KR102113500B1 - Soc1 유전자를 교정하여 만추성 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배추 유래 SOC1(Supperssor of overexpression of constans 1) 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

Description

SOC1 유전자를 교정하여 만추성 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing genome-edited Brassica rapa plant having late flowering trait by SOC1 gene editing and the plant thereof}

본 발명은 SOC1 유전자를 교정하여 만추성 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것이다.

배추는 번식을 위해 씨앗이 물을 흡수하면서부터 저온에 감응한 후 꽃봉오리를 형성하는 종자춘화형(seed vernalization type) 작물로서, 품종에 따라 평균기온 13℃ 이하에서 7~10일 정도 경과하면 생장점이 화아(flower bud)를 형성하게 되며, 그 후 온도가 높아지거나 낮 길이가 길어지면 추대장이 급속히 길어지고 꽃이 피게 된다. 이러한 현상은 배추의 고유 생태특성이므로 생리장애라고 할 수 없으나, 화아분화가 되면 영양생장은 거의 멈추게 되고 생식생장으로 전환되어 고온장일에 의해 꽃이 피고 종자를 맺게 되므로, 경엽이용 목적의 재배적 측면에서는 불리하게 작용한다. 배추의 경우 조기추대에 의해 잎 수가 증가하지 못하게 되고, 그로 인해 잎 수가 부족하게 되면 불결구(不結球) 상태가 되어 상품성이 떨어지며, 수량이 감소하는 피해를 받게 된다. 특히, 봄배추와 겨울배추는 저온에 노출될 가능성이 높으므로, 생산성 증가를 위해 만추특성이 반드시 필요하다.

화아분화 및 추대를 방지하기 위해서는 추대가 늦은 만추대성 품종을 선택하여 재배하여야 하며, 하우스, 터널, 봄 노지, 여름 고랭지 재배 시에 저온에 처하지 않도록 가온 및 보온에 주의하여 관리한다. 또 작형에 적합한 파종시기와 정식시기를 지켜 재배하여 저온에 노출되지 않도록 한다.

현재까지 모델식물인 애기장대에서는 약 80개의 개화시기 조절 관련 유전자가 규명되었고, 이들 유전자들에 의한 4가지 개화조절 경로가 밝혀졌다. 첫 번째는 낮의 길이(일장)를 감지하여 개화를 조절하는 광주기 의존 경로(photoperiodic pathway)이다. 이는 하루의 시간을 인식하고 낮과 밤에 따라(일주기성), 혹은 1년의 시간을 인식하고 낮의 길이와 밤의 길이 변화를 감지하여 계절의 변화에 따라(광주기성) 개화를 조절한다. 광주기성에 의해 낮의 길이가 길어야 꽃을 피우는 장일식물과 밤의 길이가 길어야 꽃을 피우는 단일식물로 나뉠 수 있다. 식물의 빛에 대한 반응은 적색광을 흡수하는 파이토크롬 또는 청색광을 흡수하는 크립토크롬(cryptochrome)과 같은 광수용체 단백질을 통해 낮과 밤의 빛의 변화를 감지함으로써 일주 혹은 일장의 변화를 인지함으로써 개화시기를 결정한다. 두 번째는 온도에 의한 개화조절 경로(vernalization pathway)로써 장시간 저온에 노출될 때 개화가 촉진된다. 실생활에서 봄 또는 여름 식물들이 장시간 겨울의 추위에 노출된 후 봄 또는 여름에 꽃을 피우고 씨앗을 맺는 것이 저온에 의해 개화기작의 활성화 때문이다. 세 번째는 앞선 일장과 온도 등의 외부 환경 요인이 아닌 식물 일생사에 프로그래밍화된 자발적 경로(autonomous pathway)에 의해 개화가 조절된다. 자발적 경로에 의한 개화는 식물의 발달 상황에 의해 성숙 혹은 노화(aging)에 맞추어 유전적 네트워크에 의해 추진된다. 네 번째 개화 조절 경로는 식물 호르몬 중 하나인 지베렐린(gibberellin) 생합성과 신호전달에 의해 이루어지는 경로가 있다. 개화를 위한 이러한 4가지의 경로는 독립적인 신호체계를 갖고 있으며 각각의 경로에 반응하는 독립적인 신호인자들이 포함되어 있다. 그러나 이들 4가지 경로와 그들의 유전자들은 마지막에 하나의 경로와 인자들로 통합되어 결국에 꽃과 소기관의 형태형성을 결정하게 된다.

개화시기 조절을 위한 4가지 경로가 통합되는 지점에 SOC1(Supperssor of overexpression of constans 1) 인자가 존재한다. SOC1은 MADS box 도메인을 암호화하는 전사인자로써 일장, 온도, 호르몬, 노화 등으로부터 유도된 개화신호를 통합하고 개화촉진과 저해인자들의 활성을 적절히 조절하는 역할을 한다. 또한 꽃분열조직의 유지와 소기관의 형성을 이끄는 유전자의 활성화를 유도하는 역할을 수행하기 때문에 다른 개화시기 조절인자와 구별된 역할을 수행할 수 있다고 추정되고 있다.

CRISPR/Cas9 시스템은 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 유전자 가위라 불리는 게놈(유전체) 편집 방법으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA(guide RNA)와 특정한 염기서열을 자르는 가위 역할인 Cas9(CRISPR associated protein 9) 엔도뉴클레아제 효소로 구성된다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하면 세포나 동물에 플라스미드 DNA를 도입하여 특정 유전자의 기능을 억제할 수 있는 녹-아웃(knock-out)이 가능하다.

한편, 한국등록특허 제1548052호에는 '식물의 개화조절인자인 CmSOC1 신규 유전자 및 이를 이용한 식물의 개화시기 조절 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0070463호에는 'ELF9 유전자를 이용하여 식물체의 조기 개화와 mRNA 안정성에 변화를 유도하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 'SOC1 유전자를 교정하여 만추성 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 배추에 만추 특성을 도입하기 위해서, 개화촉진 유전자로 알려진 SOC1(Supperssor of overexpression of constans 1) 유전자를 타겟으로 유전자 가위 시스템을 식물세포에 도입한 결과, 3개의 배추 SOC1 유전자(Bra000393, Bra004928 및 Bra039324)에서 삽입 또는 결실 변이가 발생하여 정상적인 SOC1 단백질이 생성되지 않음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 유전체가 교정된 식물체의 종자를 토양에 파종하고 추대 시기를 확인한 결과, 유전체를 교정하지 않은 대조구에 비해 SOC1 유전자가 교정된 식물체는 개화시기가 현저히 지연되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 배추 유래 SOC1(Supperssor of overexpression of constans 1) 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체 및 상기 식물체의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 배추 유래 SOC1 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 배추 식물체의 추대를 지연시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 상기 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체를 교배모본으로 하여 도입하고자 하는 웅성 가임 배추와 교배하는 단계를 포함하는, 추대가 지연된 형질을 가지는 배추 계통의 잡종 종자를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 유전체 교정 식물체의 제조방법은 외부 유전자가 삽입되어 있지 않고 자연적 변이와 구별할 수 없는 작은 변이만 가지고 있어, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 기존 육종법은 방사능 또는 화학물질을 사용하여 식물 종자에 무작위적인 유전자 변이를 일으킨 후 우연히 만들어진 우수 종자를 골라내는 방식인 반면, 크리스퍼 유전자 가위는 유전자를 정해놓고 변이를 도입하는 방식이므로, 농작물 육종 기술의 생산성을 크게 높일 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 만추성 배추 식물체는 개화조절을 통해 상품의 가치 향상과 더불어 생산량의 증대를 기대할 수 있다.

도 1은 배추 SOC1 유전자(Bra000393, Bra004928 및 Bra039324)에서 본 발명의 유전자 가위가 표적하는 위치(유전자 교정의 위치)를 나타낸다. 검은색 상자: 엑손, 실선; 인트론.
도 2는 sgRNA 서열을 포함하는 재조합 벡터가 도입된 식물체의 모습을 보여주는 사진으로, (A)는 배양 7주 후의 캘러스 형성 모습을, (B)는 배양 10주 후의 신초 형성 모습을, (C)는 (B)의 신초형성을 확대한 모습을, (D)는 신초를 뿌리유도배지로 옮겨 신장 및 뿌리 생성을 유도한 후의 모습을 보여준다.
도 3은 유전자가 교정된 식물체에서 분석한 SOC1 유전자(Bra000393)의 서열 분석 결과로, (A)는 염기서열 분석 결과이고, (B)는 아미노산 서열 분석 결과이다. WT; CR-강토 2호친.
도 4는 유전자가 교정된 식물체에서 분석한 SOC1 유전자(Bra004928)의 서열 분석 결과로, (A)는 염기서열 분석 결과이고, (B)는 아미노산 서열 분석 결과이다. WT; CR-강토 2호친.
도 5는 유전자가 교정된 식물체에서 분석한 SOC1 유전자(Bra039324)의 서열 분석 결과로, (A)는 염기서열 분석 결과이고, (B)는 아미노산 서열 분석 결과이다. WT; CR-강토 2호친.
도 6은 유전자 교정을 하지 않은 대조구와 SOC1 유전자 교정 식물체의 개화 시기를 비교한 결과로, 저온 처리 후 25℃ 배양실로 옮긴 후 34일째의 모습을 보여주는 사진이다. 대조구; CR-강토 2호친.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 배추 유래 SOC1(Supperssor of overexpression of constans 1) 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법을 제공한다.

용어 '유전체/유전자 교정(genome/gene editing)'은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다.

용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미한다. 즉, 원칙적으로 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩(non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법에 있어서, 표적 유전자는 배추 유래 SOC1(Supperssor of overexpression of constans 1) 유전자일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 Bra000393 유전자, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 Bra004928 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 Bra039324 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA는 배추의 SOC1 유전자 중에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 '가이드 RNA(guide RNA)'는 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 서열과 전부 또는 일부 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 서열로 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다.

상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 가이드 RNA는 바람직하게는, 단일 가닥 가이드 RNA 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 그 유래 미생물 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다.

또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것 또는 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9(CRISPR associated protein 9), Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 예컨대 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 DNA의 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기 쌍 사이를 추정하여 절단한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동한다.

본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 삽입하고 이를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 발현 시스템을 포함하는 모든 플라스미드일 수 있다. 상기 플라스미드는 목적 유전자 발현을 위한 요소(elements)를 포함하는 것으로, 복제원점(replication origin), 프로모터, 작동 유전자(operator), 전사 종결 서열(terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 임의로 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위(ribosome binding site; RBS) 및/또는 전사 조절 인자 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체 및 상기 식물체의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체는 개화와 관련된 주요 유전자인 SOC1 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 것으로, 배추 SOC1 유전자인 Bra000393, Bra004928 및 Bra039324 유전자가 녹-아웃된 유전체 교정 식물체이다.

본 발명은 또한, 배추 유래 SOC1(Supperssor of overexpression of constans 1) 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 배추 식물체의 추대를 지연시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다. 본 발명의 유전체 교정용 조성물은, 표적 유전자의 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하고 있어, 상기 조성물을 배추 식물체에 처리할 경우, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체가 RNA 유전자 가위로 작동하여 표적 유전자를 교정할 수 있다.

본 발명의 유전체 교정용 조성물은 바람직하게는 배추 SOC1 유전자(Bra000393, Bra004928 및 Bra039324)의 표적 DNA(서열번호 1)에 특이적인 가이드 RNA와 Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질을 포함하고 있어, 상기 SOC1 유전자를 녹-아웃시킬 수 있고, SOC1 유전자의 녹-아웃을 통해 식물체의 추대를 지연시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체를 교배모본으로 하여 도입하고자 하는 웅성 가임 배추와 교배하는 단계를 포함하는, 추대가 지연된 형질을 가지는 배추 계통의 잡종 종자를 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 추대가 지연된 형질을 가지는 배추 계통의 잡종 종자를 제공한다.

본 발명의 웅성 가임 배추는 정상적인 자연 교배가 가능한 배추를 의미한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 유전자 가위의 표적 서열 디자인

유전자 가위의 표적 서열은 Cas-Designer(http://www.rgenome.net/cas-designer/)를 이용하였다. 배추 SOC1 유전자 중 Bra000393, Bra004928 및 Bra039324 서열을 비교하여 서열이 일치하는 부분을 조사하였다. 그 후 해당 부분에서 sgRNA(single guide RNA)를 디자인하여 하나의 sgRNA로 세 개의 SOC1 유전자를 표적하도록 하였다.

2. 벡터제작

디자인된 sgRNA에 제한효소 서열을 포함하여 올리고(oligo) 서열을 합성하여 배추 SOC1 유전자를 표적할 수 있는 sgRNA를 확보하였다. 제한효소 AarI(CACCTGC(4/8)^)을 처리한 pHAtC 벡터(Kim H. et al., 2016, J Integr Plant Biol. 58(8):705-12)에 합성된 sgRNA를 넣어 클로닝하였고 재조합된 벡터는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주에 형질전환하여 이 후 배추 식물체 형질전환에 이용하였다.

3. 식물체 형질전환

'CR-강토 2호친'(농협종묘, 한국)의 종자를 70% 에탄올에서 1분 및 2% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)에서 7분간 표면 살균 및 소독한 후 멸균수로 3회 세척한 후, 4℃에서 하루동안 증류수에 침지하였다. 이후 MS 기본 배지에 치상하고 3~4일간 암배양하였다. 명배양 조건으로 이동시킨 후 1~2일간 배양한 배축(hypocotyledonary axis)을 사용하였다. 배축은 0.5~1cm 잘라 절편체로 사용하였으며, 아그로박테리움 튜메파시엔스 배양액(OD_600nm=0.5)에 20분간 침지 후 2일간 암상태로 공동배양하였다.

4. 조직배양

아그로박테리움과 공동배양 후 캘러스 유도배지(MS 염(salts) + 3% 수크로스 + 5㎎/ℓ 벤질아데닌(BA) + 1㎎/ℓ 1-나프탈렌아세트산(NAA) + 300㎎/ℓ 세포탁심(cefotaxime) + 10㎎/ℓ 하이그로마이신)에 치상하여 암배양에서 3주간 캘러스를 유도하였다. 3주 후, 유도된 캘러스를 신초유도배지(MS 염 + 3% 수크로스 + 10㎎/ℓ BA + 0.1㎎/ℓ NAA + 300㎎/ℓ 세포탁심 + 10㎎/ℓ 하이그로마이신)로 옮기고 4주 마다 동일한 배지에 계대배양하여 신초를 유도하였다. 신초가 유도되면 뿌리유도배지(MS 염 + 3% 수크로스 + 0.1㎎/ℓ NAA + 0.1㎎/ℓ 지베렐린(GA₃))에 치상하여 4주 동안 신장 및 뿌리유도를 하였다.

5. 유전체 교정 식물체의 DNA 분석

아그로박테리움을 이용한 형질도입을 통해 확보한 유전체 교정 식물체의 DNA를 추출하고 항생제 선발마커로 분석을 진행하여 재조합 벡터가 삽입된 식물체만을 선발하였다. 추출한 DNA와 Bra000393_Forward(5'-CCCAAAGGAAGATTGTATAA-3', 서열번호 5) 및 Bra000393_Reverse(5'-ACCCTCCCTCTAAGCAAACG-3', 서열번호 6)의 프라이머 세트, Bra004928_Forward(5'-AGGTCGTTTTATGTGTATGAC-3', 서열번호 7) 및 Bra004928_Reverse(5'-ACTCACTTTACAGTTAACAC-3', 서열번호 8)의 프라이머 세트, Bra039324_Forward(5'-GTTCTCTGCAAGTTAAAAAG-3', 서열번호 9) 및 Bra039324_Reverse(5'-TGTATAAACCAAGACATACT-3', 서열번호 10)의 프라이머 세트를 이용하여 표적 유전자(Bra000393, Bra004928 및 Bra039324)를 PCR하고, PCR 산물은 정제해 외부업체((주)엘에이에스, 한국)에 분석의뢰하여 NGS 분석을 진행하였다. 그 결과를 대조구 식물체(CR-강토 2호친)와 비교하여 SOC1 유전자의 돌연변이를 확인하였다.

실시예 1. SOC1 유전자 교정 배추 식물체의 서열 분석

CRISPR/Cas9 유전자 가위를 이용하여 SOC1 유전자를 교정한 식물체와 실험 재료로 사용되었던 'CR-강토 2호친' 배추의 Bra000393, Bra004928 및 Bra039324 유전자 서열을 분석하였다.

그 결과, Bra000393 유전자의 경우, 유전체 교정 식물체에서 가이드 RNA의 표적이 된 DNA 서열에 2bp 결실(variant1) 또는 1bp 삽입(variant 2) 돌연변이가 발생한 것을 확인할 수 있었으며, 상기 두 종류의 변이 서열로부터 각각 아미노산 서열을 예측해 보았을 때, 2bp 결실(variant1) 돌연변이의 경우 해독틀 이동(frame shift)이 발생한 것을 알 수 있었으며, 1bp 삽입(variant 2) 돌연변이의 경우 Bra000393 유전자의 중간에 종결코돈이 생성되어 정상적인 SOC1 단백질이 생성되지 않음을 알 수 있었다(도 3).

또한, Bra004928 및 Bra039324 유전자의 경우, 유전체 교정 식물체에서 가이드 RNA의 표적이 된 DNA 서열에 1bp 삽입 돌연변이가 발생한 것을 확인할 수 있었으며, 해당 서열로부터 아미노산 서열을 예측해 보았을때, 상기 1bp 삽입으로 인해 Bra004928 유전자의 중간에 종결코돈이 발생한 것을 알 수 있었다(도 4 및 도 5).

도 3 내지 도 5의 표 내 % 수치는 시퀀싱 분석을 통해 유전체 변이가 일어난 수를 나타낸 것으로, 이상적으로는 100%가 전부 변이가 일어나야 하지만 알지 못하는 이유로 100% 보다 낮게 변이가 발생하는 것을 알 수 있었다. 그러나, 다음세대에서는 변이가 제대로 전달된 개체만 선발할 것이기 때문에 변이 %는 증가할 것으로 예측되었다. 또한 두 가지 이상의 변이가 발견되는 경우에도 다음 세대로 넘어가면서 한가지 종류만 전달될 것이므로 다음세대에서는 한가지 종류의 변이만 발견될 것으로 예상되었다.

이와 같은 결과를 통해, CRISPR/Cas9 유전자 가위를 이용하여 SOC1 유전자를 교정한 배추 식물체는 SOC1 단백질의 정상적인 기능이 억제되어, 개화시기가 늦춰진 만추성 형질을 가질 것으로 기대되었다.

실시예 2. 유전체 교정 식물체의 만추성 형질 분석

유전체 교정을 실시한 배추를 교배하여 종자를 얻었고, 상기 배추 종자(총 20립)를 흙으로 채워진 포트에 파종하여 5일간 발아시켰다. 발아된 배추가 식재된 포트를 4℃ 저온실로 옮겨 37일간 저온처리하였다. 그 후, 다시 25℃ 배양실로 옮겨 개화할 때까지 재배하였다. 대조구는 실험 재료로 사용되었던 'CR-강토 2호친'의 종자를 사용하였다.

그 결과, 대조구는 저온처리 후 25℃ 배양실로 옮긴지 평균 17일만에 개화하는 것으로 확인되었으나, SOC1 유전자를 교정한 식물체는 배양실로 옮긴지 34일이 지나도 개화하지 않는 것을 관찰할 수 있었다(도 6). 이를 통해, 본 발명의 SOC1 유전자를 교정한 식물체는 추대가 지연되는 특성을 보유하게 되었음을 알 수 있었다.

<110> NONG WOO BIO CO., LTD NH Seed Co., Ltd. <120> Method for producing genome-edited Brassica rapa plant having late flowering trait by SOC1 gene editing and the plant thereof <130> PN18050 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 tctgatcatc ttctctccta agg 23 <210> 2 <211> 642 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 2 atggtgaggg gaaaaactca gatgaagcga atagagaatg caacaagcag acaagtcact 60 ttctctaaac gaaggaatgg tttgttgaag aaagcttttg agctctcagt gctttgtgat 120 gctgaagttt ctctgatcat cttctctcct aagggaaaac tttatgagtt cgccagctcc 180 aatatgcaag ataccgtaga tcgttatctg aggcacacca aggatcgagt cagcagcaaa 240 ccggtttcgg aagaaaatat gcagcatttc aaacatgaag cagcaaacat gatgaagaaa 300 attgaacaac ttgaagcgtc caaacgtaaa ctcttgggag aaggcattgg atcatgctcg 360 attgaggagc tgcagcaaat tgagcaacaa ctcgagaaaa gtgtcaaatg tgttagagca 420 agaaagactc aagtgtttaa ggaacaaatt gtgcagctca agcagaagga gaaagctcta 480 gctgcagaaa acgagaaact cgctgaaaag tggggatctc atgaaatcga agtttggtcg 540 aataagaacc aagaaagtgg acgaggtgac gaggacagta gcccaagttc tgaagtagag 600 acacaattgt tcattgggtt accttgttct tcaagaaagt ga 642 <210> 3 <211> 642 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 3 atggtgaggg ggaaaactca gatgaagcga atagagaatg caacaagcag acaagtgact 60 ttctctaagc gaaggaatgg tttgctgaaa aaagcctttg agctctcagt tctttgtgat 120 gctgaagttt ctctgatcat cttctctcct aaggcaaaac tttatgaatt tgccagctcc 180 aatatgcaag ataccataga tcgttatctg aggcatacca aggatcgtgt cagcaccaaa 240 cctgtttctg aagaaaattt gcagcatttg aaacatgaag cagcaaacat gatgaagaaa 300 attgaacaac ttgaagcttc caaacgtaaa ctcttgggag aaggcatagg atcatgttcg 360 atagaggagc tgcagcaaat tgagcaacaa cttgagaaaa gtgtcaaatg tatccgagca 420 agaaagactc aagtgtttaa ggaacaaatt gagcagctca agcaaaagga gaaagctcta 480 gctgcagaaa acaagaagct cactgaaaag tggggatctc atgaaatcga agtctggtcg 540 aataagaacc aagaaagtgg aaaaggtgac gaagagagta gcccaagttc tgaagtagag 600 acagagttgt tcattgggtt accttgttct tcaagaaagt ga 642 <210> 4 <211> 642 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 4 atggtgaggg gaaaaactca gatgaagagg atagagaatg caacaagcag acaagtgact 60 ttctctaaac gcaggaatgg tttgttgaag aaagcctttg agctctcagt gctttgtgat 120 gcggaagttt ctctgatcat cttctctcct aagggaaaac tttatgaatt cgccagctcc 180 aatatgcaag ataccataga tcgttatctg acgcatacca aggatcgaat cagcaacaaa 240 ccggtttctg aagaaaatat gcagcatttg aaacatgaag cagcaaacat gatgaagaaa 300 attgaacaac ttgaagcttc caaacgtaaa ctcttgggag aaggcatagg atcatgctcg 360 attgaggagc tgcagcaaat tgagacccaa cttgagaaaa gtgtcaaatg cattcgagca 420 agaaagactc aactgtttaa ggaacaaatt gagcagctca agcaaaagga gaaagctcta 480 gctgcagaaa accagaagct cactgaaaag tggggatctc atgaaatcaa agtttggtcg 540 agcaagaaca aagaaagtgg aagaggtgac gaagagagta gtccaagttc cgaagtagag 600 acagaattgt tcattgggtt gccttcttct tcaagaaagt ga 642 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cccaaaggaa gattgtataa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 accctccctc taagcaaacg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aggtcgtttt atgtgtatga c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 actcacttta cagttaacac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gttctctgca agttaaaaag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgtataaacc aagacatact 20

Claims (5)

1. 배추 유래 SOC1(Supperssor of overexpression of constans 1) 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
   상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법으로서,
   상기 배추 유래 SOC1 유전자는 서열번호 2 내지 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 제조방법.
2. 제1항의 방법에 의해 제조된 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체.
3. 제2항에 따른 식물체의 유전체가 교정된 종자.
4. 배추 유래 SOC1(Supperssor of overexpression of constans 1) 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 배추 식물체의 추대를 지연시키기 위한 유전체 교정용 조성물로서,
   상기 배추 유래 SOC1 유전자는 서열번호 2 내지 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제2항의 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체를 교배모본으로 하여 도입하고자 하는 웅성 가임 배추와 교배하는 단계를 포함하는, 추대가 지연된 형질을 가지는 배추 계통의 잡종 종자를 생산하는 방법.

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