGTGCCGACTTCGACCCCAAGGGCAAGAGCGATGCTGAGATCCGTCGCTTCTGCTGCGCTTTCATGGCCGAGCTTCACAAGCACATTGGTGCCGATACCGATGTTCCCGCTGGTGATATTGGTGTTGGTGGCCGCGAGATCGGTTACATGTTCGGTGCCTACCGCAAGGCTGCGAACCGTTTCGAGGGTGTCCTTACTGGTAAGGGCCTCTCCTGGGGTGGTTCGCTCATTCGCCCTGAGGCCACTGGTTACGGTCTCGTCTACTACGTCGGCCACATGCTCGAGTACTCTGGCGCCGGCTCCTACGCTGGCAAGCGCGTTGCCCTCTCTGGTTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCCGCCCTCAAGCTCATTGAGCTAGGCGCCACCGTTGTCTCCCTCTCCGACTCCAAGGGTGCCCTTGTCGCCACTGGCGAGTCCGGCATCACTGTTGAGGACATCAACGCCATCATGGCCATCAAGGAGGCCCGTCAGTCTCTTACCACCTTCCAGCACGCTGGCCACGTCAAGTGGATCGAGGGCGCCCGCCCCTGGCTTCACGTTGGCAAGGTTGACATCGCTCTTCCTTGCGCTACCCAGAACGAGGTCTCCAAGGAGGAGGCTGAGGGTCTCCTTGCCGCCGGCTGCAAGTTCGTCGCTGAGGGTTCCAACATGGGCTGCACTCTCGAGGCCATCGAGGTCTTTGAGAACAACCGCAAGGAGAAGAAGGGCGAGGCCGTCTGGTACGCCCCCGGCAAGGCCGCCAACTGTGGTGGTGTTGCCGTTTCCGGTCTCGAGATGGCTCAGAACAGCCAGCGCCTCAACTGGACTCAGGCTGAGGTTGACGAGAAGCTCAAGGACATCATGAAGAACGCCTTCTTCAACGGTCTCAACACTGCCAAGACCTACGCCGAGGCTGCTGAGGGCGAGCTTCCTTCCCTCGTTGCCGGCTCCAACATTGCTGGTTTCGTCAAGGTACCCCAGGCCATGCACGACCAGGGTGACTGGTGGTCCAAGAACTAA
我们将Ni-GDH，Ns-GDH，Nc-GDH三种脉孢霉属基因克隆进大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，纯化的Ni-GDH，Ns-GDH，Nc-GDH进行酶活性测定，发现三种GDH的酶活性高于其他属的脉孢霉。它对氨的亲和力和稳定性都较强。将着三种GDH基因亚克隆到植物表达载体pROKII中，通过农杆菌转化，电激法转化和花粉管通道法转化烟草、玉米、棉花等作物。经PCR、Southern、Northern和酶活性染色鉴定，筛选出P8‘性转化子。将其移至不同氮浓度的培养基中，发现在低氮5mM至更低的氨离子浓度下，表达GDH的烟草都能正常生长，而未转化的对照组的叶片黄化，发育受阻，呈现缺氮症状。测定植物在低氮条件下的含氮总量及未利用氮残留量，发现转真菌GDH植株的含氮量较未转化的高20％以上，氮残留量减少20-30％。测定植株在贫氮土壤中的总氮量，结果较未转化植株高40％左右。同时我们构建了转GDH基因的玉米、水稻、棉花等经济作物，发现其含氮量较末转化作物高20-30％土壤中氮残留量减少20％以上。检测表明，GDH在上述植物中得到了高表达，它加快了谷氨酸的氧化脱氨和α-酮戊二酸(2-oxoglutarate)的还原氨基化作用，使植物中启动了一条新的氮利用途径，从而提高了氨的利用率。高等植物中虽也有GDH，但其对氨的亲合力只有真菌GDH的1/10至1/100，故不能发挥同化氨的作用。真菌GDH使谷氨酸的氧化脱氨伴随着大量ATP的释放和α-酮戊二酸(2-oxoglutarate)的形成，这给植物提供充足的能量和大量参与三羧酸循环的碳水化合物。氮素是植物生长所需的第一大营养元素，目前农业上所施用的氮肥仅有30％-40％为作物吸收利用，大部分都流失，造成环境污染。而转GDH的作物能够有效地提高氮素利用率，从而可以节约氮肥的利用量，减少环境污染，其经济效益是十分巨大。
实施例实施例1.脉孢霉属真菌、啤酒酵母和双孢菇的培养及其谷氨酸脱氢酶的诱导
1.将三种真菌由固体斜面转于麦芽汁培养基中，250转/分钟摇床培养48小时离心收集菌丝体，转入氨诱导培养基(4％葡萄糖，0.02MNH4AC，0.04MKN05)中诱导3小时，离心收集菌丝体。
2.总RNA的抽提和逆转录—聚合酶链式反(RT-PCR)方法扩增谷氨酸脱氢酶基因：诱导后的菌丝体经液氮研磨破碎后，采用异硫氰酸胍法抽提总RNA进行逆转录一聚合酶链式反应。
所用引物如下：
引物1：5’GCTCAGAATGTCTAACCTTCCCTCTGAG 3’
引物2：5’GCGAGCTCTAGTCTTGGACCACCAGTCACC 3’逆转录反应条件是：
65℃ 1分钟，
30℃ 5分钟，
30℃-65℃ 30分钟，
98℃ 5分钟，
5℃    5分钟。
聚合酶链式反应条件：
94℃ 3分钟，
94℃ 1分钟
55℃1分钟25个循环
72℃ 2分钟
72℃ 10分钟
3.脉孢霉属谷氨酸脱氢酶(GDH)基因序列测定：
将RT-PCR方法扩增的谷氨酸脱氢酶(GDH)基因经琼脂糖凝胶电泳回收。取3微升(ul)回收产物，加入1ul pGEM-T easy载体，5ul 2xT4连接酶缓冲液，1ul DNA连接酶，4℃酶连过夜。次日，将酶连产物转化大肠杆菌DH50a进行菌落筛选。筛选方法采用菌落PCR和酶切鉴定，酶切位点为XbaI、SacI。酶切产生3.0kb和1.4kb两条带者为阳性克隆pT-GDH。挑取阳性克隆，进行序列测定。
4.啤酒酵母和双孢菇谷氨酸脱氢酶(GDH)基因序列测定：
将RT-PCR方法扩增的谷氨酸脱氢酶(GDH)基因经琼脂糖凝胶电泳回收。取3微升(ul)回收产物，加入1ul pGEM-T easy载体，5ul 2xT4连接酶缓冲液，1ul DNA连接酶，4℃酶连过夜。次日，将酶连产物转化大肠杆菌DH50a进行菌落筛选。筛选方法采用菌落PCR和酶切鉴定，酶切位点为XbaI、SacI。酶切产生3.0kb和1.4kb两条带者为阳性克隆pT-GDH。挑取阳性克隆，进行序列测定。
5.脉孢霉、啤酒酵母和双孢菇谷氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达载体pT-GDH经XbaI、SacI酶切，琼脂糖电泳回收得到GDH片段，与经同样酶切的pBluescript载体在4℃酶连过夜。次日转化大肠杆菌DH50a，经菌落PCR和酶切鉴定阳性克隆pBIueGDH。pBlueGDH经ECoRV、SacI酶切，琼脂糖电泳回收得到GDH片段，与经同样EcoRV、SacI酶切的pET30a载体在12℃酶连过夜。次日转化大肠杆菌DH50a，经菌落PCR和酶切鉴定，阳性克隆为pETGDH。次日，挑取阳性克隆，转化大肠杆菌BL21(DE3)。培养至OD0.4左右，经1mM IPTG诱导4hr，收获菌体。菌体经去离子水洗涤后，超声裂解。离心，上清和沉淀分别进行10％SDS-PAGE电泳。结果证明表达产物以为包涵体形式存在。
6.金属整合亲和层析纯化谷氨酸脱氢酶
配制含8M尿素的MCAC-0溶液中(20mm/L Tris·Cl，pH7.9，0.5mol/L NaCl，10％(v/v)甘油，1mm01几PMSF)。同时配制MCAC-40，MCAC-60，MCAC-80，MCAC-100，MCAC-200，MCAC-500，即在MCAC-0中分别添加0.4mol/L、0.6mol/L，0.8mol/L、1mol/L、2mol/1、5mol/L的咪唑。
将谷氨酸脱氢酶包涵体溶于含8M尿素的MCAC-0溶液中，上样于NTA层析柱中，以20-30ml/h的流速用5ml 8M Urea-MCAC缓冲液洗柱，弃流出液。以分段洗脱的方式依次用5ml下列缓冲液洗柱，8MUrea-MCAC40，8M Urea-MCAC60，8M Urea-MCAC80，8MUrea-MCAC100，8M Urea-MCAC200，8M Urea-MCAC500，分别收集流出液，进行10％SDS-PAGE电泳，银染进行纯度鉴定。收集8M Urea“MCAC200以后的沈脱液，进行透析复性。透析缓冲液分两种，分别为pH8.5和pH7.4的0.1mol/L Tris.HCl，1mM EDTA。
7.谷氨酸脱氢酶活性测定将透析过夜的复性蛋白离心，收集上清，经280nm紫外检测测定蛋白浓度，浓度(mg/ml)＝A280×0.825。在体系A、体系C中分别测定酶活。体系A测定GDH还原氨基化作用。
2.55ml 0.1MTris.HCl，1mMEDTA，pH7.4
0.1ml  0.1MNH4Cl
0.15ml 0.2M a-酮戊二酸
0.2ml  0.15％(W/V)NADPH
2ul复性蛋白，25℃温育10分钟，在25℃恒温下测定体系A在340nm光吸收值的变化。体系C，测定GDH氧化脱氨作用：2.8ml 0.16M谷氨酸单钠盐溶于0.1M Tris.HCl，1mM EDTA，pH8.5的缓冲液中，0.2ml 0.2％NADP，2ul复性蛋白，37℃温育10分钟后，测定在340mm光吸收值的变化。活性单位为每分钟还原每一微摩尔NADP+为一单位或每分钟氧化每一微摩尔NADPH为一单位。结果测定为在体系A中Ni-GDH活性单位为109.92U/mg，在体系C中，为Ni-GDH为72.93U/mg，Ns-GDH在体系A中为95.37U/mg，在体系C中为63013U/mg，Nc-GDH在体系A中为100.25U/mg，在体系C中为65.00U/mg。
8.脉孢霉谷氨酸脱氢酶基因亚克隆入植物表达载体pROKII从pT-GDH载体上用XbaI、SacI双酶切将GDH基因片段切下，经琼脂糖电泳回收后，与经同样酶切的pROKII载体在4℃酶连过夜。次日转化大肠杆菌DH5a，经菌落PCR和酶切鉴定阳性克隆pROKII-GDH，挑选阳性克隆转化入农杆菌LBA4404中。
9.啤酒酵母、双孢菇谷氨酸脱氢酶基因亚克隆入植物表达载体pROKII从pT-GDH载体上用XbaI、SacI双酶切将GDH基因片段切下，经琼脂糖电泳回收后，与经同样酶切的pROKII载体在4℃酶连过夜。次日转化大肠杆菌DH5a，经菌落PCR和酶切鉴定阳性克隆pROKII-GDH，挑选阳性克隆转化入农杆菌LBA4404中。
10.根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草
(1)烟草无菌苗的培养
将烟草种子表面消毒后培养在无激素的MS培养基(MS盐＋15g/L蔗糖＋8g/L琼脂)上培养。25-28℃，80uE(m2.S)光照16小时，随着小苗的生长(1-1.5个月以后)，将茎尖切下，转到新的MS培养基生成小植株。
(2)烟草叶盘共培养含重组质粒的根癌农杆菌接种于5ml含卡那霉素和利福平的培养基中，28℃ 200转/分摇床培养过夜，离心收集菌体。将无菌苗叶片边缘和中脉用手术刀切去，沿中脉垂直方向将叶片切成5-8mm宽的叶条，叶片切割后立即放入农杆菌液中浸泡30-40分钟。用镊子取出共培养的叶片，放到无菌的滤纸上吸去过多的菌液，叶条移入含共培养培养基(MS无机盐＋0.6mg/12，4-D＋30g/1蔗糖＋8g/l琼脂)的平皿中。用膜将平皿封口，以减少水分蒸发和污染。28℃暗培养48hr。11.转化植株的筛选
将共培养叶片转移到愈伤组织诱导培养基(MS无机盐＋0.6mg/12，4-D＋300mg/l卡那霉素＋500mg/l援节青霉素＋30g/1蔗糖＋8g/1琼脂)上，使转化叶片充分接触培养基有利于营养和激素的吸收，在愈伤组织诱导培养基上培养两周后，将叶片转移到芽培养基(MS无机盐，1mg/L IAA＋1mg/L 6-BA＋300mg/L卡那霉素＋500mg/L羧苄青霉素＋30g/L蔗糖＋8g/L琼脂)上培养。用解剖刀切下小芽转移到生根培养基(MS无机盐＋0.4mg/11BA＋100mg/1卡那霉素＋30g/1蔗糖＋8g/l琼脂)上培养。
12.基因枪法转化玉米
将基因枪放置于一较大超净台中，以利于无菌操作。取6ul包被DNA的金属颗粒无水乙醇悬浮液(约0.6ug质粒和0.37ug金属颗粒)点于微粒子载体中心，立即在干燥器中干燥，或在工作台上吹干。将欲转化的靶组织中铺在一个由液体培养基润湿过的1-2层滤纸或含固体培养皿的9cm培养皿中心，抽真空，当真空度达到所需值(660-760mmHg，1mmHg＝133，322Pa)时，进行轰击，约12秒钟打一枪。将轰击后的外植体转入愈伤组织诱导培养基或芽分化培养基，28℃，黑暗或弱光下培养，该培养基中不加入抗生素等筛选压力，过渡培养一般1-2周。过渡培养后的外植体在含适当卡那雷素的培养基上进行选择培养，1个月左右转入继代扩繁培养基中培养。
13.花粉管通道法介导真菌GDH基因转化棉花含GDH基因的pROKII-GDH载体溶于1×SSC溶液中，选择发育正常的花去雄，套袋隔离，授粉前一天将棉花花丝剪齐，在无菌培养皿中加入一薄层花粉萌发培养基，采集末萌发的新鲜花粉置于培养基中，在30℃条件下培养3分钟左右，每10ml培养基中加入30mm3花粉，当约1/10的花粉已经萌发时，加入1/10体积的DNA溶液小心混匀，与花粉混合后DNA的终浓度为5ug/ml，将DNA与花粉的混合液涂于柱头上，约10mm3处理后的花粉授一个雌穗，授粉后重新套袋隔离至种子成熟。
14.农杆菌介导的真菌GDH基因转化水稻含重组GDH基因的根癌农杆菌接种于5ml含卡那霉素和利福平液中，28℃200转/分培养过夜，离心收集菌体，将无菌苗切割后立即放入农杆菌液中浸泡30分钟，取出叶片，故到无菌的滤纸上吸去过多的菌液，转入共培养基中培养。28℃暗培养48hr。
15.转真菌GDH基因植物阳性转化子的筛选和鉴定
(1)从植物中抽提DNA方法
取1g植物叶片，加液氮研磨成粉末。加入700以2xCTAB提取液(2％(W/V)CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)，100mmol/1Tris·Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/1NaCl)，轻轻摇匀，65℃水浴30分钟，其间不时摇动。加入700ul酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，并轻摇至溶液呈乳化状态，7000转/分离心5分钟。取上清液继续用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2-3次，加2倍体积无水乙醇，混匀于-20℃沉淀过夜。7000转/分离心10分钟，收集核酸沉淀，溶于去离子水中。-20℃贮存备用。
(2)核酸杂交法鉴定阳性转化子
将抽提的植物总DNA酶切过夜，酶切位点为XbaI，SacI，次日进行琼脂糖凝胶电泳。将DNA片段从凝胶电泳中转移至尼龙膜上，紫外照射3分钟使DNA片段固定。将用地高辛(DIG)标记好的探针与尼龙膜上固定的DNA进行杂交，杂交温度68℃，时间20小时。杂交完成后，清洗尼龙膜，和抗地高辛的碱性磷酸酶(anti DIG-AP)反应30分钟，清洗后进行NBT/BCIP显色。
结果，在1400bp左右位置出现一条杂交带，和阳性对照相同，表明GDH基因已经整合入植物基因组中。
16.转化植株的移栽和后代分析
小心移去植株根部的琼脂，将植株转移至含MS无机盐溶液的较大容器里，将盖子打开，使气体扩散几小时，同时加入一些无菌水以补充蒸发的液体，之后把植株移栽到湿润的土壤里。所结种子以核酸杂交和GDH酶活染色测定后代分离，直至获得纯合的转基因品系。
17.凝胶分析和谷氢酸脱氢酶活性染色
在液氨中研磨，提取植株叶片蛋白，进行5％非变性凝胶电泳，120V72小时。将凝胶浸泡在下述染色液中(50mMTrispH9.3，8mg/ml谷氨酸，0.04mg/ml NADP，0.04mg/ml MTT，0.04mg/ml硫酸的吩咳，0.08mg/mlCaCl2)。凝胶在染色液中浸泡后，在含GDH的部位有一条带，表明转化的GDH在植株体内表达出有活性谷氨酸脱氢酶。
18.转基因植株的生长和氮素利用率测试
表达真菌GDH阳性植物收获种子后，进行无菌苗的繁殖(同8(1))。随着小苗的生长，将茎尖切下，转到不同氮含量的MS培养基上。氨的浓度分别为20mM，10mM，5mM，2.5mM，以测试其生长状况。结果，在20mM，10mM的MS培养基上，阳性转化子和对照组后代未显出明显区别。在5mM和2.5mM培养基上，阳性转化子生长状况显著优于对照组，而对照则出现叶片萎黄等缺氮症状。等植物生长1-1.5个月后，将植株清洁干净，烘干，测试干重。结果显示，阳性转化子比对照组干重增加20％左右。同时利用凯氏定氮法，测得转基因植株的含氮率比对照组增加20-30％左右。同时测定生长在MS培养基中植物的氮素利用率，转化植株较未转化植物的氮素利用率提高20-30％左右。

Claims (13)

1.一种提高植物氮素同化效率的方法，包括：(a)将真菌谷氨酸脱氢酶(GDH)基因与一种可在植物中引导外源基因表达的启动子相连，构建嵌合基因：(b)将构建的嵌合基因导入植物细胞中，筛选并培养出被转化的植株。
2.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的真菌谷氨酸脱氢酶基因是辅基NADP谷氨酸脱氢酶基因或辅基NAD谷氨酸脱氢酶基因。
3.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的真菌谷氨酸脱氢酶基因来自丝状真菌的脉孢霉属真菌。
4.按照权利要求3所述的方法，其中，所述的丝状真菌的脉孢霉属真菌包括中间脉孢霉、好食脉孢霉、粗糙脉孢霉。
5.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶基因来自酵母真菌。
6.按照权利要求5所述的方法，其中，所述的酵母真菌是啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
7.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶基因来自担子菌。
8.按照权利要求7所述的方法，其中，所述的担子菌是双孢菇(Agaricus bisporus)。
9.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的植物是烟草、玉米、棉花或水稻。
10.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶来自中间脉孢霉Neurospora intermedia(简称Ni)的谷氨酸脱氢酶，它具有如下所示的氨基酸序列：MSNLPSEPEFEOAYKELAYTLENSSLFOKHPEYRTALTVASIPERVIOFRVVWEDDNGNVOVNRGYRVOFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEOIFKNALTGLSMGGGKGGADFDPKGKSDAEIRRFCCAFMAELHKHIGADTDVPAGDIGVGGREIGYMFGAYRKAANRFEGVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVGHMLEYSGAGSYAGKRVALSGSGNVAOYAALKLIELGATVVSLSDSKGALVATGESGITVEDINAVMAIKEAROSLTSFOHAGHLKWIEGARPWLHVGKVDIALPCATONEVSKEEAEGLLAAGCKFVAEGSNMGCTLEAIEVFENHRKEKKGEAVWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAONSORLNWTOAEVDEKLKDIMKNAFFNGLNTAKIYVEAAEGELPSLVAGSNIAGFVKVAOAMHDOGDWWSKN
11.按照权利要求10所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶的基因具有如下所示的核苷酸序列：ATGTCTAACCTTCCCTCTGAGCCCGAGTTTGAGCAGGCCTACAAGGAGTTGGCCTACACTCTCGAGAACTCCTCCCTCTTCCAGAAGCACCCCGAGTACCGCACTGCCCTCACCGTTGCCTCCATCCCCGAGCGTGTCATTCAGTTCCGTGTTGTCTGGGAGGACGACAACGGCAACGTCCAGGTCAATCGCGGTTACCGTGTCCAGTTCAACTCCGCCCTCGGTCCCTACAAGGGTGGTCTCCGTCTCCACCCCTCCGTCAACCTTTCCATTCTCAAGTTCCTCGGTTTCGAGCAGATCTTCAAGAATGCCCTCACTGGCTTGAGCATGGGTGGTGGCAAGGGTGGTGCCGACTTCGACCCCAAGGGCAAGAGCGACGCTGAGATCCGTCGCTTCTGCTGCGCTTTCATGGCTGAGCTTCACAAGCACATTGGTGCCGATACCGATGTTCCCGCTGGTGACATCGGTGTTGGTGGCCGTGAGATCGGCTACATGTTCGGTGCCTACCGCAAGGCCGCGAACCGTTTCGAGGGTGTCCTTACTGGCAAGGGCCTCTCCTGGGGTGGTTCGCTCATTCGCCCTGAGGCCACTGGTTACGGCCTCGTCTACTACGTCGGCCACATGCTCGAGTACTCTGGCGCCGGATCCTACGCTGGCAAGCGCGTTGCCCTCTCCGGTTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCCGCCCTCAAGCTCATTGAGCTAGGCGCCACCGTTGTCTCCCTCTCCGACTCCAAGGGTGCTCTTGTCGCCACTGGCGAGTCCGGCATCACCGTTGAGGACATCAACGCCGTTATGGCCATCAAGGAGGCCCGTCAGTCCCTTACCAGCTTCCAGCACGCTGGTCACCTGAAGTGGATCGAGGGCGCCCGCCCCTGGCTTCACGTTGGCAAGGTTGACATCGCTCTTCCTTGCGCTACCCAGAACGAGGTCTCCAAGGAGGAGGCTGAGGGTCTCCTTGCCGCCGGCTGCAAGTTCGTCGCTGAGGGTTCCAACATGGGCTGCACTCTCGAGGCCATTGAGGTCTTTGAGAACCACCGCAAGGAGAAGAAGGGCGAGGCCGTCTGGTACGCCCCCGGCAAGGCCGCCAACTGTGGTGGTGTTGCCGTTTCCGGTCTCGAGATGGCTCAGAACAGCCAGCGCCTCAACTGGACTCAGGCTGAGGTTGACGAGAAGCTCAAGGACATCATGAAGAACGCCTTCTTCAACGGTCTCAACACTGCCAAGATCTACGTCGAGGCTGCTGAGGGCGAGCTTCCTTCCCTCGTTGCTGGCTCCAACATTGCTGGTTTCGTCAAGGTTGCCCAGGCCATGCACGACCAGGGTGACTGGTGGTCCAAGAACTAA
12.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶来自好食脉孢霉Neurospora sitophila(简称Ns)，它具有如下所示的氨基酸序列：MSNLPSEPEFEOAYKELAYTLENSSLFOKHPEYRTALAVASIPERVIOFRVVWEDDNGNVOVNRGYRVOFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEOIFKNALTGLSMGGGKGGADFDPKGKSDAEIRRFCCAFMAELHKHIGADTDVPAGDIGVGGREIGYMFGAYRKAANRFEGVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVGHMLEYSGAGSYAGKRVALSGSGNVAOYAALKLIELGATVVSLSDSKGALVATGESGITVEDINAIMAIKEAROSLTTFOHAGHVKWIEGARPWLHVGKVDIALPCATONEVSKEEAEGLLAAGCKFVAEGSNMGCTLEAIEVFENNRKEKKGEAVWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAONSORLNWTOAEVDEKLKDIMKNAFFNGLNTAKTYAEAAEGELPSLVAGSNIAGFVKVPOAMHDOGDWWSKN
13.按照权利要求12所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶基因具有以下的核苷酸序列：ATGTCTAACCTTCCCTCTGAGCCCGAGTTCGAGCAGGCCTACAAGGAGTTGGCCTACACTCTCGAGAACTCCTCCCTCTTCCAGAAGCACCCCGAGTACCGCACCGCCCTCGCCGTTGCCTCCATCCCCGAGCGTGTCATTCAGTTCCGTGTTGTCTGGGAGGACGACAACGGCAACGTCCAGGTCAACCGCGGTTACCGTGTCCAGTTCAACTCCGCCCTCGGTCCCTACAAGGGTGGTCTCCGTCTCCATCCCTCCGTCAACCTTTCCATTCTCAAGTTCCTCGGTTTCGAGCAGATCTTCAAGAATGCCCTTACTGGCCTGAGCATGGGTGGTGGCAAGGGTGGTGCCGACTTCGACCCCAAGGGCAAGAGCGATGCTGAGATCCGTCGCTTCTGCTGCGCTTTCATGGCCGAGCTTCACAAGCACATTGGTGCCGATACCGATGTTCCCGCTGGTGATATTGGTGTTGGTGGCCGCGAGATCGGTTACATGTTCGGTGCCTACCGCAAGGCTGCGAACCGTTTCGAGGGTGTCCTTACTGGTAAGGGCCTCTCCTGGGGTGGTTCGCTCATTCGCCCTGAGGCCACTGGTTACGGTCTCGTCTACTACGTCGGCCACATGCTCGAGTACTCTGGCGCCGGCTCCTACGCTGGCAAGCGCGTTGCCCTCTCTGGTTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCCGCCCTCAAGCTCATTGAGCTAGGCGCCACCGTTGTCTCCCTCTCCGACTCCAAGGGTGCCCTTGTCGCCACTGGCGAGTCCGGCATCACTGTTGAGGACATCAACGCCATCATGGCCATCAAGGAGGCCCGTCAGTCTCTTACCACCTTCCAGCACGCTGGCCACGTCAAGTGGATCGAGGGCGCCCGCCCCTGGCTTCACGTTGGCAAGGTTGACATCGCTCTTCCTTGCGCTACCCAGAACGAGGTCTCCAAGGAGGAGGCTGAGGGTCTCCTTGCCGCCGGCTGCAAGTTCGTCGCTGAGGGTTCCAACATGGGCTGCACTCTCGAGGCCATCGAGGTCTTTGAGAACAACCGCAAGGAGAAGAAGGGCGAGGCCGTCTGGTACGCCCCCGGCAAGGCCGCCAACTGTGGTGGTGTTGCCGTTTCCGGTCTCGAGATGGCTCAGAACAGCCAGCGCCTCAACTGGACTCAGGCTGAGGTTGACGAGAAGCTCAAGGACATCATGAAGAACGCCTTCTTCAACGGTCTCAACACTGCCAAGACCTACGCCGAGGCTGCTGAGGGCGAGCTTCCTTCCCTCGTTGCCGGCTCCAACATTGCTGGTTTCGTCAAGGTACCCCAGGCCATGCACGACCAGGGTGACTGGTGGTCCAAGAACTAA
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