WO2002002776A1

WO2002002776A1 - Procede permettant d'augmenter le taux d'assimilation de l'azote par les plantes

Info

Publication number: WO2002002776A1
Application number: PCT/CN2001/000294
Authority: WO
Inventors: Bo Tian; Fang Wang
Original assignee: Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences
Priority date: 2000-07-06
Filing date: 2001-02-27
Publication date: 2002-01-10
Also published as: CN1333349A; CN1137265C; AU2001246330A1

Description

一种提高植物氮素同化效率的方法技术领域

本发明涉及一种提高植物氮素同化效率的方法。

技术背景

氮素是植物生长所需的第一大营养元素。目前农业上所施用的氮肥仅有 30%-40% 被植物吸收利用，大部分都浪费。有一部分转化为硝酸盐流失到土壤中，造成环境污染。转 GDH的作物能有效增加植物氮素的吸收，提高氮肥利用率，从而可以节约氮肥的施用量，起经济效益是巨大的。同时， GDH广泛存在于动植物和微生物中，因此转 GDH的植物对人和动植物不会产生危害。

现在主要有美国、澳大利亚等国家进行谷氨酸脱氢酶转基因植物的研究（美国专利 N0.5955651 ; 5985634； 5998700)。它们的谷氨酸脱氢酶基因主要来源于小球藻和大肠杆菌，模式植物为烟草、玉米等经济作物。经研究发现，转谷氨酸脱氢酶基因的植物其氮素利用率有所提高，表现在植物叶片较大且数量较多。转大肠杆菌 GDH的植物不同组织的含氮量经测定比对照组多 16%左右，同时不同组织中氨基酸含量有所变化。较为显著的是，谷氨酸含量明显较低，而丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸等含量增加较大。转 GDH基因土豆的淀粉行量较对照组明显增多。但目前为止所使用的谷氨酸脱氢酶的活性多较低。

发明公幵 - 本发明的目的是提供一种提高植物氮素同化效率的方法。

为达到上述目的，本发明提供了一种提高植物氮素同化效率的方法，包括： (a) 将真菌谷氨酸脱氢酶（GDH) 基因与一种可在植物中引导外源基因表达的启动子相连，构建嵌合基因：（b) 将构建的嵌合基因导入植物细胞中，筛选并培养出被转化的植株。

在本发明的方法中，所述的可在植物中引导外源基因表达的启动子可以是任何一种现有技术中已知的可在植物中引导外源基因表达的启动子。所述的谷氨酸脱氢酶基因最好是辅基 NADP谷氨酸脱氢酶基因或辅基 NAD谷氨酸脱氢醵基因。所述的真菌谷氨酸脱氢酶基因可以来自丝状真菌的脉孢霉属真菌，包括中间脉孢霉、好食脉孢霉、粗糙脉孢霉。所述的谷氨酸脱氢酶基因也可以来自酵母真菌，例如啤酒酵母 Saccharomyces cerevisiae )。所述的谷氨酸脱氢酶基因还可以来自担子菌，例如双孢菇 garic bisporus )。所述的植物可以是烟草、玉米、棉花或水稻。

在本发明的方法中，所述的谷氨酸脱氢酶可以来自中间脉孢霉 Neurospora intermedia (简称 Ni)的谷氨酸脱氢酶，它具有 SEQ ID NO: 1 所示的序列。编码上述的谷氨酸脱氢酶的基因可以具有 SEQ ID NO: 2所示的序列。

本发明的方法中，所述的谷氨酸脱氢酶可以来自好食脉孢霉 Neurospora sitophila (简称 Ns)，它具有 SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。编码上述的谷氨酸脱氢酶基因可以具有 SEQ ID NO: 4所示的序列。

我们将 Ni-GDH, Ns-GDH, Nc-GDH三种脉孢霉属基因克隆进大肠杆菌 BL21 (DE3 ) 中进行诱导表达，纯化的 Ni-GDH, Ns-GDH, Nc-GDH进行酶活性测定，发现三种 GDH的酶活性高于其他属的脉抱霉。它对氨的亲和力和稳定性都较强。将这三种 GDH基因亚克隆到植物表达载体 pROKII中，通过农杆菌转化，电激法转化和花粉管通道法转化烟草、玉米、棉花等作物。经 PCR、 Southern, Northern和酶活性染色鉴定，筛选出 P8 '性转化子。将其移至不同氮浓度的培养基中，发现在低氮 5mM至更低的氨离子浓度下，表达 GDH的烟草都能正常生长，而未转化的对照组的叶片黄化，发育受阻，呈现缺氮症状。测定植物在低氮条件下的含氮总量及未利用氮残留量，发现转真菌 GDH植株的含氮量较未转化的高 20%以上，氮残留量减少 20— 30%。测定植株在贫氮土壤中的总氮量，结果较未转化植株高 40%左右。同时我们构建了转 GDH基因的玉米、水稻、棉花等经济作物，发现其含氮量较末转化作物高 20— 30%土壤中氮残留量减少 20%以上。检测表明， GDH在上述植物中得到了高表达，它加快了谷氨酸的氧化脱氨和 α—酮戊二酸（2— oxoglutarate)的还原氨基化作用，使植物中启动了一条新的氮利用途径，从而提高了氨的利用率。高等植物中虽也有 GDH，但其对氨的亲合力只有真菌 GDH的 1 / 10至 1 / 100, 故不能发挥同化氨的作用。真菌 GDH使谷氨酸的氧化脱氨伴随着大量 ATP的释放和 ct一酮戊二酸 (2— oxoglutarate)的形成，这给植物提供充足的能量和大量参与三羧酸循环的碳水化合物。氮素是植物生长所需的第一大营养元素，目前农业上所施用的氮肥仅有 30%— 40%为作物吸收利用，大部分都流失，造成环境污染。而转 GDH 的作物能够有效地提高氮素利用率，从而可以节约氮肥的利用量，减少环境污染，其经济效益是十分巨大。实施例实施例 1 . 脉孢霉属真菌、啤酒酵母和双孢菇的培养及其谷氨酸脱氢酶的诱导

1. 将三种真菌由固体斜面转于麦芽汁培养基中， 250转 /分钟摇床培养 48 小时离心收集菌丝体，转入氨诱导培养基 (4%葡萄糖， 0.02MNH4AC, 0.04M N05) 中诱导 3小时，离心收集菌丝体。

2. 总 R A的抽提和逆转录一聚合酶链式反 (RT— PCR方法扩增谷氨酸脱氢酶基因：诱导后的菌丝体经液氮研磨破碎后，采用异硫氰酸胍法抽提总 RNA进行逆转录一聚合酶链式反应。

所用引物如下：

引物 1： 5 ' GCTCAGAATGTCTAACCTTCCCTCTGAG 3 '

弓 1物 2: 5 ' GCGAGCTCTAGTCTTGGACCACCAGTCACC 3 '

逆转录反应条件是：

65 V 1分钟，

30°C 5分钟，

30°C— 65 °C 30分钟，

98 °C 5分钟，

5。C 5分钟。

聚合酶链式反应条件：

94 °C 3分钟， - 94 °C 1分钟

55Ό 1分钟 25个循环

72°C 2分钟

72 10分钟 3. 脉孢霉属谷氨酸脱氢酶 (GDH)基因序列测定：

将 RT— PCR方法扩增的谷氨酸脱氢酶 (GDH)基因经琼脂糖凝胶电泳回收。取 3微升 (ul)回收产物，加入 lul pGEM-T eas 载体， 5ul 2xT4连接酶缓冲液， lul DNA连接酶， 4' C酶连过夜。次日，将酶连产物转化大肠杆菌' DH50a进行菌落筛选。筛选方法釆用菌落 PCR和酶切鉴定，酶切位点为 Xbal、 Sacl。酶切产生 3.0kb和 1.4kb 两条带者为阳性克隆 pT— GDH。挑取阳性克隆，进行序列测定。 4. 啤酒酵母和双孢菇谷氨酸脱氢酶 (GDH)基因序列测定：

将 RT— PCR方法扩增的谷氨酸脱氢酶 (GDH)基因经琼脂糖凝胶电泳回收。取 3微升 (ul)回收产物，加入 lul pGEM-T easy 载体， 5ul 2xT4连接酶缓冲液， lul DNA连接酶， 4°C酶连过夜。次日，将酶连产物转化大肠杆菌 DH50a进行菌落筛选。筛选方法釆用菌落 PCR和酶切鉴定，酶切位点为 Xbal、 SacL 酶切产生 3.0kb和 1.4kb 两条带者为阳性克隆 pT— GDH。挑取阳性克隆，进行序列测定。

5. 脉孢霉、啤酒酵母和双孢菇谷氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达

载体 pT-GDH经 Xbal、 Sad酶切，琼脂糖电泳回收得到 GDH片段，与经同样酶切的 pBluescript载体在 4Ό酶连过夜。次日转化大肠杆菌 DH50a，经菌落 PCR和酶切鉴定阳性克隆 pBlueGDH。pBlueGDH经 ECoRV、SacI酶切,琼脂糖电泳回收得到 GDH 片段，与经同样 EcoRV、 Sad酶切的 pET30a载体在 12°C酶连过夜。次日转化大肠杆菌 DH50a，经菌落 PCR和酶切鉴定，阳性克隆为 pETGDH。次日，挑取阳性克隆，转化大肠杆菌 BL21(DE3)。培养至 OD0.4左右，经 ImM IPTG诱导 4hr,收获菌体。菌体经去离子水洗涤后，超声裂解。离心，上清和沉淀分别进行 10%SDS— PAGE 电泳。结果证明表达产物以为包涵体形式存在。

6. 金属整合亲和层析纯化谷氨酸脱氢酶 .

配制含 8M尿素的 MCAC— 0溶液中 (20mm/L Tris · CI， pH7.9, 0.5mol/L NaCl，

10%(v / v)甘油， ImmOl几 PMSF)。同时配制 MCAC— 40， MCAC— 60， MCAC —80, MCAC— 100， MCAC— 200 , MCAC— 500，即在 MCAC— 0 中分别添加 O.4mol/L、 0.6mol/L, O.8mol/L、 lmol/L、 2mol/K 5mol/L的咪唑。

将谷氨酸脱氢酶包涵体溶于含 8M尿素的 MCAC— 0溶液中，上样于 NTA 层析柱中，以 20— 30ml / h的流速用 5ml 8M Urea— MCAC缓冲液洗柱，弃流出液。以分段洗脱的方式依次用 5ml下列缓冲液洗柱， 8MUrea— MCAC40, 8M Urea— MCAC60 , 8M Urea-MCAC80, 8M Urea-MCACIOO , 8Μ Urea-MCAC200 , 8Μ Urea-MCAC500, 分别收集流出液，进行 10% SDS— PAGE电泳，银染进行纯度鉴定。收集 8M Urea "MCAC200以后的沈脱液，进行透析复性。透析缓冲液分两种，分别为 pH8.5和 pH7.4的 0.1mol/L Tris.HCl， lmM EDTA。 7. 谷氨酸脱氢酶活性测定

将透析过夜的复性蛋白离心，收集上清，经 280nm紫外检测测定蛋白浓度，浓度 (mg / ml)=A280 x 0.825 ο 在体系 Α、体系 C中分别测定酶活。

体系 A测定 GDH还原氨基化作用。

2.55ml 0.1MTris.HCl, ImMEDTA, pH7.4

0.1ml 0.1MNH4C1

0.15ml 0.2M a—酮戊二酸

0.2ml 0.15%(W / V)NADPH

2ul 复性蛋白， 25°C温育 10分钟，在 25。 C恒温下测定体系 A在 340nm光吸收值的变化。体系 C，测定 GDH氧化脱氨作用：

2.8ml 0.16M谷氨酸单钠盐溶于 0.1M Tris.HCl, ImM EDTA， pH 8.5的缓冲液中， 0.2ml 0.2%NADP, 2ul复性蛋白， 37°C温育 10分钟后，测定在 340mm光吸收值的变化。活性单位为每分钟还原每一微摩尔 NADP⁺为一单位或每分钟氧化每一微摩尔 NADPH为一单位。 - 结果测定为在体系 A中 Ni-GDH活性单位为 109.92U I mg,在体系 C中，为 Ni-GDH 为 72.93U / mg, Ns-GDH在体系 A中为 95.37U/mg,在体系 C 中为 63013U/mg, Nc-GDH在体系 A中为 100.25U/mg,在体系 C中为 65.00U/mg。 8. 脉孢霉谷氨酸脱氢酶基因亚克隆入植物表达载体 pROKII

从 pT— GDH载体上用 Xbal、 Saci双酶切将 GDH基因片段切下，经琼脂糖电泳回收后，与经同样酶切的 pROKII载体在 4。 C酶连过夜。次日转.化大肠杆菌 DH5a，经菌落 PCR和酶切鉴定阳性克隆 pROKII-GDH，挑选阳性克隆转化入农杆菌 LBA4404 中。 9. 啤酒酵母、双孢菇谷氨酸脱氢酶基因亚克隆入植物表达载体 pROKII

从 pT~GDH载体上用 Xbal、 Sad双酶切将 GDH基因片段切下，经琼脂糖电泳回收后，与经同样酶切的 pROKII载体在 4Ό酶连过夜。次日转化大肠杆菌 DH5a，经菌落 PCR和酶切鉴定阳性克隆 pROKII-GDH，挑选阳性克隆转化入农杆菌 LBA4404 中。

10. 根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草

(1) 烟草无菌苗的培养

将烟草种子表面消毒后培养在无激素的 MS培养基 (MS盐十 15g/L蔗糖十 8g/L 琼脂)上培养。 25-28Ό , 80uE(m². S)光照 16小时，随着小苗的生长 (1一 1.5个月以后)，将茎尖切下，转到新的 MS培养基生成小植株。

(2) 烟草叶盘共培养

含重组质粒的根癌农杆菌接种于 5ml含卡那霉素和利福平的培养基中， 28°C 200 转 /分摇床培养过夜，离心收集菌体。将无菌苗叶片边缘和中脉用手术刀切去，沿中脉垂直方向将叶片切成 5— 8mm宽的叶条，叶片切割后立即放入农杆菌液中浸泡 30-40分钟。用镊子取出共培养的叶片，放到无菌的滤纸上吸去过多的菌液，叶条移入含共培养培养基 (MS无机盐十 0.6mg 1 12， 4一 D十 30g / 1蔗糖十 8g 11琼脂) 的平皿中。用膜将平皿封口，以减少水分蒸发和污染。 28°C暗培养 48hr。

11. 转化植株的筛选 - 将共培养叶片转移到愈伤组织诱导培养基 (MS无机盐十 0.6mg 1 12,4-D十 300mg 1 1卡那霉素十 500mg / 1援节青霉素十 30g 1 1蔗糖十 8g 1 1琼脂)上，使转化叶片充分接触培养基有利于营养和激素的吸收，在愈伤组织诱导培养基上培养两周后，将叶片转移到芽培养基 (MS无机盐， lmg / 1 IAA十 lmg / 16— BA十 300mg I 1卡那霉素十 500mg 11羧苄青霉素十 30g 1 1蔗糖十 8g I 1琼脂)上培养。用解剖刀切下小芽转移到生根培养基 (MS无机盐十 0.4mg / 11BA十 lOOmg I 1卡那霉素十 30g 1 1 蔗糖十 8g / l琼脂)上培养。

12. 基因枪法转化玉米

将基因枪放置于一较大超净台中，以利于无菌操作。取 6ul包被 DNA的金属颗粒无水乙醇悬浮液 (约 0.6ug质粒和 0.37ug金属颗粒)点于微粒子载体中心，立即在干燥器中干燥，或在工作台上吹干。将欲转化的靶组织中铺在一个由液体培养基润湿过的 1-2层滤纸或含固体培养皿的 9cm培养皿中心，抽真空，当真空度达到所需值 (660 — 760mmHg, lmmHg=133, 322Pa)时，进行轰击，约 12秒钟打一枪。将轰击后的外植体转入愈伤组织诱导培养基或芽分化培养基， 28' C, 黑暗或弱光下培养，该培养基中不加入抗生素等筛选压力，过渡培养一般 1一 2周。过渡培养后的外植体在含适当卡那雷素的培养基上进行选择培养， 1个月左右转入继代扩繁培养基中培养。

13. 花粉管通道法介导真菌 GDH基因转化棉花

含 GDH基因的 pROKII— GDH载体溶于 1 X SSC溶液中，选择发育正常的花去雄，套袋隔离，授粉前一天将棉花花丝剪齐，在无菌培养皿中加入一薄层花粉萌发培养基，采集末萌发的新鲜花粉置于培养基中，在 3CTC条件下培养 3分钟左右，每 10ml 培养基中加入 30mm³花粉，当约 1 / 10的花粉已经萌发时，加入 1 / 10体积的 DNA 溶液小心混勾，与花粉混合后 DNA的终浓度为 5ug / ml, 将 DNA与花粉的混合液涂于柱头上，约 10mm³处理后的花粉授一个雌穗，授粉后重新套袋隔离至种子成熟。

14. 农杆菌介导的真菌 GDH基因转化水稻

含重组 GDH基因的根癌农杆菌接种于 5ml含卡那霉素和利福平液中， 28°C 200转 /分培养过夜，离心收集菌体，将无菌苗切割后立即放入农杆菌液中浸泡 30分钟，取出叶片，故到无菌的滤纸上吸去过多的菌液，转入共培养基中培养。 28°C暗培养 48hr。

15. 转真菌 GDH基因植物阳性转化子的筛选和鉴定

(1) 从植物中抽提 DNA方法

取 lg植物叶片，加液氮研磨成粉末。加入 700以 2xCTAB提取液 (2 %(W I V)CTAB (十六垸基三乙基溴化铵)， lOOmmol / lTris ' CI , pH8.0, 20mmol / L EDTA, 1.4mol / INaCI), 轻轻摇匀， 65°C水浴 30分钟，其间不时摇动。加入 700ul酚 /氯仿 /异戊醇 (25: 24： 1)，并轻摇至溶液呈乳化状态， 7000转 /分离心 5分钟。取上清液继续用酚 /氯仿 /异戊醇 (25: 24： 1)抽提 2-3次，加 2倍体积无水乙醇， .混匀于一 20 °C沉淀过夜。 7000转 /分离心 10分钟，收集核酸沉淀，溶于去离子水中。 -20°C贮存备用。 (2) 核酸杂交法鉴定阳性转化子

将抽提的植物总 DNA酶切过夜，酶切位点为 Xbal, Sad, 次日进行琼脂糖凝胶电泳。将 DNA片段从凝胶电泳中转移至尼龙膜上，紫外照射 3分钟使 DNA片段固定。将用地高辛 (DIG)标记好的探针与尼龙膜上固定的 DNA进行杂交，杂交温度 68V , 时间 20小时。杂交完成后，清洗尼龙膜，和抗地高辛的碱性磷酸酶 (anti DIG 一 AP)反应 30分钟，清洗后进行 NBT I BCIP显色。

结果，在 1400bp左右位置出现一条杂交带，和阳性对照相同，表明 GDH基因已经整合入植物基因组中。

16. 转化植株的移栽和后代分析

小心移去植株根部的琼脂，将植株转移至含 MS无机盐溶液的较大容器里，将盖子打开，使气体扩散几小时，同时加入一些无菌水以补充蒸发的液体，之后把植株移栽到湿润的土壤里。所结种子以核酸杂交和 GDH酶活染色测定后代分离，直至获得纯合的转基因品系。

17. 凝胶分析和谷氢酸脱氢酶活性染色

在液氨中研磨，提取植株叶片蛋白，进行 5%非变性凝胶电泳， i20V72 小时。将凝胶浸泡在下述染色液中（50mMTrispH9.3 , 8mg / ml 谷氨酸， 0.04mg I ml NADP, 0.04mg / ml MTT, 0.04mg / ml硫酸的吩咳， 0.08mg /-mICaC12)。凝胶在染色液中浸泡后，在含 GDH的部位有一条带，表明转化的 GDH在植株体内表达出有活性谷氨酸脱氢酶。

18. 转基因植株的生长和氮素利用率测试 - 表达真菌 GDH阳性植物收获种子后，进行无菌苗的繁殖 (同 8(1))。随着小苗的生长，将茎尖切下，转到不同氮含量的 MS培养基上。氨的浓度分别为 20mM, 10mM, 5m , 2.5mM, 以测试其生长状况。结果，在 20mM， 10mM的 MS培养基上，阳性转化子和对照组后代未显出明显区别。在 5mM和 2.5mM培养基上，阳性转化子生长状况显著优于对照组，而对照则出现叶片萎黄等缺氮症状。等植物生长 1一 1.5 个月后，将植株清洁干净，烘干，测试干重。结果显示，阳性转化子比对照组干重增加 20%左右。同时利用凯氏定氮法，测得转基因植株的含氮率比对照组增加 20— 30%左右。同时测定生长在 MS培养基中植物的氮素利用率，转化植株较未转化植物的氮素利用率提高 20-30%左右。

序列表

<110> Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences <120>一种提高植物氮素同化效率的方法

<160> 4

<210>SEQID O: 1

<211>454氨基酸

<212>蛋白质

<213> 中间脉孢霉 Neurospora intermedia

<400>

ELPSLVAGSNIAGFV VAQAMHDQGDWWSKN

<210>SEQIDNO:2

<211> 1365碱基对

<212> DNA

<213> 中间脉孢霉 Neurospora intermedia

<400>

AGGGTGACTGGTGGTCCAAGAACTAA

<210>SEQIDNO:3

<211>454氨基酸

<212>蛋白质

<213>好食脉抱霉 Neurospora sitophila

<400>

MSNLPSEPEFEQAY ELAYTLENSSLFQ HPEYRTALAVASIPERVIQFRWWEDDNGNVQ GELPSLVAGSNIAGFVKVPQAMHDQGDWWSKN

<210>SEQID O:4

<211> 1365碱基对

<212> DNA

<213>好食脉抱霉 Neurospora sitophila <400>

ει

WIDWOW。。工 0。工 SD OVDiDOS

^6J00/10N3/X3d 9 0 OAV

Claims

权利要求

1 . 一种提高植物氮素同化效率的方法，包括：（a)将真菌谷氨酸脱氢酶（GDH) 基因与一种可在植物中引导外源基因表达的启动子相连，构建嵌合基因：（b )将构建的嵌合基因导入植物细胞中，筛选并培养出被转化的植株。

2.按照权利要求 1所述的方法，其中，所述的真菌谷氨酸脱氢酶基因是辅基 NADP 谷氨酸脱氢酶基因或辅基 NAD谷氨酸脱氢酶基因。

3. 按照权利要求 1所述的方法，其中，所述的真菌谷氨酸脱氢酶基因来自丝状真菌的脉孢霉属真菌。

4. 按照权利要求 3所述的方法，其中，所述的丝状真菌的脉孢霉属真菌包括中间脉孢霉、好食脉孢霉、粗糙脉孢霉。

5. 按照权利要求 1所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶基因来自酵母真菌。

6.按照权利要求 5所述的方法，其中

cerevisiae )。

7. 按照权利要求 1所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶基因来自担子菌。

8 . 按照权利要求 7 所述的方法，其中，所述的担子菌是双孢菇〔Ag_a,'i_CUS bisporus )。

9. 按照权利要求 1所述的方法，其中，所述的植物是烟草、玉米、棉花或水稻。

10. 按照权利要求 1 所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶来自中间脉孢霉 Neurospora intermedia的谷氨酸脱氢酶，它具有 SEQ ID NO: 1所示的序列。

11.按照权利要求 10所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶的基因具有 SEQ ID NO.- 2所示的序列。

12. 按照权利要求 1 所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶来自好食脉孢霉 Neurospora sitophila, 它具有 SEQ ID NO: 3所示的序列。

13. 按照权利要求 12所述的方法，其中，所述的谷氨酸脱氢酶基因具有 SEQ ID NO: 4所示的序列。