KR101238259B1 - 담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시키는 ａｄｈ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시키는 ａｄｈ 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 담수 환경에서 종자 발아가 증진되는 식물체 및 이의 종자, 식물 유래의 ADH 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 ADH 유전자를 과발현시켜 담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법 및 식물 유래의 ADH 유전자를 포함하는 담수 환경에서 식물체의 종자 발아 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시키는 ＡＤＨ 유전자 및 이의 용도{ADH gene increasing seed germination of plant at anaerobic condition and uses thereof}
본 발명은 담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시키는 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 담수 환경에서 종자 발아가 증진되는 식물체 및 이의 종자, 식물 유래의 ADH 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 ADH 유전자를 과발현시켜 담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법 및 식물 유래의 ADH 유전자를 포함하는 담수 환경에서 식물체의 종자 발아 증진용 조성물에 관한 것이다.
벼 (Oryza sativa)는 세계에서 가장 중요한 작물로 세계인구의 50% 이상이 쌀을 주식으로 삼고 있다. 벼는 온대에서 열대기후까지 광범위한 지역에서 재배되고 있으나 계속적인 세계 인구의 증가와 급격한 기후 변화 때문에 공급량이 부족한 실정이다.
25% 이상의 벼가 담수 상태에서 재배되고 있으며 논이나 깊은 물과 같은 침수 상태에 대해 어느 정도의 내성을 가지고 있다. 이는 식물의 뿌리 부분에 있는 aerial 부분으로부터 효율적인 산소의 이동이 가능하기 때문에 침수 상태에서도 잘 적응하는 것으로 생각된다. 그러나 문제는 식물체가 완전히 잠겼을 때 발생한다. 홍수는 예상하기 어렵고 작물 생육시 어떤 시기에도 발생할 수 있기 때문에 벼 재배시에는 다양한 생육 시기에 따라 지속적으로 침수 피해를 입을 수 있다. 가스의 이동은 공기보다 물에서 10,000배 어렵다. 따라서 벼가 침수기간 동안 산소의 부분적 (hypoxia) 또는 완전한 (anoxia) 부족은 벼의 생육과 생존에 영향을 줄 수 있다. 에틸렌의 확산 감소와 산소와 이산화탄소 공급 감소는 광합성 등 호흡 작용을 제한할 수 있으며 벼 식물의 생육과 증식에 부정적인 영향을 줄 수 있다.
식물은 그들 스스로 이동을 할 수 없기 때문에 anaerobiosis은 환경적인 스트레스에 대항하기 위한 하나의 방법으로 낮은 산소 공급 상태에서 짧은 기간이나마 생존하기 위한 적응 메카니즘을 가지고 있다. 옥수수, 밀, 보리, 수수 등을 포함한 대부분의 식량작물에서 침수 피해를 줄이기 위한 형질전환체가 개발되었다.
고등식물은 대부분 호기성 생물로 토양이 과습한 상태에서 산소의 공급이 감소되기 때문에 빠르게 죽는다 (Voesenek et al., 2006, New Phytol. 170:213-226). 그러나 과습한 환경에서 유래된 종은 침수 스트레스에 적응할 수 있는 능력을 가지고 있다. 토양이 물에 완전히 포화된 상태에서도 몇 주 동안 완전한 생육이 가능하며 지속적으로 성장하고 꽃과 종자의 생산도 가능하다. 내습성 식물은 일반적으로 산소가 없는 상태에서도 ATP의 생산이 가능하며 산소의 효율적인 흡수를 위한 특별한 형태적 특성을 발달시킨다 (Jackson, 1985, Annu Rev Plant Physiol. 36:145-174).
알코올 탈수소효소 (ADH)는 혐기성 발효 경로에 포함되어 있으며 모든 진핵생물과 일부 원핵생물의 기관에 존재하는 효소이다. ADH는 혐기성 단백질의 하나로 에탄올에서 피루베이트의 감소를 야기하여 계속적인 NAD+를 생산한다. ADH 활성은 혐기성 조건하에서 식물이 생존하기 위해 필수적 요소로 여겨진다 (Johnson et al., 1994, Plant Physiol. 105:61-67). ADH 활성은 과습한 상태에서 증가되기 때문에 ADH 유전자의 과발현은 침수 상태에서 벼가 생존하기 위해 매우 유용할 것이다. 여기서는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 형질전환 기법을 이용하였다. Biolostic을 이용한 방법과 naked DNA 삽입 방법은 많이 이용되고 있으나 염기서열의 재배열과 high copy 수의 삽입 등이 일반적으로 발생하며 사일런싱이나 다른 여러 가지 문제들로 인해 안정적인 유전자의 발현이 어렵다. 그리하여, 아그로박테리움 튜머파시엔스를 이용한 형질전환법이 벼를 비롯한 다른 단자엽 작물에서도 일반적으로 많이 이용되고 있다 (Dong et al., 1995, Proceedings of the Third International Rice Genetics Symposium, Manila (Philippines):IRRI).
1. 아그로박테리움을 이용한 형질전환
벼를 비롯한 다른 농업적으로 중요한 단자엽 작물을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜이나 전기천공법 (Shimamoto et al., 1989, Nature. 238:274-276) 또는 biolistic (Christou et al., 1991, Bio/Technology. 9:957-962)에 의한 naked DNA의 직접적은 도입을 통한 형질전환방법은 여러 번 보고되었다. 그러나 DNA의 직접도입에 의한 형질전환방법은 여러 개의 유전자 조각이나 재배열된 유전자의 조각이 삽입되는 경우가 빈번하며 단일 조각이나 재배열이 일어나지 않은 염기서열이 삽입되는 경우는 매우 드물다. 이런 현상 때문에 종종 목적하는 유전자의 발현 패턴이 상이하거나 불안정한 세대 증식과 목적 유전자가 다음 세대로 유전되지 않는 현상이 발생하기도 한다 (Xu et al., 1995, Plant Mol. Biol. 27:237-248). 유전자를 직접 도입하는 방법과 달리 아그로박테리움을 이용한 형질전환은 DNA의 재배열이 일어나지 않고 낮은 copy 수로 유전자가 도입이 되어 더 나은 형질전환 결과를 얻을 수 있다.
벼 (Jeon et al., 2000, Plant J. 22, 561-570), 밀, 옥수수 (Ritchie et al., 1993, Trans Res. 2:252-265), 보리 (Tingay et al., 1997, Plant J. 11:1369-1376), 수수 등과 같이 농업적으로 중요한 식량작물을 이용한 효율적인 형질전환방법은 많이 발달되어 있고 일반적으로 이용된다. 단자엽식물에서 식물 유전자형, 배양시 이용되는 조직, 아그로박테리움 균주, 벡터 등 아그로박테리움을 이용한 형질전환시에 영향을 주는 많이 요인들이 조사되고 실험되었다. 뿐만 아니라 다양한 접종방법과 co-culture 조건의 중요성도 알려져 있다. 형질전환을 수해함에 있어서 많은 방법들이 개선되었으나, 벼에 새로운 유전자를 도입하여 형질전환체를 얻기까지는 약 3개월이라는 긴 시간이 요구된다 (Jeon et al., 2000, Plant J.22,561-570). 그러나, 최근 벼의 캘러스를 이용하지 않고 배반조직을 이용하여 이른 시기에 새로운 유전자를 감염시키는 새로운 방법이 성공적으로 수행되었다 (Toki et al., 2006, Plant J. 47:969-976). 따라서 본 연구실에서 확립된 벼의 단기 형질전환 시스템을 이용하여 벼의 캘러스에 형질전환하였다.
2. 혐기성 스트레스
침수와 담수시에는 가스 특히 산소가 공기중에서 보다 물에서 10,000배 늦게 이동하기 때문에 대기와 식물 조직 사이의 가스교환을 감소시키는 결과를 야기한다 (Armstrong, 1979, Advances in Botanical Research. 7:225-332). 침수시에는 식물의 뿌리 주변이 부분적이거나 완전한 혐기 상태가 되기 때문에 식물에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 산소는 세포의 entral energy-providing pathway 내에서 매우 중요한 역할을 하고 있으며 산소의 유무에 따라 대사 활성이나 에너지 생산에 영향을 미칠 수 있다. 산소는 NADH로부터 NAD+ cofactor를 생산하는 산화 인산화 경로에서 전자 수용체로 알려져 있다. 식물이 침수 상태에서 에탄올, 젖산, 그리고 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 비롯한 글루타메이트, 피루베이트로부터 알라닌을 생산하는 식물 특이적 생합성 경로를 포함하는 세가지 주요한 발효 경로가 작동하는 것으로 알려져 있다. 식물체내에서 이 발효 경로는 일반적으로 산소가 공급되는 상황에서는 작동하지 않다가 낮은 산소 조건이 되면 빠르게 생합성이 일어난다고 알려져 있으며 이는 낮은 산소 조건하에 식물이 살아남을 수 있는 생존 메카니즘으로 보고되어진다 (Dennis et al., 2000, J Exp Bot. 51:89-97).
3. 알코올 탈수소효소
알코올 탈수소효소는 알코올에서 수소를 이탈시켜 알데하이드 또는 케톤을 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소이다. 일반적인 호기성 조건에서 뿌리 세포에 있는 탄수화물은 해당과정, TCA 사이클, 산화 인산화과정을 통해 이산화탄소와 물로 분해된다. 식물은 이 과정을 통해 에너지를 발생시킨다 (6 mole ATP/mole 글루코스). 산소의 농도가 감소되면 식물의 뿌리세포는 호기성에서 혐기성 대사로 전환을 하며 피루베이트 대분분이 알코올 발효 NAD+로 전환되며 ATP의 총량이 감소하는 결과를 초래한다 (2 mole ATP/mole 글루코스; Roberts et al., 1984, Proc Nat Acad Sci USA. 81:33791-3383). 알코올 발효의 단계는 피루베이트 디카르복실라아제와 알코올 탈수소효소에 의해 변화된다. 이 효소는 에탄올을 포함하여 독성 중간산물인 아세트알데히드를 통하여 피루베이트를 전환하는 역할을 한다.
ADH 발현은 조직 특이적으로 일어난다. 일반적으로 ADH 유전자의 발현은 종자(cotyledon and primary root)와 화분뿐만 아니라 식물의 뿌리에서 우세하게 발현되며, 반대로 대부분의 식물의 공기중으로 나와있는 녹색 조직에서 약한 발현을 보인다 (Freeling and Bennett, 1985, Ann Rev Genet. 19:297-323). ADH 유전자 활성은 애기장대 (Chang et al., 1986, Proc Natl Acad Sci USA. 83:1408-1412), 보리, 옥수수, 완두, 기장, 해바라기, 밀 (Gottlieb, 1982, Science. 216(4544):373-380) 등 많은 식물체에서 관찰되었다. ADH 활성은 anaerobiosis 조건에 반응하여 파종 후 6일이 지난 벼 식물체의 다양한 조직에서 나타났다. 이미 보고된 논문에 따르면 Anarobiosis 조건에서 84시간이 지났을 때 처리 전에 비해 식물의 뿌리, 생육중인 배, 유묘의 잎, 성숙한 녹색 잎에서 모두 10배 이상 높은 ADH 활성이 나타났다. 그러나 같은 기간 동안 배유의 ADH 활성은 단지 3배만 증가하는 것으로 나타났다 (Xie and Wu, 1989, Plant Mol Bio. 13:53-68). ADH 활성은 혐기성 처리를 한 후 6시간이 지났을 때 급격히 증가되었고 120 시간 동안 지속적으로 활성이 증가한다고 보고되었다 (Xie and Wu, 1989, Plant Mol Bio. 13:53-68). 또한, anaerobiosis하에서 ADH mRNA 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 이런 결과는 ADH 효소가 전사 수준에서 조절이 됨을 나타낸다 (Xie and Wu, 1989, Plant Mol Bio. 13:53-68).
4. 혐기성 발아
농작물 사이에 벼는 매우 낮은 산소 조건 (Perata et al., 1997, Ann Bot. 79:49-56) 심지어 진공 조건 (Alpi and Beevers, 1983, Plant Physiol. 7:30-34)에서도 발아 능력을 가지고 있으며 생육이 가능하다. 이는 벼가 발효 경로에 의해 생산된 에너지를 이용하기 때문에 질소 상태에서도 발아가 가능한 것으로 보고되고 있다 (Cobb et al., 1987, Plant Cell Environ. 10: 633-638). 이와는 달리 다른 식물의 종자 (오이, 옥수수, 밀 등)는 산소가 부족한 상황에서는 발아가 되지 않는다 (Vartapetian et al., 1978, Plant Sci Lett. 13:321-328). 질소 대기 상태에서 발아된 벼 종자는 21일 이상 생육이 가능했으며 RNA와 단백질의 합성도 충분한 것으로 나타났다 (Mocquot et al., 1981, Plant Phy.siology. 68: 636-640).
내습성 작물은 산소가 없는 상태에서도 ATP 활성이 가능하며 산소를 받아들이는 능력을 향상시키기 위해 특별한 형태적 특징을 가지고 있는 것으로 보고되었다 (Jackson, 1985, Annu Rev Plant Physiol. 36:145-174). 벼는 전체 식물체가 완전히 물에 잠긴 상태에서도 며칠간 생육이 가능하기 때문에 침수 저항성을 나타내는 것으로 생각된다.
한국특허공개 제2005-87340호에는 신나밀 알콜 탈수소화 효소 기능을 가지는 폴리펩티드, 그 폴리펩티드 및 이들의 용도가 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 연구하던 중, 배추 유래의 ADH 유전자를 벼에 형질전환시킴으로써, 형질전환된 벼가 담수 환경에서 종자 발아가 증진됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 담수 환경에서 종자 발아가 증진되는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 식물 유래의 ADH 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 ADH 유전자를 과발현시켜 담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 식물 유래의 ADH 유전자를 포함하는 담수 환경에서 식물체의 종자 발아 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 배추 유래의 ADH 유전자로 형질전환된 벼는 담수 환경에서 종자 발아가 증진된다. 따라서, ADH 유전자로 형질전환 벼는 식량 작물의 침수 피해를 줄이는데 크게 기여할 것으로 기대된다.
도 1은 아그로박테리움 매개 형질전환을 통해 FL-cDNA의 도입을 보여준다. (A) 캘러스 형성; (B) 접종; (C) 하이그로마이신을 이용한 캘러스 선발; (D), (E) 및 (F) 신초 형성 및 신장; (G) 뿌리 형성 및 신장; (H) 순화; (I) 온실에 이식 및 생장.
도 2는 온실 토양에서 키운 T0 형질전환 식물의 생장을 보여준다.
도 3은 HPT-Fw 및 HPT-Rv 프라이머를 이용한 형질전환체 (T0 세대)의 genomic PCR 분석 결과이다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동하고, 밴드를 UV 광하에 에티디움 브로마이드를 이용하여 관찰하였다.
도 4는 pBigs_SfiI-Fw 및 pBigs_SfiI-Rv 프라이머를 이용한 형질전환체 (T0 세대)의 genomic PCR 분석 결과이다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동하고, 밴드를 UV 광하에 에티디움 브로마이드를 이용하여 관찰하였다.
도 5는 HPT-Fw 및 HPT-Rv 프라이머를 이용한 형질전환체 (T1 세대)의 genomic PCR 분석 결과이다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동하고, 밴드를 UV 광하에 에티디움 브로마이드를 이용하여 관찰하였다.
도 6은 pBigs_SfiI-Fw 및 pBigs_SfiI-Rv 프라이머를 이용한 형질전환체 (T1 세대)의 genomic PCR 분석 결과이다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동하고, 밴드를 UV 광하에 에티디움 브로마이드를 이용하여 관찰하였다.
도 7은 T1 형질전환 벼 식물체에서 유전자 발현 결과이다. 상단 패널은 도입된 알코올 탈수소효소 FL-cDNA의 발현 수준을 보여주며, 하단 패널은 로딩양 조절을 위해 사용된 내부 액틴을 보여준다. WT, 야생형; T1, T2, 형질전환 벼 식물체.
도 8은 무산소 조건(anoxia condition) 하에 형질전환 벼 식물체 및 야생형인 고품벼에서 ADH 유전자의 발현을 보여준다. 상단 패널은 상이한 시간대(0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 h)에 혐기성 스트레스하에 ADH 유전자의 발현 수준을 보여주며, 하단 패널은 로딩양 조절을 위해 사용된 내부 액틴을 보여준다. WT, 야생형; T1, 형질전환 벼 식물체.
도 9는 혐기성 조건하에 6일된 뿌리로부터 분리된 형질전환 벼 및 고품벼 ADH 활성을 보여준다. mg 단백질당 ADH 효소의 유닛은 분석 동안 NADH의 증가로부터 계산하였다.
도 10은 혐기성 조건하에 6일된 황화된 신초로부터 분리된 형질전환 벼 및 고품벼 ADH 활성을 보여준다. mg 단백질당 ADH 효소의 유닛은 분석 동안 NADH의 증가로부터 계산하였다.
도 11은 혐기적으로 발아된 6일된 형질전환 벼 및 고품벼 유묘의 신초 신장을 보여준다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 담수 환경에서 종자 발아가 증진되는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명에서, 배추 유래의 ADH 유전자로 형질전환된 벼는 담수 환경에서 종자 발아가 증진됨을 알 수 있었다 (도 11 참고).
상기 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자는 배추, 애기장대, 보리, 옥수수, 완두, 기장, 해바라기, 밀 등의 유래일 수 있으며, 바람직하게는 배추(Brassica rapa) 유래일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, ADH 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 식물 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 HvNHX1 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(하이그로마이신), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(아그로박테리움 tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 벼이다.
본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 종자는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물의 종자일 수 있으며, 가장 바람직하게는 벼의 종자이다.
본 발명은 또한, 식물 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 ADH 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법을 제공한다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 벼이다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명의 담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법에서, 상기 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자는 배추, 애기장대, 보리, 옥수수, 완두, 기장, 해바라기, 밀 등의 유래일 수 있으며, 바람직하게는 배추(Brassica rapa) 유래일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 벼이다.
본 발명은 또한, 식물 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하는 담수 환경에서 식물체의 종자 발아 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자는 배추, 애기장대, 보리, 옥수수, 완두, 기장, 해바라기, 밀 등의 유래일 수 있으며, 바람직하게는 배추(Brassica rapa) 유래일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 벼이다.
본 발명의 식물체의 종자 발아 증진용 조성물은 유효 성분으로서 식물 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하며, 상기 ADH 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1. 기능 관련 유전자를 이용한 변이체 육성
배추로부터 만들어진 465개의 완전장 cDNA를 식물 형질전환용 벡터에 재조합체를 구축하였고 완전장 cDNA 염기서열 정보를 토대로 유전자를 기능별로 분류하였고, 분류된 유전자를 본 연구실에서 확립된 벼의 형질전환 시스템을 이용하여 벼의 캘러스에 형질전환 하였다.
(1) 형질전환체 육성
고품벼 완숙종자의 종피를 제거한 다음 70% 에탄올 및 2.5% sodium hypochlorite 용액으로 살균한 다음 멸균수로 5회 세척하였다. 살균한 벼 종자를 N6D (0.4% Gelrite) 고체 배지에 치상한 후에 32℃ 지속 광 조건에서 1-2일 동안 배양하였다. 아그로박테리움 감염 및 형질전환 식물체의 선발은 BR 유전자를 포함하는 아그로박테리움 균주를 50 mg/1 카나마이신 설페이트가 포함된 AB 배지 (1.5% agar 배지)에서 28℃ 암 조건에서 3일간 배양한 다음, 아그로박테리움 한 loop를 긁어서 AAM 배지에 희석하여 OD600가 0.5이 되게 하였다. 앞에서 전 배양한 벼 종자를 아그로박테리움 희석용액에 넣고 1.5 분 동안 접종한 다음 멸균한 필터페이퍼 위에 종자를 올려놓아 여분의 아그로박테리움을 제거하였다. 그 다음에 멸균된 필터페이퍼(직경 9cm)를 2N6-AS 배지 (0.4% Gelrite) 위에 올려놓고 접종한 종자를 치상한 다음 25℃ 암 조건에서 3일간 공동 배양하였다. 3일간 공동 배양한 종자를 멸균수로 5회 세척하고 아그로박테리움을 제거하기 위해 500 mg/1 카베니실린이 포함된 멸균수로 1회 더 세척한 다음 멸균된 필터페이퍼로 간단히 수분을 제거하여 50 mg/1 하이그로마이신과 400 mg/1 카베니실린이 포함된 N6D 배지에 옮겨 32℃ 지속 광 조건으로 2주 동안 배양하였다. 배반으로부터 왕성하게 증식하는 캘러스를 RE-III 배지로 옮겨 식물체의 재분화를 유도하였다. 지상부가 재분화된 식물체를 HF 배지로 옮겨 뿌리의 발생을 유도하였으며 순화된 벼 형질전환 식물체를 온실에서 포트에 이식하여 재배하였다.
(2) DNA 분리 및 PCR에 의한 유전자 도입 분석
온실에서 포트에 이식하여 재배한 재분화 벼 식물체로부터 잎을 채취하여 그로부터 변형된 Tai (1990, Plant Molecular Biology Reporter 8: 297-303)의 DNA 추출방법을 사용하여 분리하였다. 벼 형질전환체에서 유전자의 도입 확인을 위한 PCR 분석은 선발 마커인 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT) 유전자의 증폭을 위하여 HPT-Fw primer GGA TTT CGG CTC CAA CAA TGT CCT GAC GGA(서열번호 2)와 HPT-Rv primer CTT CTA CAC AGC CAT CGG TCC AGA(서열번호 3)를 사용하여 분석하였고, 도입된 Brassica rapa L.(배추)의 FL-cDNA는 pBigs_SfiI-F primer 5'-TAT TCG GAG AGG GTA CGT ATT TTT AC-3'(서열번호 4)와 pBigs_SfiI-R primer 5'-GCA ACA GGA TTC AAT CTT AAG AAA CT-3'(서열번호 5)를 사용하여 유전자의 도입 여부를 분석하였다. 상기에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 94℃에서 5분, 94℃에서 30초간 변성, 50~60℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분 30초간 연장을 1회 주기로 하여 35주기 동안 반응시킨 후에 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 통하여 도입유전자의 존재를 확인하였다.
(3) RNA 분리 및 RT-PCR 분석
벼 이삭을 이용하여 Guanidine 방법 (Chirgwin 등 1979, Biochemistry 18: 5294)으로 전 RNA를 추출한 후 oligo(dT)-칼럼에 의해 poly(A+) RNA를 조제하였다. PCR 반응에 사용한 주형은 mRNA를 역전사 반응시켜 cDNA로 만든 다음 이 cDNA를 주형 DNA로 하여, RT-PCR (reverse transcription PCR) 분석을 실시하였다. 먼저 조제한 mRNA를 25℃에서 10분간 미리 반응을 실시한 후 42℃에서 30분간 역전사 반응시켰다. 99℃에서 5분간 다른 효소의 활성을 제거하고, 합성한 cDNA를 주형으로 하여 95℃에서 1분간 hot step, 95℃에서 1분간 변성, 55℃에서 2분간 어닐링, 72℃에서 4분간 연장의 과정을 1 사이클로 하여 35회 PCR 반응을 실시하였고, 1.5% 아가로스 겔 상에서 증폭된 밴드를 확인하였다.
2. 알코올 탈수소효소 유전자 활성 및 발현
(1) 벼 재배 조건
고품벼와 형질전환 벼 종자를 1% sodium hypochlorite를 이용하여 2시간 동안 소독한 후 증류수로 세척한 후 하루 동안 증류수에 침지하여 28~32℃ 온도에서 암 상태로 발아를 유도하였다. 침종 6일 후 유묘를 혐기성 유도를 위해 사용하였고 ADH 활성 분석과 RNA 발현을 위해 이용하였다.
(2) 혐기성 유도
Tris-HCL (pH 8.0)을 증류를 통해 공기를 제거한 후, 차갑게 식힌 후 N2 gas를 이용하여 30분 동안 지속적으로 공급하였다. 6일된 유묘를 10mM Tris-HCl (pH 8.0)안에 넣은 후 알루미늄 호일을 이용하여 빛과 산소를 차단하고 10분 동안 N2 gas를 공급한 후 N2 gas가 가득한 백 안에 넣어 혐기성을 유도하였다.
(3) ADH 활성 분석
처리 후 12시간 마다 bottle에서 유묘를 취해 줄기와 뿌리로 구분하여 실험에 이용하였다. 조직을 분쇄한 후 1ml grinding buffer를 넣어 4℃에서 10분간 반응시킨 후 원심분리하여 상층액을 취해 ADH 활성을 측정하였다.
실시예 1. 기능 관련 유전자를 이용한 변이체 육성
본 발명은 Brassica rapa L.(배추)의 완전장 cDNA를 벼에 도입하여 형질전환 벼를 육성하여 도입 유전자의 기능을 밝히고 우수 육종계통 또는 품종을 육성하고자 하는 목적으로 연구를 수행하였다. 배추로부터 일차로 획득한 465개의 완전장 cDNA의 염기서열을 토대로 Blast 검색을 한 결과 예상되는 다양한 기능의 유전자의 분류가 가능하였으며 이 중 알코올 탈수소효소 유전자를 과발현시켜 기능을 밝히고자 하였다.
(1) 알코올 탈수소효소 과발현 형질전환체 육성
기능 관련 유전자의 대량변이체 육성을 위하여 Brassica rapa (배추)의 알코올 탈수소효소 유전자의 완전장 cDNA를 고품벼의 발아 초기 종자에 아그로박테리움을 이용하여 형질전환하였다 (도 1 및 도 2). 지금까지 사용되어오던 장기 형질전환방법을 개선하여 종자에 재조합 유전자가 포함된 아그로박테리움을 접종 후 40~50일에 재분화 벼 식물체를 획득함으로써 기내 체세포 돌연변이를 최소화한 단기간 형질전환 체계를 확립하여 연구를 수행하였다. 벼 종자 발아 초기에 접종을 하는 것은 형질전환된 캘러스를 선발하기 쉽고, 오랜기간 배양을 하면 생길 수 있는 체세포 변이를 감소시키는 효과를 나타냈다. 접종 후 증식된 캘러스는 하이그로마이신이 포함된 배지에서 공배양을 하였고, 선발 배지에서 세포의 증식이 관찰되었다. 마커 유전자로 사용된 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt)이 포함되지 않은 조직은 생존하지 않는 것을 확인하였다.
(2) 벼 형질전환체에서 유전자 도입 확인
형질전환 후 선발된 하이그로마이신 저항성 식물은 온실에서 생육하고 증식하였다. 총 58개의 형질전환 식물체를 실험에 이용하였다. BR 유전자의 형질전환 벼에 대하여 유전자의 도입 여부를 조사하기 위하여 온실 및 격리포장에서 생육중인 벼 식물체로부터 잎을 채취하여 CTAB법에 의하여 DNA를 분리하였고, 이 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 분석은 선발 마커인 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT) 유전자의 증폭을 위하여 HPT-Fw primer GGA TTT CGG CTC CAA CAA TGT CCT GAC GGA(서열번호 2)와 HPT-Rv primer CTT CTA CAC AGC CAT CGG TCC AGA(서열번호 3)를 사용하여 분석하였고 도입된 Brassica rapa L.(배추)의 FL-cDNA는 pBigs_SfiI-F primer 5'-TAT TCG GAG AGG GTA CGT ATT TTT AC-3'(서열번호 4)와 pBigs_SfiI-R primer 5'-GCA ACA GGA TTC AAT CTT AAG AAA CT-3'(서열번호 5)를 사용하여 유전자의 도입 여부를 분석하였다.
실험 결과, 58개의 T0 식물체 중 57개의 형질전환체에서 HPT 유전자가 존재하였고 이중 35개의 식물체에서 pBigs_SfiI 유전자가 도입되었음을 확인하였다. (도 3, 4). 알코올 탈수소효소의 완전장 cDNA의 1 kb 크기임을 확인하였으며, HPT와 pBigs_SfiI 유전자는 단일 밴드로 관찰되었다. PCR로 유전자의 도입 여부를 확인하여 HPT와 pBigs_SfiI 유전자가 모두 증폭된 형질전환체의 종자를 이용하여 세대를 증식하였고, 이 중 9개의 형질전환 식물체가 성공적으로 발아하여 포장에 이식한 후 실험에 이용하였다. 포장에 이식 후 형질전환 여부를 다시 확인하고자 HPT와 pBigs_SfiI의 프라이머를 이용하여 PCR 분석한 결과 9개 형질전환체 모두 HPT가 도입되었음을 확인하였으나 그 중 8개의 형질전환 식물체에서만 pBigs_SfiI의 도입이 확인되었다 (도 5, 6).
(3) 유전자 발현
형질전환 후 야생형과 형질전환 식물체의 유전자 발현의 차이를 비교하고자 genomic PCR을 통해 유전자 도입이 확인된 식물체를 선발하여 실험에 이용하였다. 알코올 탈수소효소 유전자의 발현을 알아보고자 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 반 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 형질전환 식물체에서 알코올 탈수소효소 유전자는 야생형과 비교하여 높게 발현되었다 (도 7).
실시예 2. 알코올 탈수소효소 유전자 활성 및 발현
(1) Anaerobiosis하에서 알코올 탈수소효소 발현
ADH의 발현에 미치는 anaerobiosis의 효과를 알아보고자, 6일된 유묘에 anoxia를 처리한 후 매 12시간 후에 total RNA를 추출하였다. 알코올 탈수소효소-특이적 프라이머를 이용한 반 정량적 RT-PCR을 이용하여 발현 정도를 측정하였다. ADH 유전자의 발현은 처리 시간이 지날수록 증가하는 결과를 나타냈으며 야생형에 비해 형질전환 식물체에서 발현이 높게 나타났다 (도 8).
(2) Anaerobiosis 처리시 벼의 기관에 따른 ADH 활성 분석
Anaerobiosis 조건하에서 형질전환 식물체의 기관에 따른 ADH 활성을 분석하고자 발아 후 6일된 유묘를 이용하여 혐기성 조건을 만들어 실험을 수행하였다. ADH 활성은 줄기와 뿌리에서 모두 혐기성 조건하에서 빠르게 반응함을 알 수 있었다. 혐기성 처리 12시간 후 줄기와 뿌리에서 ADH 활성이 급격히 증가하여 처리 72시간 후까지 계속적으로 증가되었다. 처리 72시간 후에는 줄기와 뿌리에서 모두 처리 전에 비해 ADH 활성이 10배 이상 증가하였다. 또한, 동일 조건하에서 뿌리에서의 ADH 활성이 줄기에 비해 높게 나타났다 (도 9, 10).
형질전환 식물체는 야생형으로 이용된 고품벼에 비해 줄기와 뿌리에서 모두 높은 ADH 활성을 나타내었다. ADH 활성 측정 결과는 형질전환체와 고품벼의 RT-PCR 결과와 일치하는 것을 알 수 있다.
(3) 혐기성 발아 분석
혐기성 처리 6일 후 형질전환 식물체와 야생형 모두 대부분 생존하는 것을 확인하였다 (표 1). 혐기성 발아 실험을 통해 뿌리 생육은 정지하고 줄기의 생육 또한 감소하는 것을 알 수 있었다 (표 2, 도 11). 줄기 생육의 대부분은 2일과 4일에 일어나는데 실험 결과 6일까지 생육이 증가하는 결과를 보였고 이 결과를 통해 벼는 혐기성 상태에서도 발아가 됨을 알 수 있다. 또한, 야생형에 비해 형질전환 식물체가 혐기성 상태에서 더 높은 생존율을 나타냈으며 일부 형질전환 개체는 혐기성 조건에 적응력이 높음을 알 수 있었다.
혐기성 처리 6일 후 형질전환 벼와 고품벼 유묘의 생존능
Sample
 Seedling survival (%)
N2에 2일 N2에 6일
13584 100 96
13585 100 96
13586 100 95
13587 100 95
13588 100 97
13589 100 98
Gopumbyeo 100 94
2일 및 4일 무산소(anoxia) 처리 기간 동안 6일된 형질전환 벼 및 고품벼 유묘의 성장
Sample Day Shoot length (mm)
13584

 0 -
2 3
6 17
13585

 0 -
2 4
6 18
13586

 0 -
2 3
6 17
13587

 0 -
2 4
6 17
13588

 0 -
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Gopumbyeo

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<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> ADH gene increasing seed germination of plant at anaerobic condition and uses thereof <130> PN10257 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1137 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 atgtctacga ccggacaaat cattcgatgc aaagctgccg tttgctggga agctggaaag 60 ccactagtga tggaggaagt ggaggttgct ccaccgcaga agcatgaagt tcgtatcaag 120 attctcttca cttctctctg tcacactgat gtttacttct gggaagctaa gggacaaacg 180 cctttgtttc cacgtatctt cggacatgaa gctggaggat tgtggagagt gttggagaag 240 gagtaactga tctccaccag gagaccacgt cctccccatc ttcaccggag aatgcggaga 300 ctgccctcac tgccactccg aggagtccaa catgtgcgac cttctcagga tcaacaccga 360 gagaggaggg atgatacacg acggcgaatc gagattctcc atcaacggca aaccgatcca 420 ccatttcctt gggacctcaa cgtttagcga gtacaccgtg gtccactctg gtcaagtcgc 480 taagatcaac cctgaagctc ctcttgacaa agtctgcatc gtcagctgtg gcttgtccac 540 tgggcttgga gctactttga atgttgctaa gcccaagaaa ggtcagagcg ttgctatctt 600 cggtcttggc gctgttggat tggctgctgc ggaaggtgct aggattgctg gtgctggtag 660 gatcattggt gttgatctta accccaagag attcgaggaa gtaagaagtt cggtgtgacg 720 gagtttgtga accctaagga acatgacaag ccagttcagg aagtcatcgc tgagatgact 780 aacggcggtg tggacaggag tgtggagtgc actggaagca ttcaagccat gattcaagcc 840 tttgaatgtg ttcacgatgg ctggggtgtg gcggtgctgg ttggtgtgcc gagcaaagac 900 gatgccttca agactcatcc gatgaacctt ctgaacgaga ggacactcaa gggtactttc 960 tttggcaact acaaacccaa aaccgacatt cccggggtgg tcgaaaagta catgaacaag 1020 gagctggagc ttgagaagtt cattactcac acagtgccat tctctgagat caacaaggcc 1080 tttgattaca tgttaaaagg agagagtatc cgttgcatca tcaccatggg tgcttga 1137 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPT-Fw primer <400> 2 ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga 30 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPT-Rv primer <400> 3 cttctacaca gccatcggtc caga 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBigs_SfiI-F primer <400> 4 tattcggaga gggtacgtat ttttac 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBigs_SfiI-R primer <400> 5 gcaacaggat tcaatcttaa gaaact 26

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 배추(Brassica rapa) 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 담수 환경에서 종자 발아가 증진되는 벼 식물체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 따른 식물체의 종자.
  6. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 배추(Brassica rapa) 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 ADH 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 담수 환경에서 벼 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 배추(Brassica rapa) 유래의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 포함하는 담수 환경에서 벼 식물체의 종자 발아 증진용 조성물.
KR1020100111869A 2009-11-11 2010-11-11 담수 환경에서 식물체의 종자 발아를 증진시키는 ａｄｈ 유전자 및 이의 용도 KR101238259B1 (ko)

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