KR20230109899A

KR20230109899A - 종자발아를 조절하는 OsMYB1 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230109899A
Application number: KR1020220005710A
Authority: KR
Inventors: 윤인선; 박성임; 조미현; 송지선; 정지영; 김경환; 박상렬; 서은정
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-07-21

Abstract

본 개시는 벼 유래 OsMYB1 유전자 편집을 통한 작물의 종자발아 조절에 관한 것이다.
본 개시에 따른, OsMYB1 유전자 편집용 가이드 RNA는 OsMYB1 유전자의 표적서열에 변이를 유도하여 종자 발아율을 증대시킬 수 있다. 본 개시에 따른 OsMYB1 유전자 편집용 가이드 RNA, 이 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제를 포함하는 벡터를 이용하여 종자 휴면, 종자 발아를 조절함으로써 작물의 생산량을 개선할 수 있다.

Description

종자발아를 조절하는 OsMYB1 유전자 및 이의 용도{OsMYB1 gene regulating seed germination and use thereof}

본 개시는 벼 유래 OsMYB1 유전자 편집을 통한 작물의 종자발아 조절에 관한 것이다.

식물의 종자는 식물의 증식 수단으로써 우리 인류에게는 중요한 식량원 중의 하나이다. 종자는 대개 환경 스트레스에 대해 뛰어난 내성을 가지고 있어서 극한의 환경을 극복할 수 있으므로 식물체의 증식과 종족보존을 가능하게 한다. 종자는 일단 식물체의 성장에 적절한 환경을 접하게 되면 물을 흡수하고 발아하게 되며, 그 결과로 식물체는 새로운 삶을 시작하게 된다. 적어도 지난 50년 동안 종자의 효용(seed performance)을 향상시킬 수 있는 방법, 특별히 종자의 발아를 향상시키는 것과 묘종(seedling)을 확립하는 것에 대해서 관심을 가져왔다. 종자를 뿌리기 전에 여러 가지 조건들을 조절해서 발아과정을 시작하거나 종결시키는 처리를 하는 것은 실제적인 몇 가지 이점을 가지고 있는데, 특별히 발아가 동시에 일어나고(synchronized) 촉진되는(accelerated) 상황에서 그러하다. 발아가 동시에 일어나서 동일한(uniform) 개체군의 묘종을 빨리 확립하면 작물이 잡초와 싸울 수 있는 능력이 향상되고, 작물의 동일함(uniformity)이 향상된 개체군을 포함하므로 수확할 때 추가적인 경제적 이점이 있는 등의 장점이 있다.

또한, 종자를 뿌린 후 발아가 빨리 되면 껍질이 벗겨진 상태를 빨리 안정화시키게 되므로 침식(erosion)을 줄일 수 있으며, 뿌린 종자가 감염에 노출되는 것을 줄일 수 있고, 아울러 종자의 발아를 촉진함으로써 영농에 소요되는 기간을 단축할 수 있다는 큰 장점이 있다.

한편, 유전자 편집(gene editing)은 원하는 염기서열을 인식하여 절단하도록 만들어지는 인공제한효소로 동물 또는 식물 세포내에서 정확히 원하는 유전체 염기서열을 정확히 절단하여 기존의 기술들에 비해 높은 효율로 유전체상의 유전정보를 편집하는 분자도구이다. 실제로 유전자 편집 방법은 2002년 초파리에서 유전자 녹-아웃(knock-out)을 위해 사용된 이래 기존의 기술로 정확한 유전자 녹아웃이 매우 비효율적이거나 불가능하였던 다양한 동물뿐만 아니라, 애기장대, 담배, 벼, 옥수수 등의 식물에서 매우 효율적인 유전정보 조작을 성공적으로 유도할 수 있음 이 증명되었다.

CRISPR/Cas9 시스템은 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 유전자 가위라 불리는 게놈(유전체) 편집 방법으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA(guide RNA)와 특정한 염기서열을 자르는 가위 역할인 Cas9(CRISPR associated protein 9) 엔도뉴클레아제 효소로 구성된다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하면 세포나 동물에 플라스미드 DNA를 도입하여 특정 유전자의 기능을 억제할 수 있는 녹-아웃이 가능하다. 최근에는 이러한 유전자 편집이 성공적으로 이루어지기 위해서 목적 유전자를 특이적으로 목적하는 효율이 높으면서, 비특이적인 지역을 변화시키지 않는 벡터가 요구되고 있다.

그러나 아직까지 이러한 유전자 편집을 이용하여 식물의 종자 발아를 조절하는 연구는 미미한 수준이다. 뿐만 아니라, 예측곤란한 기후변화에 대응하여 개선된 특성을 구비한 식물체에 대한 요구는 관련 업계에서 지속적으로 증대되고 있다.

대한민국등록특허 제10-1603250호 (공고일: 2016.03.15)

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 OsMYB1 유전자 편집용 가이드 RNA, 상기 가이드 RNA를 포함하는 OsMYB1 유전자 편집용 벡터, 상기 가이드 RNA 또는 상기 벡터를 포함하는 OsMYB1 유전자 편집용 조성물 또는 상기 벡터 또는 상기 조성물을 형질도입하여 제조된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 벼 종자의 발아를 촉진하는 유전자를 지속적으로 탐색하여 인산화모티브를 가지는 전사인자 중의 하나인 Os04g58020 단백질 코딩하는 유전자(OsMYB1 유전자)의 염기서열 내에 단일염기 삽입 내지 결실을 유도하는 유전자 편집을 통해 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인의 결실 내지 변이를 도입하였을 때, OsMYB1 유전자 편집된 벼의 성숙 종자의 발아가 촉진되고, 등숙기 종자의 발아 효율이 개선됨을 규명하여 본 발명을 완성했다.

본 개시는 SnRK2 단백질 키나제(SnRK2 kinase)의 인산화모티브(RXXS/T)를 코딩하는 벼 유래 OsMYB1 유전자를 특이적으로 인식하는, 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 제공하며, 바람직하게는 상기 가이드 RNA는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 가이드 RNA는 벼 유래의 OsMYB1 유전자의 표적서열에 엔도뉴클레아제를 특이적으로 가이드하여 원하는 유전자 변이, 구체적으로 DNA 변이, 예컨대 삽입, 결실, 또는 삽입/결실(IN/DEL)을 유도하는 것일 수 있다.

또한, 본 개시는 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열 및 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 벼 유래 OsMYB1 유전자를 편집하기 위한 유전자 편집용 벡터를 제공한다.

상기 벡터는 대상 식물체의 형질전환을 위한 재조합 벡터일 수 있다.

또한, 본 개시는 상기 가이드 RNA 또는 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 OsMYB1 유전자 편집용 조성물을 제공한다.

또한, 본 개시는 상기 벡터 또는 상기 조성물을 형질도입하여 OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 개시는 상기 벡터 또는 상기 조성물에 의해 변형된 OsMYB1 유전자 또는 변형된 OsMYB1 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하고/하거나 변형된 OsMYB1 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 나타내는 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 형질전환 식물체는 그 종자의 발아가 촉진된 것일 수 있다.

상기 식물체는 벼(Oryza satvia)일 수 있다.

또한, 본 개시는 OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 식물체의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 개시는 OsMYB1 유전자 편집용 가이드 RNA를 코딩하는 서열번호 3의 염기서열과 이 염기서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 염기서열 및 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질도입하여 OsMYB1 유전자의 표적서열에 변이를 유도하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 개시는 상기 제조방법에 의해 제조된 발아율이 개선된 종자를 생산하는 형질전환 벼를 제공한다.

본 개시에 따른, OsMYB1 유전자 편집용 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제와 연계하여 OsMYB1 유전자의 표적서열에 변이를 유도하여 OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 식물체의 생산을 가능케할 뿐 아니라, 형질전환된 식물체의 종자 발아를 조절할 수 있다. 본 개시에 따른 OsMYB1 유전자 편집용 가이드 RNA를 이용해 종자 휴면성에 관여하여 작물의 생산량을 비롯한 생산계획에 활용할 수 있다.

도 1은 전사인자 유전자 2,839종의 아미노산 서열에서 발견되는 SnRK2 인산화 모티브의 분포를 나타낸 것이다.
도 2는 OsMYB1 단백질의 주요 기능영역 및 인산화 모티브의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 환경스트레스에 의한 OsMYB1 유전자 발현 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 OsMYB1 유전자 편집 벡터 OsMYB1-pRGEB32의 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 OsMYB1-pRGEB32 벡터가 도입된 아그로박테리아(LBA4404)의 콜로니 PCR 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 OsMYB1-pRGEB32 벡터가 도입된 형질전환 벼의 PCR 검정을 나타낸 것이다.
도 7은 OsMYB1-pRGEB32 벡터가 도입된 형질전환 벼의 표적 유전자 염기서열 변이(A) 및 아미노산 변이(B)를 나타낸 것이다.
도 8은 OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 벼 호모계통에서 Os04g58020의 상동성 유전자인 Os01g34060의 염기서열 분석결과를 나타낸 것이다.
도 9는 OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 벼 계통의 성숙 종자 발아 분석을 나타낸 것이다.
도 10은 OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 벼 계통의 등숙기 종자 발아에 대한 분석을 나타낸 것이다. (A)는 출수후 40일 (40 DAH)된 등숙기 종자의 발아율 비교 그래프, (B)는 발아 3일째 사진 (C)는 발아 10일째 사진이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “OsMYB1(Oryza sativa MYB1) 단백질”은 벼(Oryza sativa)의 염색체 4번에 위치한 Os04g58020 유전자로부터 유래한 폴리펩티드 또는 단백질로서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. OsMYB1 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 OsMYB1으로 표기되며,

서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 가질 수 있다. 서열번호 1의 염기 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지면서 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 상동체, 유사체 등은 본 개시의 범위에 포함된다.

본 개시에 따른 Os04g58020 유전자는 식물의 스트레스 내성을 유도하는 호르몬인 ABA 신호전달에 관여하는 SnRK2 단백질 키나제(SnRK2 kinase) 단백질과의 연관성에 기초하여 후보로 선발되었다. 구체적으로, 본 발명자들은 SnRK2 단백질 키나제가 인식하는 인산화모티브(RXXS/T)를 다수, 예를 들어, 적어도 2개, 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 그 이상 포함하는 벼의 전사인자 유전자를 탐색하여 선발한 것으로, 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 두 종류의 Myb-유사 도메인 (SANT(Switching-defective protein 3 (Swi3), Adaptor 2 (Ada2), Nuclear receptor co-repressor (N-CoR) and Transcription factor IIIB) 도메인과 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인)을 가지고 있다. Os04g58020 유전자의 염기서열 681 bp 위치에서 단일염기 삽입 내지 결실을 유도하는 유전자 편집을 통해 MYB 타입 HTH DNA 결합도메인 (서열번호 2의 267번aa~323번aa)의 결실 내지 변이를 유발한 결과 변형된 유전자 및 이 유전자에 의해 코딩되는 변형된 단백질이 발현되어 발아율이 촉진된 종자를 생산하는 형질전환된 벼가 생산되는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 Os04g58020 유전자를 종자발아 촉진과 관련된 구조적 특징을 강조하기 위해 “OsMYB1"으로 명명하였다.

일 양태에서, 본 개시는 MYB 타입 HTH DNA 결합도메인 (서열번호 2의 267번aa~323번aa)의 결실 내지 변이를 유도하기 위하여 664~683 bp 염기서열을 특이적으로 인식하는, 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "가이드 RNA(guide RNA; gRNA)"는 동물 또는 식물 대상체에서 특정 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 인식하여 찾아내는 특이적인 RNA를 말하며, 타겟 DNA 서열 전부 또는 일부와 상보적으로 결합하여 해당 타겟 DNA 서열로 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산(ribonucleic acid)을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 타겟 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 지칭하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 타겟 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 개시의 범위에 포함될 수 있다.

본 개시에 따른 가이드 RNA는 바람직하게는, 단일 가닥 가이드 RNA 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 그 유래 미생물 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 또는 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo)에서 전사된 것, 예컨대, 단일가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 개시에 따른 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 유사 MYB의 DNA 결합 도메인을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자, 더 구체적으로 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 인식할 수 있는 것이라면, 특별한 제한없이 사용가능하다.

일 실시형태에서, 본 개시에 따른 가이드 RNA는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 서열번호 3의 염기서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 바람직하게는 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%, 가장 바람직하게는 100%의 동일성을 나타내는 것일 수 있다.

상기 OsMYB1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 바람직하게는 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%, 가장 바람직하게는 100%의 동일성을 나타내는 것일 수 있다.

상기 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 바람직하게는 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%, 가장 바람직하게는 100%의 동일성을 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 OsHDSTART1 단백질을 코딩하는 유전자는 코돈 축퇴성에 따라 서열번호 1의 축퇴된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 개시에 따른 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 표적 유전자, 구체적으로 OsMYB1 단백질의 유사 MYB의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 유전자를 특이적으로 인식하여 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9을 상기 유전자로 가이드하여 목적하는 유전자 편집을 유도할 수 있다.

본 개시에 따른 상기 가이드 RNA는 벼 유래의 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 위치, 구체적으로 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인의 결실 또는 변이를 유도하는 것일 수 있다.

본 개시에 따른 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 OsMYB1 유전자, 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 664번 위치 (서열번호 2로 표시되는 상응하는 아미노산 서열의 222번 위치)를 특이적으로 인식하여 엔도뉴클레아제와 연계하여 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인, 구체적으로 서열번호 2로 나타내는 아미노산 서열 중의 267번에서 323번 사이의 영역에 변이, 구체적으로 종자의 발아율을 증대시킬 수 있는 변이를 유발할 수 있는 것이라면, 제한됨이 없이 사용될 수 있다.

본 개시에 비추어 이러한 특성을 갖는 가이드 RNA의 서열을 특정하고 선별하는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본 개시에 따른 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 Os04g58020 유전자와 상동성이 높은 다른 유전자는 특이적으로 인식하지 않고, 상동성 영역에 비특이적인 유전자 변이를 유도하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 일 양태에서, 본 개시는 전술한 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열, 특히 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열 및 엔도뉴클레아제, 특히 Cas9을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자의 편집을 유도하기 위한 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 "유전자 편집(genome/gene editing)"은 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 타겟 지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전자 편집은 특히 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "엔도뉴클레아제" 또는 "엔도뉴클레아제 단백질"은 Cas9(CRISPR associated protein 9), Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 예컨대 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 타겟 DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 타겟 DNA의 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기 쌍 사이를 추정하여 절단한다. 본 발명의 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "CRISPR/Cas9"또는 "CRISPR/Cas9 시스템 "은 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 것으로서, 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 편집 방법이다. 고정적 구성요소로서 Cas9 단백질을 포함하고, 가변적 구성요소로서 타겟 유전자에 특이적인 가이드 RNA를 포함한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "타겟 유전자"는 편집하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 특정 핵산, 예컨대 특정 위치의 DNA를 의미한다.

본 개시의 일 양태에서, 상기 타겟 유전자는 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자(OsMYB1), 더 구체적으로 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이 유전자와 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 상동체, 유사체 등일 수 있으나, 이로만 제한되는 것은 아니다.

본 개시에 따른 벡터는 타겟 유전자에 특이적인 가이드 RNA를 코딩하는 핵산서열(DNA) 및 엔도뉴클레아제 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 삽입하고 이를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 발현 시스템(발현 카세트)을 포함하는, 플라스미드와 같은 벡터일 수 있다. 상기 플라스미드는 목적 유전자 발현을 위한 요소(elements)를 포함하는 것으로, 복제기점(replication origin), 프로모터, 작동유전자(operator), 전사 종결 서열(terminator) 등을 포함할 수 있고, 식물체의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위(예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 임의로 식물체의 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위(ribosome binding site; RBS) 및/또는 전사 조절 인자 등을 추가로 포함할 수 있다.

일예로, 본 개시에 따른 벡터는 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 인식하는 가이드 RNA를 코딩하는 서열번호 3의 핵산 서열 및 상기 가이드 RNA와 작동가능하게 연결된 Cas9을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터, 특히 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)에 도입가능한 식물형질전환용 재조합 바이너리 벡터일 수 있다(도 3 참조).

일 실시형태에서 본 개시에 따른 벡터는 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 인식하여 유전자 편집을 유도하는 가이드 RNA가 도입된 식물형질 전환용 재조합 벡터를 지칭할 수 있다.

본 개시에 따른 벡터는 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이를 도입하는 유전자 편집 효소, 바람직하게는 Cas9 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 개시에 따른 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 개시는 전술한 벡터를 유효성분으로 포함하는 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자 편집용 조성물에 관한 것이다. 여기서, “OsMYB1 유전자”, “가이드 RNA”, 및 “벡터”는 앞서 설명한 바와 같다.

본 개시에 따른 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자 편집용 조성물은 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자, 더 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자의 특정 위치에 종자 발아를 촉진할 수 있는 돌연변이를 도입할 수 있다. 상기 돌연변이는 결과적으로 형질전환된 벼의 종자의 발아효율을 증대시킬 수 있다.

또 다른 일 실시형태에서, 본 개시는 상기 벡터 또는 상기 조성물에 의해 도입된 돌연변이를 포함하는 변형된 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 개시에 따른 형질전환 식물체는 증대된 종자발아율을 나타낼 수 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 “형질전환”은 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 식물세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다. 식물의 형질전환에 이용되는 식물 세포는 어떤 식물세포든 가능하다. 상기 식물세포는 배양세포, 배양조직, 배양기관 또는 전체 식물조직이다. 상기 식물조직은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 따라서, 식물조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관배양, 조직배양 또는 세포배양 상태일 수 있다.

상기 식물세포를 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 및 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)을 이용할 수 있다.

본 발명에서 "식물체"는 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명에서 상기 식물체는 배추, 애기장대, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 구체적으로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류이며, 더욱 구체적으로는 벼(Orizaya satvia)일 수 있다.

본 개시에 따른 형질전환 식물체는 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자에 변이가 도입됨으로써, 또는 변형된 OsMYB1 단백질을 발현함으로써 종자발아가 촉진된, 식물체일 수 있다.

본 개시의 일 실시형태에서, 본 개시에 따른 벡터 또는 유전자 편집용 조성물에 의해 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자가 편집된 형질전환 벼는 대조구인 야생형(삼광벼)의 종자에 비해 향상된 종자발아율을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 야생형 벼의 종자가 침윤 36시간째 발아율이 15% 미만인 것에 비해 본 개시에 따른 형질전환된 벼로부터 얻은 종자는 50% 이상 종자발아가 촉진된 것일 수 있다. 또한, 40 DAH 시기의 등숙기 종자 발아율을 분석한 결과, 야생형 벼의 종자가 발아 3일째까지 종자 휴면성을 유지하는 것에 비해, 본 개시에 따른 형질전환된 벼로부터 얻은 종자는 증대된 발아율, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50% 또는 그 이상의 발아율을 나타낼 수 있다.

본 개시의 또 다른 일 실시형태에서, 본 개시에 따른 형질전환 벼는 야생형 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 681 bp 위치에 A 또는 T 단일염기 삽입 돌연변이가 도입되거나 또는 681 bp 위치의 A 단일염기 결손이 일어나서 결과적으로 조기 종결코돈이 생성됨으로써 변형된 OsMYB1 단백질을 발현할 수 있다(도 6 및 도 7 참조). 상기 변형된 OsMYB1 단백질은 야생형 단백질 대비 종자의 발아율을 증대시키는 활성을 나타낼 수 있다.

달리 말하자면, 본 개시에 따른 형질전환된 벼는 종자발아율을 증대시키는 활성을 나타내는 변형된 OsMYB1 단백질을 발현하는 것일 수 있다.

본 개시에 따른 변형된 OsMYB1 단백질은 야생형 OsMYB1 단백질, 더 구체적으로 야생형 OsMYB1 단백질의 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인에 변이, 예컨대, 도메인의 일부 또는 전부의 결실 변이 또는 전체 또는 일부 아미노산 서열의 변화가 초래되어 종자발아율을 증대시킬 수 있는 변이 단백질에 해당하는 것이라면, 제한됨이 없이, 본 개시의 범위 내에 포함되어야 한다.

일예로, 본 개시에 따른 변형된 OsMYB1 단백질은 서열번호 14, 16 및 18로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 갖는 유전자로부터 코딩된 것일 수 있다. 또 다른 일예로, 본 개시에 따른 변형된 OsMYB1 단백질은 서열번호 15, 17 및 19로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다.

본 개시에 따른 변형된 OsMYB1 단백질은 야생형 OsMYB1 단백질의 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인 영역이 결손되거나 변이가 일어나서, 야생형 단백질에 비해 비정상적인 인산화 모티브를 갖거나 이를 불포함하거나 적게 포함하는 것일 수 있다. 이러한 특징을 나타내는 변이형 OsMYB1 단백질을 발현하는 형질전환 벼는, 제한됨이 없이, 본 개시의 범위 내에 포함되어야 한다.

또 다른 일 실시형태에서, 본 개시는 상기 형질전환 식물체 또는 상기 유전자가 편집된 식물체의 종자를 제공한다.

본 개시에 따른 종자는 OsMYB1 유전자 편집된 형질전환 벼를 교배모본으로 하여 도입하고자 하는 벼와 교배하여 얻은 자손 벼로부터 수득한 잡종 종자일 수 있다.

또 다른 일 실시형태에서, 본 개시는 서열번호 3의 염기서열과 동일하거나 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 염기서열로 이루어진 OsMYB1 유전자 편집용 가이드 RNA를 포함하는 형질전환용 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질도입하여 OsMYB1 유전자의 표적서열에 변이를 유도하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 개시는 상기 제조방법에 의해 제조된 종자발아율이 증대된 형질전환 벼에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: OsMYB1 유전자 선발

SnRK2 단백질 키나제(SnRK2 kinase)는 ABA 신호전달을 매개하는 주요 양성 조절자(key positive regulator)로 식물의 스트레스 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 주목되고 있으나 작용 하위에 있는 표적 전사인자 유전자는 많이 알려져 있지 않다. SnRK2 단백질 키나제는 RXXS/T 아미노산 모티브의 세린/트레오닌 잔기를 인산화시키는 것으로 보고되어 있다.

먼저 공개 DB를 통해 벼 전사인자 유전자 2,839종의 아미노산 서열을 추출하고 SnRK2 단백질 키나제 인산화모티브(RXXS/T)를 포함하는 후보 전사인자군을 탐색하였고(도 1), 그 중 OsMYB1 (Os04g05820) 유전자를 선발하였다(도 2).

또한, 컴퓨터 시뮬레이션(in silico) 분석을 통해 Os04g05820 유전자가 환경스트레스에 의해 발현이 유도되는 특징을 보인다는 것을 확인하였다. 도 3은 환경스트레스에 의한 OsMYB1 유전자 발현 분석을 나타낸 것이다. 도 3을 참고하면, fold change값을 통해 Os04g05820 유전자가 고온, 가뭄 및 염 스트레스에 대해 특이적으로 발현이 유도되며, 추위에 의해 발현이 억제되는 특징이 있다는 것을 확인하였다.

OsMYB1 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 표 1에 표시하였다.

구분	서열
OsMYB1 염기서열 (서열번호 1)	atgtccgcgt ctgcatccgc tgtctgtctc cttcctcccc gaggaggaag cctggcccga 60 cccgacaccg cactcccccc agccagccag ccagccactg tcgcggtgaa ccaaaatatc 120 ccccgcctcg cctcgcctcg cctcgcggta acatccatca cactcctccc ccgccgcggc 180 cgccgctgcg cggtagatct cctcctcctc cacctccacc gtctcctgct cttcctctct 240 ctcttctcgg aggaaacccc caatttattc cttccccgca aacccgcagc cttcctaaaa 300 cgaattaaat ctccctccct tatccgccgc tgcaatccct ccccacaaaa tctcgctgcg 360 ccgcgcgctg ttttagggtt tgagctcatg gcggtggagg aggcgagcag cagcagtggc 420 ggcggtcgtg gtgggggtgg cggtgggggt ggggaggagg ggttgtccgg ttgcggcggt 480 gggtggacgc gcgagcagga gaaggcgttc gagaacgcgc tggcgacggt gggggatgac 540 gaggaggaag gggacgggtt gtgggagaag ctagcggagg ccgtggaggg gaagacggcc 600 gacgaggtga ggcggcacta cgagctgctg gtggaggacg tcgacggcat cgaggccggg 660 cgggtgccgc tcctggtgta cgccggcgac gggggcgtcg aggagggctc tgcgggaggt 720 gggaagaagg ggggtggtgg gggaggaggt ggaggtggag gggggcatgg ggagaagggg 780 tcggctaagt cctctgagca ggagcgccgg aaggggatcg cctggacgga ggacgagcac 840 aggctgttcc ttcttggact tgagaagtac ggcaaaggcg actggaggag tatctcaaga 900 aactttgtga tctcaaggac acccacccaa gtagctagtc atgcacagaa gtattttatt 960 cgcctgaact caatgaacag agagaggcgg cgatcaagta tacatgacat aaccagcgtg 1020 aacaatggag atacatctgc tgctcagggg ccaatcacag gtcagccaaa tggcccatca 1080 gcaaatcctg gaaaatcctc taagcagtct ctacagccag caaatgcgcc tccaggcgtc 1140 gatgcttatg gtacgacaat tggacagcca gttggtggtc ctcttgtgtc cgcagttggc 1200 actcctgtta cacttcctgt tcctgctgca cctcatatag cctatggcat gcatgcccct 1260 gtccctggag ctgtagtccc tggtgcccca gtaaacatgc ctccaatgcc ctaccccatg 1320 ccgccaccaa catctcatgg atga
OsMYB1 아미노산서열 (서열번호 2)	MSASASAVCL LPPRGGSLAR PDTALPPASQ PATVAVNQNI PRLASPRLAV TSITLLPRRG 60 RRCAVDLLLL HLHRLLLFLS LFSEETPNLF LPRKPAAFLK RIKSPSLIRR CNPSPQNLAA 120 PRAVLGFELM AVEEASSSSG GGRGGGGGGG GEEGLSGCGG GWTREQEKAF ENALATVGDD 180 EEEGDGLWEK LAEAVEGKTA DEVRRHYELL VEDVDGIEAG RVPLLVYAGD GGVEEGSAGG 240 GKKGGGGGGG GGGGGHGEKG SAKSSEQERR KGIAWTEDEH RLFLLGLEKY GKGDWRSISR 300 NFVISRTPTQ VASHAQKYFI RLNSMNRERR RSSIHDITSV NNGDTSAAQG PITGQPNGPS 360 ANPGKSSKQS LQPANAPPGV DAYGTTIGQP VGGPLVSAVG TPVTLPVPAA PHIAYGMHAP 420 VPGAVVPGAP VNMPPMPYPM PPPTSHG*

실시예 2: OsMYB1 단일 gRNA 서열 결정 및 유전자 편집 벡터 제작

2-1. OsMYB1 유전자를 편집하는 유효 가이드 RNA 결정

CRISPR/Cas9 유전자 편집기술을 이용하여 OsMYB1 유전자의 기능을 조사하고 벼의 내재해성 형질을 개량하기 위한 목적으로 활용할 수 있는지를 확인하기 위하여 먼저 OsMYB1 유전자에 대한 단일 guide RNA 서열(gRNA-OsMYB1)을 결정하였다. 이를 위하여 OsMyb1 단백질의 주요 기능성 영역인 두개의 Myb-유사 도메인 (SANT 도메인과 MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인) 을 인코딩하는 염기서열을 기준으로 공개데이터베이스 CRISPR RGEN Tools (http://www.rgenome.net)의 Cas-Designer를 이용하여 5'-NGG-3' 타입의 PAM 서열을 가지며 off-target 지수가 0이고 out-of-frame 점수가 70% 이상인 하기 gRNA 서열(20mer)을 결정하였다.

서열번호 3 : gRNA-OsMYB1: 5’-GTGCCGCTCCTGGTGTACGC-3’

2-3. 가이드 RNA가 도입된 식물형질전환용 바이너리 벡터 제작

단일 guide RNA를 pRGEB32 벡터에 클로닝하기 위하여 먼저 하기 한쌍의 OsU3 프라이머(서열번호 4: OsU3-F, 서열번호 5: OsU3-R)를 사용하여 381bp의 1차 PCR 산물을 증폭하였다.

HindIII 제한효소 서열을 포함하는 하기 pRGEB32-HdIII 프라이머(서열번호 6)와 OsMYB1 유전자의 단일 guide RNA서열(서열번호 3)이 포함된 하기 합성 프라이머(서열번호 7:gRNA-OsMYB1-R1)가 포함된 가이드 RNA 카세트를 구축하였다. 상기 카세트를 이용하여 2차 PCR을 진행하였다. 2차 PCR 산물을 제한효소 BsaI과 HindIII를 절단한 후 pRGEB32 벡터의 BsaI과 HindIII 위치에 infusion 방법으로 클로닝하여 OsMYB1 유전자 편집벡터(OsMYB1-pRGEB32 벡터)를 제작하였다.

서열번호 4: OsU3-F: 5'-aag gaa tct tta aac ata cga aca gat cac tta aag-3’

서열번호 5: OsU3-R: 5'-tgc cac gga tca tct gca caa ctc -3’

서열번호 6: pRGEB32-HdIII :

5'-gac atg att acg cca ag ctt aag gaa tct tta aac ata c -3’

서열번호 7: gRNA-OsMYB1-R1:

5'-att tct agc tct aaa acg cgt aca cca gga gcg gca c tg cca cgg atc atc tgc -3’

도 4는 OsMYB1 유전자 편집 벡터 OsMYB1-pRGEB32의 모식도를 나타낸 것이다. 도 4를 참고하면, 목적한 가이드 RNA 및 OsMYB1 유전자의 염기서열을 가진 합성된 DNA 단편을 최종 식물형질전환용 벡터에 도입하기 위한 전략을 나타낸다.

실시예 3: OsMYB1 유전자 편집벡터가 삽입된 형질전환 벼의 제작 및 도입 벡터 확인

3-1. 형질전환 벼의 제작

실시예 2에서 제작한 OsMYB1 유전자 편집벡터 OsMYB1-pRGEB32를 아그로박테리아(Agrobacteria) LBA4404에 도입하여 형질전환 후, 하기 한쌍의 프라이머(서열번호 8: OsMYB1-R2, 서열번호 9:M13R)를 이용하여 콜로니 PCR 방법으로 벡터가 도입된 아그로박테리아를 선발하였다.

서열번호 8: OsMYB1-R2: 5'-g cgt aca cca gga gcg gca c-3’

서열번호 9: M13R: 5'-gcg gat aac aat ttc aca cag-3’

정확한 벡터의 도입을 검증하기 위해 OsMYB1-pRGEB32 벡터를 선발한 아그로박테리아 각 플라스미드를 분리 후 전기영동으로 분석하였다. 도 5는 OsMYB1-pRGEB32 벡터가 도입된 아그로박테리아(LBA4404)의 콜로니 PCR 분석을 나타낸 것이다. 도 5를 참고하면, 완성된 OsMYB1-pRGEB32 벡터에 도입된 가이드 RNA 카세트에 존재하는 인식서열이 확인되어 정확한 벡터가 아그로박테리아에 형질전환 되었음을 확인하였다.

상기 형질전환된 아그로박테리아를 삼광벼의 종자로부터 유도한 캘루스에 접종하고, 하이그로마이신 30 μg/ml을 포함하는 배지에서 형질전환 캘루스를 선발한 후 줄기와 뿌리를 유도하여 형질전환 벼를 생산하였다.

3-2. 형질전환 벼의 OsMYB1 유전자 편집벡터 삽입유무 검정

OsMYB1 형질전환 벼의 잎에서 genomic DNA를 분리한 후 OsMYB1 유전자, 벡터에 특이적인 상기 서열번호 8 및 9의 염기서열로 이루어진 프라이머(OsMYB1-R2, M13R) 및 Cas9에 특이적인 하기 프라이머(서열번호 10: Cas9F, 서열번호 11: Cas9R)를 이용하여 각각 PCR을 수행하였다.

서열번호 10: Cas9F: 5’-gag aac atc gtg atc gaa at-3’

서열번호 11: Cas9R: 5’-tct cgg cct tgg tcagat tg-3’

서열번호 12: OsMyb1F: 5'-tgcaatccctccccacaaaa-3'

서열번호 13: OsMyb1-R3: 5'-GTTGTACAGGCTCCGAACAGA-3'

도 6은 OsMYB1-pRGEB32 벡터가 도입된 형질전환 벼의 PCR 검정을 나타낸 것이다. 도 6을 참고하면, OsMYB1-pRGEB32 벡터와 OsMYB1 gRNA 서열 특이적인 프라이머(OsMYB1-R2, M13R)에 의해 증폭된 영역을 전기영동한 사진에서 목적한 453 bp PCR 산물을 확인하였으며 (도 6 중간 이미지), Cas9 프라이머(Cas9F/R)에 의해 증폭된 영역을 전기영동한 사진에서 목적한 494bp PCR 산물을 확인하였다(도 6 하단 이미지). 또한 OsMYb1 유전자 특이적인 프라이머(서열번호 12:OsMyb1F/서열번호 13:OsMyb1-R3)에 의해 증폭된 영역을 전기영동한 사진에서 목적한 949 bp PCR 산물을 확인하였다(도 6 상단 이미지).

실시예 4: OsMYB1 유전자 편집벡터가 삽입된 형질전환 벼의 편집 염기서열 확인

OsMYB1 유전자 편집벡터 도입이 확인된 형질전환 벼를 대상으로 NGS 분석을 이용하여 유전자 편집위치의 염기서열 변이를 분석하였다.

도 7은 OsMYB1-pRGEB32 벡터가 도입된 형질전환 벼의 표적 유전자 염기서열 변이(A) 및 아미노산 변이(B)를 나타낸 것이다.

도 7A를 참고하면, OsMYB1 유전자 편집벡터가 도입된 형질전환 벼 3 계통 (OsMYB1-m09, m21, m25)에서 OsMYB1 유전자의 gRNA 위치에서 단일염기 삽입 내지 결실이 일어난 3 종류의 염기서열 변이(Type m1; Type m2; 및 Type m3)를 확인할 수 있다.

또한, 변이가 일어난 유전자가 코딩하는 아미노산을 분석한 결과 도 7B에서 보는 바와 같이, 야생형 OsMYB1 단백질이 447개 아미노산으로 구성된 반면, 삽입 내지 결실 변이가 일어난 OsMYB1 유전자 편집 형질전환 벼에서는 아미노산 결실이 일어나 262개(Type m1), 302개(Type m2), 또는 226개(Type m3) 아미노산으로 구성된 변형된 OsMYB1 단백질이 생성된다는 것을 확인하였다.

실시예 5: 가이드 RNA 염기서열 인식 특이성 검정

OsMYB1 유전자의 가이드 RNA의 정확한 염기서열 인식 특이성을 검증하기 위해 OsMYB1 유전자 (Os04g58020)의 아미노산 서열을 기준으로 BlastP 검색을 수행한 결과 Os04g58020과 가장 상동성이 높은 (56%) 벼(Oryza sativa)유전자인 Os01g34060이 확인되었다. Os01g34060 유전자는 OsMYB1과 유사하게 두개의 Myb-유사 도메인을 가지고 있다(도8B), Os04g58020 유전자의 gRNA 서열 (20mer)을 기준으로 Os01g34060은 Os04g58020과 5개의 염기서열의 차이를 보였으며, 아미노산 서열은 2개의 차이를 보였다(도 8A).

목적하는 OsMYB1 가이드 RNA의 정확한 염기서열 특이성을 검증하기 위해 OsMYB1 유전자 편집이 확인된 동형접합체(homozygous) 2계통 (osmyb1-m09, m21)의 잎에서 genomic DNA를 분리하고, Os01g34060 유전자 특이적인 하기 프라이머 한 쌍을 이용하여 gRNA 상동성 부위를 PCR로 증폭한 후 Sanger sequencing으로 염기서열을 분석하였다.

서열번호 20: Os01g34060-53F: 5'-GGACCAGGGAGGACGACAAGG-3'

서열번호 21: Os01g34060-393R: 5'-GCAGCTCTTGCCGCCGTCG-3'

그 결과, 도 8C에서 보는 바와 같이 OsMYB1 유전자 편집이 확인된 동형접합체(homozygous) 2계통 (osmyb1-m09, m21)의 Os01g34060 유전자 서열은 WT과 동일하였으며, 따라서 OsMYB1 유전자편집용 gRNA가 상동성이 높은 Os01g34060 유전자 위치를 비특이적으로 인식하지 않는 것으로 확인하였다. 이는, 상동성 영역에서 비특이적인 유전자 편집이 일어나지 않았다는 것을 나타낸 것이다.

실시예 6: OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 벼 분석

6-1. 형질전환 벼의 성숙 종자의 발아 분석

OsMYB1 유전자의 기능을 규명하기 위하여 유전자 편집이 확인된 T0 계통 성숙종자의 종자발아율을 분석하였다.

도 9는 OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 벼 계통의 성숙 종자 발아 분석을 나타낸 것이다. 도 9를 참고하면, 야생형인 삼광벼의 종자가 침윤 1일째 발아율이 15% 미만인 것에 비해, OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 벼 3계통은 25-65% 발아가 촉진되고 발아 1.5일째에는 모두 45% 이상 발아한 것을 확인하였다.

6-2. 형질전환 벼의 등숙기종자의 발아 분석

종자 휴면성에 관하여 OsMYB1 유전자의 기능을 규명하기 위하여 유전자 편집이 확인된 T1 계통의 출수 후 40일된 등숙기 종자의 발아율을 분석하였다.

도 10은 OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 벼 계통의 등숙기 종자 발아 분석을 나타낸 것이다. WT는 야생형 삼광벼 (대조구), osmyb1-m09, osmyb1-m21 및 osmyb1-m25은 OsMyb1 유전자 편집 계통이다.

도 10A 및 도 10B를 참고하면, 대조구인 삼광벼 종자는 침윤 3일째에도 발아율이 0%로 종자 휴면성이 매우 높은 반면, OsMYB1 유전자가 편집된 형질전환 벼의 종자는 약 12~50%가 발아되었음을 확인하였다. 또한 도 10C를 참고하면, 발아 10일째의 종자발아 상태를 비교한 결과, 대조구인 삼광벼 종자에 비해 형질전환 벼의 종자발아율이 현저히 높게 나타남을 육안으로도 식별할 수 있다.

이러한 결과는, OsMYB1 유전자가 벼 종자의 발아 및 휴면성 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 증명한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> OsMYB1 gene regulating seed germination and use thereof <130> DP20210294 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsMYB1 <400> 1 atgtccgcgt ctgcatccgc tgtctgtctc cttcctcccc gaggaggaag cctggcccga 60 cccgacaccg cactcccccc agccagccag ccagccactg tcgcggtgaa ccaaaatatc 120 ccccgcctcg cctcgcctcg cctcgcggta acatccatca cactcctccc ccgccgcggc 180 cgccgctgcg cggtagatct cctcctcctc cacctccacc gtctcctgct cttcctctct 240 ctcttctcgg aggaaacccc caatttattc cttccccgca aacccgcagc cttcctaaaa 300 cgaattaaat ctccctccct tatccgccgc tgcaatccct ccccacaaaa tctcgctgcg 360 ccgcgcgctg ttttagggtt tgagctcatg gcggtggagg aggcgagcag cagcagtggc 420 ggcggtcgtg gtgggggtgg cggtgggggt ggggaggagg ggttgtccgg ttgcggcggt 480 gggtggacgc gcgagcagga gaaggcgttc gagaacgcgc tggcgacggt gggggatgac 540 gaggaggaag gggacgggtt gtgggagaag ctagcggagg ccgtggaggg gaagacggcc 600 gacgaggtga ggcggcacta cgagctgctg gtggaggacg tcgacggcat cgaggccggg 660 cgggtgccgc tcctggtgta cgccggcgac gggggcgtcg aggagggctc tgcgggaggt 720 gggaagaagg ggggtggtgg gggaggaggt ggaggtggag gggggcatgg ggagaagggg 780 tcggctaagt cctctgagca ggagcgccgg aaggggatcg cctggacgga ggacgagcac 840 aggctgttcc ttcttggact tgagaagtac ggcaaaggcg actggaggag tatctcaaga 900 aactttgtga tctcaaggac acccacccaa gtagctagtc atgcacagaa gtattttatt 960 cgcctgaact caatgaacag agagaggcgg cgatcaagta tacatgacat aaccagcgtg 1020 aacaatggag atacatctgc tgctcagggg ccaatcacag gtcagccaaa tggcccatca 1080 gcaaatcctg gaaaatcctc taagcagtct ctacagccag caaatgcgcc tccaggcgtc 1140 gatgcttatg gtacgacaat tggacagcca gttggtggtc ctcttgtgtc cgcagttggc 1200 actcctgtta cacttcctgt tcctgctgca cctcatatag cctatggcat gcatgcccct 1260 gtccctggag ctgtagtccc tggtgcccca gtaaacatgc ctccaatgcc ctaccccatg 1320 ccgccaccaa catctcatgg atga 1344 <210> 2 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OsMYB1 <400> 2 Met Ser Ala Ser Ala Ser Ala Val Cys Leu Leu Pro Pro Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ala Arg Pro Asp Thr Ala Leu Pro Pro Ala Ser Gln Pro Ala 20 25 30 Thr Val Ala Val Asn Gln Asn Ile Pro Arg Leu Ala Ser Pro Arg Leu 35 40 45 Ala Val Thr Ser Ile Thr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Arg Arg Cys Ala 50 55 60 Val Asp Leu Leu Leu Leu His Leu His Arg Leu Leu Leu Phe Leu Ser 65 70 75 80 Leu Phe Ser Glu Glu Thr Pro Asn Leu Phe Leu Pro Arg Lys Pro Ala 85 90 95 Ala Phe Leu Lys Arg Ile Lys Ser Pro Ser Leu Ile Arg Arg Cys Asn 100 105 110 Pro Ser Pro Gln Asn Leu Ala Ala Pro Arg Ala Val Leu Gly Phe Glu 115 120 125 Leu Met Ala Val Glu Glu Ala Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Arg Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Leu Ser Gly Cys Gly Gly 145 150 155 160 Gly Trp Thr Arg Glu Gln Glu Lys Ala Phe Glu Asn Ala Leu Ala Thr 165 170 175 Val Gly Asp Asp Glu Glu Glu Gly Asp Gly Leu Trp Glu Lys Leu Ala 180 185 190 Glu Ala Val Glu Gly Lys Thr Ala Asp Glu Val Arg Arg His Tyr Glu 195 200 205 Leu Leu Val Glu Asp Val Asp Gly Ile Glu Ala Gly Arg Val Pro Leu 210 215 220 Leu Val Tyr Ala Gly Asp Gly Gly Val Glu Glu Gly Ser Ala Gly Gly 225 230 235 240 Gly Lys Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly His 245 250 255 Gly Glu Lys Gly Ser Ala Lys Ser Ser Glu Gln Glu Arg Arg Lys Gly 260 265 270 Ile Ala Trp Thr Glu Asp Glu His Arg Leu Phe Leu Leu Gly Leu Glu 275 280 285 Lys Tyr Gly Lys Gly Asp Trp Arg Ser Ile Ser Arg Asn Phe Val Ile 290 295 300 Ser Arg Thr Pro Thr Gln Val Ala Ser His Ala Gln Lys Tyr Phe Ile 305 310 315 320 Arg Leu Asn Ser Met Asn Arg Glu Arg Arg Arg Ser Ser Ile His Asp 325 330 335 Ile Thr Ser Val Asn Asn Gly Asp Thr Ser Ala Ala Gln Gly Pro Ile 340 345 350 Thr Gly Gln Pro Asn Gly Pro Ser Ala Asn Pro Gly Lys Ser Ser Lys 355 360 365 Gln Ser Leu Gln Pro Ala Asn Ala Pro Pro Gly Val Asp Ala Tyr Gly 370 375 380 Thr Thr Ile Gly Gln Pro Val Gly Gly Pro Leu Val Ser Ala Val Gly 385 390 395 400 Thr Pro Val Thr Leu Pro Val Pro Ala Ala Pro His Ile Ala Tyr Gly 405 410 415 Met His Ala Pro Val Pro Gly Ala Val Val Pro Gly Ala Pro Val Asn 420 425 430 Met Pro Pro Met Pro Tyr Pro Met Pro Pro Pro Thr Ser His Gly *** 435 440 445 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA-OsMYB1 <400> 3 gtgccgctcc tggtgtacgc 20 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsU3-F <400> 4 aaggaatctt taaacatacg aacagatcac ttaaag 36 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsU3-R <400> 5 tgccacggat catctgcaca actc 24 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRGEB32-HdIII <400> 6 gacatgatta cgccaagctt aaggaatctt taaacatac 39 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA-OsMYB1-R1 <400> 7 atttctagct ctaaaacgcg tacaccagga gcggcactgc cacggatcat ctgc 54 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsMYB1-R2 <400> 8 gcgtacacca ggagcggcac 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R <400> 9 gcggataaca atttcacaca g 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9F <400> 10 gagaacatcg tgatcgaaat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9R <400> 11 tctcggcctt ggtcagattg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsMyb1F <400> 12 tgcaatccct ccccacaaaa 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsMyb1-R3 <400> 13 gttgtacagg ctccgaacag a 21 <210> 14 <211> 1345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Type m1 <400> 14 atgtccgcgt ctgcatccgc tgtctgtctc cttcctcccc gaggaggaag cctggcccga 60 cccgacaccg cactcccccc agccagccag ccagccactg tcgcggtgaa ccaaaatatc 120 ccccgcctcg cctcgcctcg cctcgcggta acatccatca cactcctccc ccgccgcggc 180 cgccgctgcg cggtagatct cctcctcctc cacctccacc gtctcctgct cttcctctct 240 ctcttctcgg aggaaacccc caatttattc cttccccgca aacccgcagc cttcctaaaa 300 cgaattaaat ctccctccct tatccgccgc tgcaatccct ccccacaaaa tctcgctgcg 360 ccgcgcgctg ttttagggtt tgagctcatg gcggtggagg aggcgagcag cagcagtggc 420 ggcggtcgtg gtgggggtgg cggtgggggt ggggaggagg ggttgtccgg ttgcggcggt 480 gggtggacgc gcgagcagga gaaggcgttc gagaacgcgc tggcgacggt gggggatgac 540 gaggaggaag gggacgggtt gtgggagaag ctagcggagg ccgtggaggg gaagacggcc 600 gacgaggtga ggcggcacta cgagctgctg gtggaggacg tcgacggcat cgaggccggg 660 cgggtgccgc tcctggtgta tcgccggcga cgggggcgtc gaggagggct ctgcgggagg 720 tgggaagaag gggggtggtg ggggaggagg tggaggtgga ggggggcatg gggagaaggg 780 gtcggctaag tcctctgagc aggagcgccg gaaggggatc gcctggacgg aggacgagca 840 caggctgttc cttcttggac ttgagaagta cggcaaaggc gactggagga gtatctcaag 900 aaactttgtg atctcaagga cacccaccca agtagctagt catgcacaga agtattttat 960 tcgcctgaac tcaatgaaca gagagaggcg gcgatcaagt atacatgaca taaccagcgt 1020 gaacaatgga gatacatctg ctgctcaggg gccaatcaca ggtcagccaa atggcccatc 1080 agcaaatcct ggaaaatcct ctaagcagtc tctacagcca gcaaatgcgc ctccaggcgt 1140 cgatgcttat ggtacgacaa ttggacagcc agttggtggt cctcttgtgt ccgcagttgg 1200 cactcctgtt acacttcctg ttcctgctgc acctcatata gcctatggca tgcatgcccc 1260 tgtccctgga gctgtagtcc ctggtgcccc agtaaacatg cctccaatgc cctaccccat 1320 gccgccacca acatctcatg gatga 1345 <210> 15 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Type m1 <400> 15 Met Ser Ala Ser Ala Ser Ala Val Cys Leu Leu Pro Pro Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ala Arg Pro Asp Thr Ala Leu Pro Pro Ala Ser Gln Pro Ala 20 25 30 Thr Val Ala Val Asn Gln Asn Ile Pro Arg Leu Ala Ser Pro Arg Leu 35 40 45 Ala Val Thr Ser Ile Thr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Arg Arg Cys Ala 50 55 60 Val Asp Leu Leu Leu Leu His Leu His Arg Leu Leu Leu Phe Leu Ser 65 70 75 80 Leu Phe Ser Glu Glu Thr Pro Asn Leu Phe Leu Pro Arg Lys Pro Ala 85 90 95 Ala Phe Leu Lys Arg Ile Lys Ser Pro Ser Leu Ile Arg Arg Cys Asn 100 105 110 Pro Ser Pro Gln Asn Leu Ala Ala Pro Arg Ala Val Leu Gly Phe Glu 115 120 125 Leu Met Ala Val Glu Glu Ala Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Arg Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Leu Ser Gly Cys Gly Gly 145 150 155 160 Gly Trp Thr Arg Glu Gln Glu Lys Ala Phe Glu Asn Ala Leu Ala Thr 165 170 175 Val Gly Asp Asp Glu Glu Glu Gly Asp Gly Leu Trp Glu Lys Leu Ala 180 185 190 Glu Ala Val Glu Gly Lys Thr Ala Asp Glu Val Arg Arg His Tyr Glu 195 200 205 Leu Leu Val Glu Asp Val Asp Gly Ile Glu Ala Gly Arg Val Pro Leu 210 215 220 Leu Val Tyr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Gly Leu Cys Gly Arg 225 230 235 240 <210> 16 <211> 1343 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Type m2 <400> 16 atgtccgcgt ctgcatccgc tgtctgtctc cttcctcccc gaggaggaag cctggcccga 60 cccgacaccg cactcccccc agccagccag ccagccactg tcgcggtgaa ccaaaatatc 120 ccccgcctcg cctcgcctcg cctcgcggta acatccatca cactcctccc ccgccgcggc 180 cgccgctgcg cggtagatct cctcctcctc cacctccacc gtctcctgct cttcctctct 240 ctcttctcgg aggaaacccc caatttattc cttccccgca aacccgcagc cttcctaaaa 300 cgaattaaat ctccctccct tatccgccgc tgcaatccct ccccacaaaa tctcgctgcg 360 ccgcgcgctg ttttagggtt tgagctcatg gcggtggagg aggcgagcag cagcagtggc 420 ggcggtcgtg gtgggggtgg cggtgggggt ggggaggagg ggttgtccgg ttgcggcggt 480 gggtggacgc gcgagcagga gaaggcgttc gagaacgcgc tggcgacggt gggggatgac 540 gaggaggaag gggacgggtt gtgggagaag ctagcggagg ccgtggaggg gaagacggcc 600 gacgaggtga ggcggcacta cgagctgctg gtggaggacg tcgacggcat cgaggccggg 660 cgggtgccgc tcctggtgtc gccggcgacg ggggcgtcga ggagggctct gcgggaggtg 720 ggaagaaggg gggtggtggg ggaggaggtg gaggtggagg ggggcatggg gagaaggggt 780 cggctaagtc ctctgagcag gagcgccgga aggggatcgc ctggacggag gacgagcaca 840 ggctgttcct tcttggactt gagaagtacg gcaaaggcga ctggaggagt atctcaagaa 900 actttgtgat ctcaaggaca cccacccaag tagctagtca tgcacagaag tattttattc 960 gcctgaactc aatgaacaga gagaggcggc gatcaagtat acatgacata accagcgtga 1020 acaatggaga tacatctgct gctcaggggc caatcacagg tcagccaaat ggcccatcag 1080 caaatcctgg aaaatcctct aagcagtctc tacagccagc aaatgcgcct ccaggcgtcg 1140 atgcttatgg tacgacaatt ggacagccag ttggtggtcc tcttgtgtcc gcagttggca 1200 ctcctgttac acttcctgtt cctgctgcac ctcatatagc ctatggcatg catgcccctg 1260 tccctggagc tgtagtccct ggtgccccag taaacatgcc tccaatgccc taccccatgc 1320 cgccaccaac atctcatgga tga 1343 <210> 17 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Type m2 <400> 17 Met Ser Ala Ser Ala Ser Ala Val Cys Leu Leu Pro Pro Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ala Arg Pro Asp Thr Ala Leu Pro Pro Ala Ser Gln Pro Ala 20 25 30 Thr Val Ala Val Asn Gln Asn Ile Pro Arg Leu Ala Ser Pro Arg Leu 35 40 45 Ala Val Thr Ser Ile Thr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Arg Arg Cys Ala 50 55 60 Val Asp Leu Leu Leu Leu His Leu His Arg Leu Leu Leu Phe Leu Ser 65 70 75 80 Leu Phe Ser Glu Glu Thr Pro Asn Leu Phe Leu Pro Arg Lys Pro Ala 85 90 95 Ala Phe Leu Lys Arg Ile Lys Ser Pro Ser Leu Ile Arg Arg Cys Asn 100 105 110 Pro Ser Pro Gln Asn Leu Ala Ala Pro Arg Ala Val Leu Gly Phe Glu 115 120 125 Leu Met Ala Val Glu Glu Ala Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Arg Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Leu Ser Gly Cys Gly Gly 145 150 155 160 Gly Trp Thr Arg Glu Gln Glu Lys Ala Phe Glu Asn Ala Leu Ala Thr 165 170 175 Val Gly Asp Asp Glu Glu Glu Gly Asp Gly Leu Trp Glu Lys Leu Ala 180 185 190 Glu Ala Val Glu Gly Lys Thr Ala Asp Glu Val Arg Arg His Tyr Glu 195 200 205 Leu Leu Val Glu Asp Val Asp Gly Ile Glu Ala Gly Arg Val Pro Leu 210 215 220 Leu Val Ser Pro Ala Thr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Leu Arg Glu Val 225 230 235 240 Gly Arg Arg Gly Val Val Gly Glu Glu Val Glu Val Glu Gly Gly Met 245 250 255 Gly Arg Arg Gly Arg Leu Ser Pro Leu Ser Arg Ser Ala Gly Arg Gly 260 265 270 Ser Pro Gly Arg Arg Thr Ser Thr Gly Cys Ser Phe Leu Asp Leu Arg 275 280 285 Ser Thr Ala Lys Ala Thr Gly Gly Val Ser Gln Glu Thr Leu Trp Glu 290 295 300 Glu Gly Gly Trp Trp Gly Arg Arg Trp Arg Trp Arg Gly Ala Trp Gly 305 310 315 320 Glu Gly Val Gly <210> 18 <211> 1345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Type m3 <400> 18 atgtccgcgt ctgcatccgc tgtctgtctc cttcctcccc gaggaggaag cctggcccga 60 cccgacaccg cactcccccc agccagccag ccagccactg tcgcggtgaa ccaaaatatc 120 ccccgcctcg cctcgcctcg cctcgcggta acatccatca cactcctccc ccgccgcggc 180 cgccgctgcg cggtagatct cctcctcctc cacctccacc gtctcctgct cttcctctct 240 ctcttctcgg aggaaacccc caatttattc cttccccgca aacccgcagc cttcctaaaa 300 cgaattaaat ctccctccct tatccgccgc tgcaatccct ccccacaaaa tctcgctgcg 360 ccgcgcgctg ttttagggtt tgagctcatg gcggtggagg aggcgagcag cagcagtggc 420 ggcggtcgtg gtgggggtgg cggtgggggt ggggaggagg ggttgtccgg ttgcggcggt 480 gggtggacgc gcgagcagga gaaggcgttc gagaacgcgc tggcgacggt gggggatgac 540 gaggaggaag gggacgggtt gtgggagaag ctagcggagg ccgtggaggg gaagacggcc 600 gacgaggtga ggcggcacta cgagctgctg gtggaggacg tcgacggcat cgaggccggg 660 cgggtgccgc tcctggtgta acgccggcga cgggggcgtc gaggagggct ctgcgggagg 720 tgggaagaag gggggtggtg ggggaggagg tggaggtgga ggggggcatg gggagaaggg 780 gtcggctaag tcctctgagc aggagcgccg gaaggggatc gcctggacgg aggacgagca 840 caggctgttc cttcttggac ttgagaagta cggcaaaggc gactggagga gtatctcaag 900 aaactttgtg atctcaagga cacccaccca agtagctagt catgcacaga agtattttat 960 tcgcctgaac tcaatgaaca gagagaggcg gcgatcaagt atacatgaca taaccagcgt 1020 gaacaatgga gatacatctg ctgctcaggg gccaatcaca ggtcagccaa atggcccatc 1080 agcaaatcct ggaaaatcct ctaagcagtc tctacagcca gcaaatgcgc ctccaggcgt 1140 cgatgcttat ggtacgacaa ttggacagcc agttggtggt cctcttgtgt ccgcagttgg 1200 cactcctgtt acacttcctg ttcctgctgc acctcatata gcctatggca tgcatgcccc 1260 tgtccctgga gctgtagtcc ctggtgcccc agtaaacatg cctccaatgc cctaccccat 1320 gccgccacca acatctcatg gatga 1345 <210> 19 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Type m3 <400> 19 Met Ser Ala Ser Ala Ser Ala Val Cys Leu Leu Pro Pro Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ala Arg Pro Asp Thr Ala Leu Pro Pro Ala Ser Gln Pro Ala 20 25 30 Thr Val Ala Val Asn Gln Asn Ile Pro Arg Leu Ala Ser Pro Arg Leu 35 40 45 Ala Val Thr Ser Ile Thr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Arg Arg Cys Ala 50 55 60 Val Asp Leu Leu Leu Leu His Leu His Arg Leu Leu Leu Phe Leu Ser 65 70 75 80 Leu Phe Ser Glu Glu Thr Pro Asn Leu Phe Leu Pro Arg Lys Pro Ala 85 90 95 Ala Phe Leu Lys Arg Ile Lys Ser Pro Ser Leu Ile Arg Arg Cys Asn 100 105 110 Pro Ser Pro Gln Asn Leu Ala Ala Pro Arg Ala Val Leu Gly Phe Glu 115 120 125 Leu Met Ala Val Glu Glu Ala Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Arg Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Leu Ser Gly Cys Gly Gly 145 150 155 160 Gly Trp Thr Arg Glu Gln Glu Lys Ala Phe Glu Asn Ala Leu Ala Thr 165 170 175 Val Gly Asp Asp Glu Glu Glu Gly Asp Gly Leu Trp Glu Lys Leu Ala 180 185 190 Glu Ala Val Glu Gly Lys Thr Ala Asp Glu Val Arg Arg His Tyr Glu 195 200 205 Leu Leu Val Glu Asp Val Asp Gly Ile Glu Ala Gly Arg Val Pro Leu 210 215 220 Leu Val 225 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os01g34060-53F <400> 20 ggaccaggga ggacgacaag g 21 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os01g34060-393R <400> 21 gcagctcttg ccgccgtcg 19

Claims

MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인(MYB-type Helix-Turn-Helix DNA-binding domain)을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 OsMYB1 유전자를 특이적으로 인식하는, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 식물체 유전자 편집 유도용 가이드 RNA.
제 1항에 있어서,
상기 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제를 벼 유래 OsMYB1 유전자의 표적 위치에 가이드하여 변이를 유도하는 것인, 가이드 RNA.
제1항에 있어서,
OsMYB1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 가이드 RNA.
MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인(MYB-type Helix-Turn-Helix DNA-binding domain)을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 OsMYB1 유전자를 특이적으로 인식하는 가이드 RNA를 코딩하는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 핵산 서열 및 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 편집용 벡터.
제 1항의 가이드 RNA 또는 제 4항의 벡터를 포함하는 OsMYB1 유전자 편집용 조성물.
제 4항의 벡터 또는 제 5항의 조성물로 형질전환된 형질전환 식물체.
제 6항에 있어서,
상기 형질전환 식물체는 야생형과 비교하여 증대된 종자 발아율을 나타내는 것인, 식물체.
종자 발아율을 증대시키는 활성을 나타내는 변형된 OsMYB1 단백질을 발현하는, 형질전환된 벼.
제8항에 있어서,
상기 변형된 OsMYB1 단백질은 서열번호 14, 16 및 18 중에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 갖는 유전자로부터 발현되는 것인, 형질전환된 벼.
제6항에 있어서,
상기 식물체는 벼(Orizaya satvia)인 것인, 형질전환 식물체.
제 6항에 따른 형질전환 식물체 또는 그 자손 식물체로부터 수득한 형질전환된 종자.
MYB 타입 HTH DNA 결합 도메인(MYB-type Helix-Turn-Helix DNA-binding domain)을 포함하는 OsMYB1 단백질을 코딩하는 OsMYB1 유전자를 특이적으로 인식하는 가이드 RNA를 코딩하는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 핵산 서열 및 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 OsMYB1 유전자의 유전자 편집용 벡터를 준비하는 단계; 및
상기 벡터를 식물체에 형질도입하여 OsMYB1 유전자의 표적서열에 변이를 유도하는 단계를 포함하는,
형질전환 식물체의 제조방법.
제12항의 제조방법에 의해 제조된 형질전환 식물체로서, 야생형 대비 종자 발아율이 증대된 것을 특징으로 하는 벼인, 형질전환 식물체.