KR101603250B1

KR101603250B1 - 침수 조건에서 종자 발아를 증진시키는 ＯｓＮＦＹ４ 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101603250B1
Application number: KR1020130139127A
Authority: KR
Inventors: 윤인선; 김둘이; 김범기; 황효주; 허선미
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2016-03-15
Also published as: KR20150056293A

Abstract

본 발명은 침수 조건에서 식물의 종자 발아를 증진하는 OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 OsNFY4 유전자를 과발현시키는 벡터로 형질전환된 식물체의 종자는 침수 환경에서 종자 발아가 증진되므로 직파재배 등의 종자 발아가 환경에 따라 큰 영향을 받는 불량 환경 조건에서 종자의 발아가 증진되어 작물의 생산성을 높일 수 있으므로 기후 변화에 따라 늘어나는 침수피해에 대응할 수 있는 재해저항성 작물로써 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

Description

침수 조건에서 종자 발아를 증진시키는 ＯｓＮＦＹ４ 유전자 및 이의 용도{OsNFY4 gene which enhancing plant seed germination in waterlogging condition and uses thereof}

본 발명은 침수 조건에서 식물의 종자 발아를 증진하는 OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 과발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제작하는 기술에 관한 것이다.

벼(Oryza sativa)는 세계에서 가장 중요한 작물로 세계인구의 50% 이상이 쌀을 주식으로 삼고 있다. 벼는 온대에서 열대기후까지 광범위한 지역에서 재배되고 있으나 계속적인 세계 인구의 증가와 급격한 기후 변화 때문에 공급량이 부족한 실정이다.

25% 이상의 벼가 담수 상태에서 재배되고 있으며 논이나 깊은 물과 같은 침수 상태에 대해 어느 정도의 내성을 가지고 있다. 이는 식물의 뿌리 부분에 있는 공기 뿌리(aerial root) 부분으로부터 효율적인 산소의 이동이 가능하기 때문에 침수 상태에서도 잘 적응하는 것으로 생각된다. 그러나 문제는 식물체가 완전히 잠겼을 때 발생한다. 홍수는 예상하기 어렵고 작물 생육시 어떤 시기에도 발생할 수 있기 때문에 벼 재배시에는 다양한 생육 시기에 따라 지속적으로 침수 피해를 입을 수 있다. 가스의 이동은 공기보다 물에서 10,000배 어렵다. 따라서 벼가 침수기간 동안 산소의 부분적(hypoxia) 또는 완전한(anoxia) 부족은 벼의 생육과 생존에 영향을 줄 수 있다. 에틸렌의 확산 감소와 산소와 이산화탄소 공급 감소는 광합성 등 호흡 작용을 제한할 수 있으며 벼 식물의 생육과 증식에 부정적인 영향을 줄 수 있다.

식물은 그들 스스로 이동을 할 수 없기 때문에 혐기성 생활(anaerobiosis)은 환경적인 스트레스에 대항하기 위한 하나의 방법으로 낮은 산소 공급 상태에서 짧은 기간이나마 생존하기 위한 적응 가지고 있다. 옥수수, 밀, 보리, 수수 등을 포함한 대부분의 식량작물에서 침수 피해를 줄이기 위한 형질전환체가 개발되고 있다.

최근에는 동남아에서 재배되는 아열대벼인 부도(浮滔, deepwater rice)를 연구하여 침수저항성 유전자가 밝혀졌다. 부도는 동남아 지역에서 우기에 재배지에 물이 차도 벼 마디가 빨리 자라 잎이 물 위로 올라와서 생장하고 이삭을 맺는 인디카 계열 아열대 벼다. 부도에는 비로 인해 재배지가 침수될 경우 장기간 침수에도 오랫동안 생존할 수 있도록 하는 침수 저항성 유전자인 'Sub1A'와 신속하게 마디 생장을 촉진시켜 벼가 물에 잠기지 않게 하는 침수 회피성 유전자인 'Snorkel1', 'Snorkel2' 등 침수 적응성 유전자 3종을 보유하고 있는 것으로 나타났다. 이에 따라 이들 유용 유전자를 우리나라 벼처럼 침수저항성이 없는 자포니카 계열 벼에 도입하여 벼 직파재배에 활용할 수 있으며, 지구 온난화에 의해 점차 증가하는 침수피해를 줄이고 안정적인 쌀 생산을 위한 새로운 품종 육성에 이용할 수 있다.

야생 벼와 달리 대부분의 현대 재배 벼는 종자 발아와 초기 유묘생장기의 침수스트레스에 매우 민감하다. 따라서 침수지에서 물에 잠긴 종자가 더 빨리 발아하고 자엽초 생장을 촉진하여 유묘가 물에 잠기지 않도록 하는 특성은 직파재배 단계의 침수저항성을 증진시키는데 매우 중요한 농업형질이다.

이에, 본 발명자들은 저온, 염해 등 스트레스 조건에서 발아하는 종자의 새로운 유전자를 연구하던 중에 스트레스 조건에서 발현이 억제되는 전사인자 OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4)를 찾아내었고, OsNFY4 유전자를 이용하여 침수 환경에서 종자 발아가 증진되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa L.)에서 유래의 OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자로부터 유추되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼에서 유래의 OsNFY4 유전자를 과발현시키는 벡터로 형질전환된 침수 조건에서 종자 발아가 증진되는 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsNFY4 유전자 과발현 식물체의 종자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자가 과발현되는 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 침수 조건에서 종자 발아를 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 침수 조건에서 종자 발아가 증진되는 식물체의 종자를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa L.)에서 유래의 OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자로부터 유추되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼에서 유래의 OsNFY4 유전자를 과발현시키는 벡터로 형질전환된 침수 조건에서 종자 발아가 증진되는 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsNFY4 유전자 과발현 식물체의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼에서 유래의 OsNFY4 유전자를 과발현시키는 벡터를 제작하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 제작된 벡터를 식물체에 도입하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 제작된 식물체에서 OsNFY4 유전자가 과발현되는 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 침수 조건에서 종자 발아를 증진시키는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 침수 조건에서 종자 발아가 증진되는 식물체의 종자를 제공한다.

본 발명의 OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) 유전자를 과발현시키는 벡터로 형질전환된 식물체의 종자는 침수 환경에서 종자 발아가 증진되는 것을 확인하였다. OsNFY4 유전자 과발현 식물체의 종자는 직파재배 등의 종자 발아가 환경에 따라 큰 영향을 받는 불량 환경 조건에서 종자의 발아가 증진되어 작물의 생산성을 높일 수 있으므로 기후 변화에 따라 늘어나는 침수피해에 대응할 수 있는 재해저항성 작물로써 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

도 1은 벼 종자에 저온, 염해 및 환경스트레스 호르몬(ABA)를 처리하여 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다:
(A) 스트레스 조건에서 벼 종자발아 억제 양상; (B) 스트레스 조건에서 24시간 발아 종자에서 OsNFY4 유전자 발현 비교(microarray 분석) FC(fold change, 스트레스 처리군/대조군).
도 2는 벼 조직별 OsNFY4 유전자 발현 분석(RT-PCR)한 결과를 나타낸 도이다: 1, 캘루스; 2, 건조 종자; 3, 발아후 24시간 종자; 4, 종자의 배(embryo); 5, 줄기; 6, 황화조직의 줄기; 7, 뿌리.
도 3은 OsNFY4 유전자의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 4는 OsNFY4 유전자가 코드하는 단백질의 전사촉진 활성 및 세포 내 발현 위치 분석한 결과를 나타낸 도이다: (A) SD-T(X-a-GAL) 배지에서 효모 (AH109/pBDOsNFY4)의 발색반응; (B) 양파 표피세포에서 OsNFY4-GFP 단백질의 세포내 발현 위치.
도 5는 OsNFY4 식물 과발현 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 6은 OsNFY4 과발현 형질전환 벼에서 도입 유전자 발현 확인(RT-PCR) 형질전환 벼(1-5, 3-12, 3-19); 야생형 벼(대조군 동진벼); Hgh(하이그로마이신); 인산전달효소(phosphotransferase) 유전자.
도 7은 OsNFY4 과발현 형질전환 벼 종자의 침수 발아를 비교한 결과를 나타낸 도이다: (A) 종자 침수후 4일째 발아 표현형 비교 사진; (B) 종자 침수후 4일 째 자엽초 길이 비교; WT(DJ), 야생형 벼(동진); NFY4 (#1-5, #3-12), OsNFY4 과발현 형질전환벼 T2 동질계통.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa L.)에서 유래의 OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) 유전자를 제공한다.

상기 유전자는 종자(seed)에서 주로 발현되고, 염해 조건에서 발아가 억제된 종자에서 현저하게 발현이 억제되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다.

또한, 상기 염기서열의 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 유전자로부터 유추되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공한다.

상기 재조합 벡터에는 OsNFY4 유전자 상시 발현할 수 있도록 칼리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터의 하류에 연결할 수 있을 수 있으며, 더욱 바람직하게는 도 5에 기재된 pGA2897-OsNFY4일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 식물체는 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa/Brassica campestris)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 벼인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: gt4?, -Charon, z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타 제초제에 대한 내성 유전자가 있다.

상기 종자는 침수 환경에서 종자의 발아가 증진된다.

또한, 본 발명은

상기 단계 2)의 식물체는 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa/Brassica campestris)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 벼인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

아울러, 상기 방법으로 제조된 침수 조건에서 종자 발아가 증진되는 식물체의 종자를 제공한다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주), 식물세포 및 식물체 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물체이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 아그로박테리움-매개 형질 감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 한정하지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1> OsNFY4 유전자 선발 및 발현분석

<1-1> OsNFY4 유전자 선발

벼의 종자 발아는 저온, 염해 등 환경스트레스 조건 및 스트레스호르몬인 ABA 처리에 의해서 현저히 억제된다(도 1A). 상기 스트레스 조건에서 24시간 발아종자의 유전자발현 프로파일링을 마이크로어레이(microarray) 방법으로 분석하였다. 마이크로어레이 분석데이터로부터 염해 조건에서 발아하는 종자에서 유전자 발현이 2배 이상 억제되는 NFY(Nuclear Factor Y)계열 전사인자로 OsNFY4(Os02g49410)를 선발하였다(도 1B).

<1-2> OsNFY4 유전자 발현 분석

OsNFY4 유전자가 벼의 각 조직에서 어떤 발현 특징을 보이는지를 RT-PCR 방법을 통해 분석하였다.

구체적으로, 동진벼의 성숙 종자, 발아 종자의 배, 유묘의 줄기와 뿌리, 캘러스로부터 각각 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 5 ㎍에서 Oligo(dT)12-18 프라이머를 이용해 Reverse Transcriptase(Superscript III, Invitrogen)로 50℃에서 1시간 반응하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 희석하여 PCR 반응에 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 4분 변성 후 변성(denaturation): 94℃, 40sec, 어닐링(annealing): 60℃, 40sec, 신장(extension): 72℃, 40sec 과정을 30회 반복 후 72℃ 10분 진행 후 반응을 마무리하였다. 하기 표 1에 나타난 OsNFY4 유전자 특이 프라이머를 RT-PCR 분석에 사용하였다.

그 결과, OsNFY4 유전자 전사체가 벼의 줄기와 뿌리에서는 발현되지 않고 주로 종자에서 발현된다는 것을 확인하였다(도 2).

서열번호	이름	서열
3	OsNFY4-1	5'-CAGGTCATTGAGACTTGAGAGAGC-3'
4	OsNFY4-3	5'-CATAGCCATATCCATAGCCATAGC-3'

< 실시예 2> OsNFY4 유전자 클로닝

OsNFY4 완전장(full cDNA) 유전자를 클로닝하기 위하여 동진벼 성숙종자에서 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 5 ㎍에서 Oligo(dT)12-18 프라이머를 이용해 Reverse Transcriptase(Superscript III, Invitrogen)로 50℃에서 1시간 반응하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 희석하여 PCR 반응에 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 4분 변성 후 변성(denaturation): 94℃, 40sec, 어닐링(annealing): 60℃, 40sec, 신장(extension): 72℃, 40sec 과정을 40회 반복 후 72 10분 진행 후 반응을 마무리하였다. 하기 표 2에 나타난 OsNFY4 유전자 특이 프라이머를 RT-PCR 분석에 사용하였다.

그 결과, RT-PCR 방법으로 증폭된 유전자를 TA 벡터(pGEMT-Easy, Promega)에 클로닝하고 전체 염기서열을 확인 후 염기서열을 서열번호 1로 결정하였다(도 3).

서열번호	이름	서열
3	OsNFY4-1	5'-CAGGTCATTGAGACTTGAGAGAGC-3'
5	OsNFY4-2	5'-GATATGGCTATGGAAAAAATATGTGA-3'

< 실시예 3> OsNFY4 유전자가 코드하는 단백질의 전사촉진 활성 및 세포 내 발현 위치 분석

<3-1> OsNFY4 유전자가 코드하는 단백질의 전사촉진 활성 분석

OsNFY4 유전자가 코드하는 단백질의 전사촉진 활성을 분석하기 위하여 효모 GAL4 시스템을 이용하였다.

구체적으로, OsNFY4 유전자의 ORF를 pBDGAL4(Stratagene) 벡터에 삽입한 융합 플라스미드를 제작하여 효모 균주(AH109, Clontech)에 도입하였다. 도입 균주를 X-a-GAL을 포함하는 SD-T 배지에서 배양하여 리포터인 베타갈락토시다아제 효소 활성을 분석하였다.

그 결과, OsNFY4가 GAL4DNA 결합부위에 붙어서 리포터 유전자 발현을 증가시키는 전사촉진 활성 기능이 있음을 규명하였다(도 4A).

<3-2> OsNFY4 유전자가 코드하는 단백질의 세포 내 발현 위치 분석

OsNFY4 유전자가 코드하는 단백질의 세포 내 발현 위치 분석하기 위하여 유전자 총법(Biolistic Bambardment)을 이용하였다.

구체적으로, OsNFY4가 코드하는 단백질이 세포 내 어느 위치에서 발현되는지를 확인하기 위하여 OsNFY4 단백질의 C 말단에 형광단백질 smGFP가 연결된 재조합 DNA를 35S 프로모터의 하류에 삽입한 식물발현 벡터를 제작하였다. 먼저 OsNFY4 단백질의 종료 코돈을 제거한 ORF를 BamHI을 포함하는 하기 표 3에 나타낸 한 쌍의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다.

서열번호	이름	서열
6	OsNFY4GFP-1	5'-GTCCGGATCCATGGCAGGGAACAAAAAGC-3'
7	OsNFY4GFP-2	5'-GCTCGGATCCTCATATTTTTTCCATAGCC-3'

증폭된 DNA 단편을 BamHI으로 절단한 후 하이그로마이신 저항성을 가지는 pCAMBIA1300 유래의 식물발현 벡터의 35S 프로모터와 형광단백질 유전자 smGFP 사이의 Bam HI site에 삽입된 식물 발현 벡터를 제작하였다.

상기 제작한 OsNFY4-smGFP 식물발현 벡터의 플라스미드를 금 입자 표면에 입힌 후 유전자 총(particle delivery system; PDS2000, BioRad)을 이용하여 양파 표피세포에 도입하였다. 도입 2일 후 형광 현미경을 이용하여 세포내 형광단백질의 분포를 관찰한 결과, OsNFY4가 핵에서만 분포하는 단백질임을 증명하였다(도 4B).

< 실시예 4> OsNFY4 유전자 과발현 형질전환 벼 제작

<4-1> OsNFY4 유전자 과발현 식물발현 벡터 제작

OsNFY4 유전자를 식물에 발현시키기 위한 벡터를 Gateway 방법을 이용하여 제작하였다. 이를 위하여 donor vector(pDONOR221)의 attachment site(att B1 & B2)을 포함하는 하기 표 4에 나타낸 한쌍의 프라이머를 제작하여 PCR 증폭하였다. PCR 증폭 산물과 pDONOR221을 BP Clonase(Invitrogen)를 이용하여 재조합시킨 entry clone을 제작하였다. 염기서열을 확인한 entry 클론을 LR Clonase II enzyme mix(Invitrogen)로 다시 pGA2897 벡터에 재조합하여 식물발현 벡터를 완성하였다(도 5).

서열번호	이름	서열
8	OsNFY4-attB1	5'-AAAAAGCAGGCTCGATGGCAGGGAACAAAA-3'
9	OsNFY4-attB2	5'-AGAAAGCTGGGTGTCACATATTTTTTCCAT-3'

<4-2> OsNFY4 유전자 과발현 형질전환 벼 제작

상기 실시예 4-1의 벡터를 이용하여 아그로박테리움(LBA4404)에 형질전환하였다.

구체적으로, 벼 형질전환을 위하여 동진 벼의 종자를 2N6 배지에서 치상한 후 27℃에서 3-4주간 암배양하여 캘러스를 유도하였다. 형질전환 유전자를 포함하는 아그로박테리움을 AB 액체배지에 배양한 후 배형성 캘러스와 20분간 공배양(coculture) 시킨 후 3일간 암배양 하였다. 아그로박테리움을 제거한 캘러스를 하이그로마이신(hygromycin, 30 ㎍/L)을 포함하는 배지에서 암배양하여 형질전환 캘루스를 선발하였다. 캘러스에서 슈팅(shooting) 유도를 위해 하이그로마이신이 첨가된 MSR 배지(Duchefa MS 배지에 말토스와 솔비톨 첨가)에 옮겨 4주간 양 배양하여 슈팅된 후 발근이 되면 온실로 옮기기 이전에 순화처리를 실시하였다. 순화처리한 식물체는 온실에 옮겨 생육하였다.

<4-3> 형질전환 벼에서 OsNFY4 유전자 발현 양상 분석

상기 실시예 4-2에서 선발한 OsNFY4 과발현 형질전환 벼에서 도입한 유전자가 과다 발현되고 있는지를 확인하기 위하여 형질전환 벼의 종자를 하이그로마이신(30 ㎍/L) 포함 배지에서 10일간 키운 유묘에서 트리졸(Trizol, Invitrogen) 방법으로 RNA를 분리하였다. 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 RT-PCR 분석을 수행하였다.

그 결과, 형질전환 벼가 대조군(동진벼)에 비해 OsNFY4 전사체가 높은 수준으로 발현되고 있음을 증명하였다(도 6).

<실시예 5> OsNFY4 과발현 형질전환 벼의 표현형 분석

OsNFY4 유전자 과발현이 확인된 형질전환 벼의 T2 동질 계통 종자를 완전 침수시킨 후 시간에 따라 자엽초의 생장 속도를 측정하였다.

그 결과, 야생형(WT)인 동진벼에 비해 OsNFY4 유전자 과발현이 확인된 형질전환 벼에서 자엽초의 신장이 현저하게 빠른 특성을 보인다는 것을 확인하였다(도 7).

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> OsNFY4 gene which enhancing plant seed germination in waterlogging condition and uses thereof <130> P131201 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 585 <212> DNA <213> OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) <400> 1 caggtcattg agacttgaga gagcatggca gggaacaaga agcgtggtgg caggaacatg 60 gatcaggtca agaaggcggc agtgagatcg gatggggtgg gaggtagtgc gaccaacgcc 120 gagctgccga tggccaacct cgtacgcctg ataaagaagg tgctcccagg gaaagcgaag 180 atcgggggag cagccaaggg tctcacccat gattgcgcgg tggagttcgt cgggttcgtc 240 ggcgacgagg cctccgagaa ggccaaggca gagcaccgcc gcaccgtagc gccggaagac 300 tacttgggct cattcggcga ccttggcttc gatcgctacg tcgaccccat ggatgcctac 360 atccatggtt accgtgagtt tgagagggct ggtgggaata ggagggtggc gccgcctcct 420 ccggcggcag ctacaccgct gacgcccggt ggaccgacat tcactgacgc agagctgcag 480 tttctccggt cggtgatccc ctccagaagt gatgatgaat atagcggctc atcaccagcc 540 ataggcggct atggctatgg atatggctat ggaaaaaata tgtga 585 <210> 2 <211> 186 <212> PRT <213> OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) amino acid <400> 2 Met Ala Gly Asn Lys Lys Arg Gly Gly Arg Asn Met Asp Gln Val Lys 1 5 10 15 Lys Ala Ala Val Arg Ser Asp Gly Val Gly Gly Ser Ala Thr Asn Ala 20 25 30 Glu Leu Pro Met Ala Asn Leu Val Arg Leu Ile Lys Lys Val Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Ala Lys Ile Gly Gly Ala Ala Lys Gly Leu Thr His Asp Cys 50 55 60 Ala Val Glu Phe Val Gly Phe Val Gly Asp Glu Ala Ser Glu Lys Ala 65 70 75 80 Lys Ala Glu His Arg Arg Thr Val Ala Pro Glu Asp Tyr Leu Gly Ser 85 90 95 Phe Gly Asp Leu Gly Phe Asp Arg Tyr Val Asp Pro Met Asp Ala Tyr 100 105 110 Ile His Gly Tyr Arg Glu Phe Glu Arg Ala Gly Gly Asn Arg Arg Val 115 120 125 Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Thr Pro Leu Thr Pro Gly Gly Pro 130 135 140 Thr Phe Thr Asp Ala Glu Leu Gln Phe Leu Arg Ser Val Ile Pro Ser 145 150 155 160 Arg Ser Asp Asp Glu Tyr Ser Gly Ser Ser Pro Ala Ile Gly Gly Tyr 165 170 175 Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Lys Asn Met 180 185 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY4-1 primer <400> 3 caggtcattg agacttgaga gagc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY4-3 primer <400> 4 catagccata tccatagcca tagc 24 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY4-2 primer <400> 5 gatatggcta tggaaaaaat atgtga 26 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY4GFP-1 primer <400> 6 gtccggatcc atggcaggga acaaaaagc 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY4GFP-2 primer <400> 7 gctcggatcc tcatattttt tccatagcc 29 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY4-attB1 primer <400> 8 aaaaagcagg ctcgatggca gggaacaaaa 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY4-attB2 primer <400> 9 agaaagctgg gtgtcacata ttttttccat 30

Claims

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서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼에서 유래의 OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) 유전자를 과발현시키는 벡터로 형질전환된 침수 환경에서 종자 발아가 증진되는 식물체.
제 4항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 애기장대, 담배, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa/Brassica campestris)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 침수 환경에서 종자 발아가 증진되는 식물체.
제 4항에 따른 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) 유전자 과발현 식물체의 형질전환된 종자.
1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼에서 유래의 OsNFY4(Oryza sativa Nuclear Factor Y4) 유전자를 과발현시키는 벡터를 제작하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제작된 벡터를 식물체에 도입하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 제작된 식물체에서 OsNFY4 유전자가 과발현되는 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 침수 환경에서 종자 발아를 증진시키는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 식물체는 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa/Brassica campestris)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 침수 환경에서 종자 발아를 증진시키는 방법.
제 7항의 방법으로 제조된 침수 환경에서 종자 발아가 증진되는 식물체의 형질전환된 종자.